Thermo Fisher Scientific PrioCHECK FMDV type O serum cattle sheep goat pig 7610430 ES Guía del usuario

Marca: Thermo Fisher Scientific

Modelo: PrioCHECK FMDV type O serum cattle sheep goat pig 7610430 ES

Tipo: Guía del usuario

PrioCHECK® FMDV type O

ELISA para detección in vitro de anticuerpos contra el virus de la fiebre aftosa serotipo O en suero de bovinos, ovinos,

caprinos y porcinos

2 placas para 176 muestras

©Prionics AG

Versión 1.1_es

Sólo para diagnóstico in vitro en uso veterinario

Conservar a 5±3°C

Nº de producto 7610430

Introducción

La fiebre aftosa (FMDV) es la enfermedad más impor-

tante desde el punto de vista económico en todo el

mundo. Esta enfermedad altamente contagiosa afecta

principalmente a los animales biungulados (mamíferos

herbívoros dotados de pezuñas) y posee distribución

mundial.

El ensayo estándar internacional para la detección de

anticuerpos es la prueba de neutralización del virus

(manual de la OIE), pero este ensayo es muy laborio-

so y debe realizarse en un laboratorio de alta seguri-

dad. Por lo tanto, se han desarrollado diferentes

ensayos de ELISA. Sin embargo, la mayoría de las

pruebas ELISA usan sueros policlonales, detectan

anticuerpos de una sola especie y requieren mucho

tiempo, lo cual dificulta su idoneidad para el análisis

masivo y la reproducibilidad. PrioCHECK® FMDV tipo

O, se basa en anticuerpos monoclonales (MAB) y es

aplicable para la detección de anticuerpos específicos

contra FMDV serotipo O en ganado vacuno, porcino,

caprino y ovino. El ensayo está diseñado para reali-

zarse un mínimo de pasos de reacción que permita el

análisis masivo y es idóneo para robots automatizados

de ELISA.

Principio del ensayo

La tira PrioCHECK® FMDV tipo O es un ensayo ELISA

bloqueante y detecta anticuerpos (Ab) contra el virus

de la fiebre aftosa serotipo O. La reacción entre el

antígeno tipo O del FMDV y un anticuerpo monoclonal

específico (Mab) se bloquea a través de anticuerpos

específicos que estén presentes en la muestra del

ensayo.

Se recubre una placa de microtitulación tipo tira con

antígenos tipo O del FMDV no infecciosos. Se agrega

a los pocillos el tampón y el suero sin diluir. Se incuba

la placa a temperatura ambiente (22±3°C). Después

de los lavados se agrega el conjugado Mab-HRPO a

la placa y se vuelve a incubar a 22±3°C. Se lava la

placa y se agrega la solución de sustrato cromógeno

(TMB). Después, se detiene el desarrollo de color

añadiendo la solución de frenado y se mide la densi-

dad óptica (DO) a 450 nm.

Componentes del kit

Conserve el kit refrigerado (5±3°C) hasta la fecha de

vencimiento. Consulte la etiqueta del kit para ver la

fecha de caducidad real. La vida útil de los componen-

tes diluidos, abiertos o reconstituidos aparece a

continuación, cuando corresponda. Tiene a su dispo-

sición los datos relativos a los riesgos químicos en la

sección "Normas de seguridad y declaraciones de

I+S" (Apéndice II).

Componente 1

Placa del ensayo

Dos placas de ensayo tipo tira.

Componente 2

Conjugado (30x)

(Concentrado 30x, diluir antes de usar)

Un vial con 2,5 ml de conjugado.

El conjugado diluido es inestable, prepárelo inmedia-

tamente antes de usar.

Componente 3

Tampón de dilución (5x)

(Concentrado 5X, diluir antes de usar)

Un vial contiene 60 ml de tampón de dilución.

Vida útil de la solución de trabajo de buffer diluyente:

4 horas a temperatura ambiente (22±3°C).

Componente 4

Suero de caballo (liofilizado)

(Reconstituir y diluir antes de usar)

Dos viales con 3,5 ml de suero de caballo.

El suero equino reconstituido conservado a -20°C

puede utilizarse hasta su fecha de vencimiento.

Componente 5

Agua desmineralizada

Un vial con 10 ml de agua desmineralizada.

Componente 6

Líquido de lavado (200X)

(Concentrado 200X, diluir antes de usar). Un vial

contiene 60 ml de líquido de lavado.

Vida útil de la solución de lavado: una semana a

temperatura ambiente 22±3°C.

Componente 7

Suero de referencia 1 (listo para usar)

Un vial con 0,5 ml de suero de referencia 1.

Componente 8

Suero de referencia 2 (listo para usar)

Un vial con 0,5 ml de suero de referencia 2.

Componente 9

Suero de referencia 3 (listo para usar)

Un vial con 0,5 ml de suero de referencia 3.

Componenete 10

Suero de referencia 4 (listo para usar)

Un vial con 0,5 ml de suero de referencia 4.

Componente 11

Sustrato cromógeno (TMB) (listo para usar)

Un vial con 60 ml de sustrato cromógeno (TMB).

Componente 12

Solución de frenado (listo para usar)

Un vial contiene 60 ml de tampón de solución de

frenado.

Contenido adicional del kit:

- Instrucciones de uso

- 1 Tapa para cubrir las tiras durante la incubación

- Certificado de análisis

Material necesario adicional

General:

Equipo de laboratorio según las normas de seguridad

nacionales.

Análisis de los resultados:

Lector de placas, p. ej., Multiscan EX o equivalente.

El lector tiene que tener un filtro apropiado para leer

placas a 450 nm.

Opcional:

Lavador de placas p. ej., Tecan EIA Tray

Washer o equivalente.

Procedimiento del ensayo

Precauciones

Debe ceñirse estrictamente a las directrices naciona-

les para el trabajo con muestras animales. La tira

PrioCHECK® FMDV tipo O debe usarse en laborato-

rios adecuados para este propósito.

Las muestras deben ser consideradas como poten-

cialmente infeccionas y todos los objetos que entren

en contacto con las muestras como potencialmente

contaminados.

Tiene a su disposición los datos relativos a los riesgos

químicos en la sección "Normas de seguridad y

declaraciones de I+S" (Apéndice II).

Notas

Para lograr unos resultados óptimos con la tira Prio-

CHECK® FMDV tipo O, debe tener en cuenta los

siguientes aspectos:

 Hay que seguir estrictamente el protocolo del

ensayo.

 Todos los reactivos del kit deben equilibrarse a

temperatura ambiente 22±3°C antes de usarse.

 Se deben cambiar las puntas de las pipetas tras

cada pipeteo.

 Hay que usar recipientes independientes para

cada reactivo.

 Los componentes del kit no deben ser utilizados

tras la fecha de caducidad o si se observan

cambios en su aspecto.

 No deben utilizarse juntos componentes de kits

con números de lote diferentes.

 Se debe usar agua desmineralizada para el

ensayo.

SOLUCIONES QUE DEBE TENER PREFRENADOS

Tampón de dilución; solución de trabajo

Diluya 5 veces el tampón de dilución (Componente 3)

concentrado en agua desmineralizada. (1 volumen de

tampón concentrado + 4 volúmenes de agua desmine-

ralizada). Puede conservarse a 22±3°C hasta 4 horas.

Suero de caballo

Equilibre el vial a 22±3°C y reconstituya 1 el suero de

caballo (Componente 4) con 3.5 ml el agua desmine-

ralizada (Componente 5). El suero equino reconstitui-

do puede mantenerse a -20°C hasta su fecha de

vencimiento.

Tampón de ELISA

A Agregue suero equino reconstituido al tampón de

dilución hasta una concentración final del 5 % (v/v); ej:

para 2 tiras prepare 3.5 ml (3.325 ml de tampón de

dilución-solución de trabajo + 175 µ de suero equino

reconstituido). Este tampón de ELISA se puede

conservar hasta 4 horas a temperatura ambiente

(22±3°C).

Dilución del Conjugado

Diluya el conjugado (30x) (Componente 2) 1/30 in

tampón de ELISA recién preparado; ej. para 2 tiras

prepare 1.8 ml (1.74 ml de tampón de ELISA + 60 µl

de conjugado 30x).

Nota: La dilución del conjugado debe hacerse

inmediatamente antes de usar.

1 La reconstitución de suero de caballo liofilizado debe hacerse

del siguiente modo:

- Equilibre el vial a 22±3°C.

- Con el vial en posición vertical, dé suavemente unos golpecitos contra

la mesa para asegurarse de que el contenido esté en el fondo del vial.

- Abra con cuidado el vial.

- Agregue la cantidad específica de agua desmineralizada (Componen-

te 5).

- Cambie el tapón del vial y deje que el material liofilizado se disuelva.

- Agite suavemente de modo que el material que siga seco se disuelva.

- Deje en reposo el material al menos durante 15 minutos a 22±3°C

antes de usar.

- Invierta con cuidado el vial de modo intermitente (debe evitar la

formación de espuma).

Instrucciones de uso

PrioCHECK

FMDV type O

Líquido de lavado

Diluya el líquido de lavado concentrado (200x) (Com-

ponente 6) en agua desmineralizada. La cantidad de

líquido de lavado concentrado es suficiente para

preparar un volumen final de 12 litros.

Estabilidad del líquido de lavado, solución de trabajo:

1 semana a 22±3°C.

Nota: Se pueden usar lavadores ELISA comerciales. Si no

tiene uno a su disposición, puede lavar las placas agregando

200 µl de líquido de lavado a todos los pocillos de las placas.

Después, vacíe las placas y repita el proceso las veces nece-

sarias. No es necesario remojar las placas entre cada lavado.

Seque bien las placas (invertidas sobre papel absorbente)

después del último lavado.

INCUBACIÓN DEL SUERO DEL ENSAYO

1.1 Agregue 90 µl de tampón de ELISA a todos los

pocillos (Componente 1).

1.2 Agregue 10 µl de suero de referencia 1 (Com-

ponente 7) a los pocillos A1 y B1.

1.3 Agregue 10 µl de suero de referencia 2 (Com-

ponente 8) a los pocillos C1 y D1.

1.4 Agregue 10 µl de suero de referencia 3 (Com-

ponente 9) a los pocillos E1 y F1.

1.5 Agregue 10 µl de suero de referencia 4 (Com-

ponente 10) a los pocillos G1 y H1.

1.6 Agregue 10 µl de muestra al resto de pocillos.

1.7 Tape la placa y agite con cuidado.

1.8 Incube 60±5 minutos a 22±3°C.

1.9 Vacíe las tiras después del periodo de incuba-

ción y lave las tiras 6 veces con 200 a 300 µl

de líquido de lavado por pocillo. Seque bien las

placas después del último lavado.

INCUBACIÓN CON EL CONJUGADO

2.1 Agregue 100 µl de dilución del conjugado a cada

pocillo.

2.2 Tape la placa y agite con cuidado.

2.3 Incube 60±5 minutos a 22±3°C.

INCUBACIÓN CON LA SOLUCIÓN DE SUSTRATO

CROMÓGENO (TMB)

3.1. Vacíe las placas del ensayo después del periodo

de incubación y lávelas 6 veces colocando 200-

300 µl de líquido de lavado en cada pocillo Se-

que bien las placas después del último lavado.

3.2. Agregue 100 µl de la solución de sustrato

cromógeno (TMB) (Componente 11) a cada po-

cillo.

3.3. Incube 15 minutos a 22±3°C.

3.4. Agregue 100 µl de solución de frenado (Compo-

nente 12).

3.5. Mezcle el contenido de los pocillos de las placas

del ensayo.

Nota: Inicie la adición de solución de frenado 15 minutos

después de haber llenado el primer pocillo con la solución de

sustrato cromógeno (TMB). Agregue la solución de frenado en

el mismo orden y al mismo ritmo que la solución de sustrato

cromógeno (TMB).

LECTURA DEL ENSAYO Y CÁLCULO DE LOS

RESULTADOS

4.1. Mida la densidad óptica (DO) de los pocillos a

450 nm, preferiblemente antes de que pasen 15

minutos desde que se pare el desarrollo de co-

lor.

4.2. Calcule la media de los pocillos A1 y B1 (=DO450

del blanco)

4.3. Calcule la DO450 de todas las muestras restando

la DO450 media del blanco.

4.4. Calcule la media de los pocillos G1-H1 (=DO450

máx).

4.5. La inhibición porcentual (IP) de los sueros de

referencia y de los sueros del ensayo se calcula

según la siguiente fórmula.

Los valores DO450 de todas las muestras se expresan

como la inhibición porcentual relativa a la DO450 máx.

DO450 corregida de la muestra del ensayo

IP = 100 – ------------------------------------------------------ x 100

DO450 corregida máx

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Criterios de validación

5.1. La DO450 media de los pocillos A1 y B1 (DO450

blanco) debe ser <0,350.

5.2. La DO450 máx. media corregida debe ser al

menos 1,000.

5.3. La inhibición porcentual media del suero de

referencia 2 debe ser >60%.

5.4. La inhibición porcentual media del suero de

referencia 3 debe ser <40%.

El no cumplimiento de estos criterios es motivo sufi-

ciente para descartar los resultados de una placa

específicos.

Nota: Si la DO450 media corregida es inferior a 1,000,

posiblemente la solución de sustrato cromógeno

(TMB) esté demasiado fría.

En ese caso, entibie la solución hasta 22±3°C o

incube hasta 30 minutos.

Interpretación de la inhibición porcentual

IP = < 50% (negativo)

En el suero del ensayo no hay anticuerpos FMDV tipo

IP = >50% (positivo)

En el suero del ensayo hay anticuerpos FMDV tipo O.

Apéndice I

Nota informativa

Este manual se considera completo y correcto en el

momento de su publicación. Prionics AG no asume

ninguna responsabilidad por daños fortuitos o consi-

guientes en relación con o tras el uso de este manual.

Responsabilidad

Prionics AG garantiza que sus productos cumplen las

correspondientes especificaciones publicadas, siem-

pre que se usen de acuerdo con las instrucciones

correspondientes que sean del caso y dentro de la

fecha de caducidad de los productos. Prionics AG no

da ninguna otra garantía, explícita o implícita. No hay

ninguna garantía de comercialidad o idoneidad para

un uso particular. La garantía aquí ofrecida y los

datos, especificaciones y descripciones de los produc-

tos Prionics AG que aparecen en catálogos de Prio-

nics AG impresos y en la bibliografía sobre los produc-

tos no pueden ser modificados salvo tras acuerdo

escrito explícito firmado por un representante autori-

zado de Prionics AG. Cualquier representación oral o

escrita en contradicción con esta garantía o con

dichas publicaciones no está autorizada y, si ha sido

dada no es de fiar.

En caso de incumplimiento de la garantía susodicha,

la única obligación de Prionics AG consistirá, a su

elección, en reparar o remplazar el producto en

cuestión o parte del mismo, siempre que el cliente

notifique el incumplimiento a Prionics AG sin demora.

Si, tras esfuerzos razonables, Prionics AG resulta

incapaz de reparar o restituir el producto o parte del

mismo, entonces Prionics AG restituirá al cliente todos

los efectivos pagados por el producto o la parte en

cuestión.

Prionics AG no asume ninguna responsabilidad por

daños indirectos fortuitos, consiguientes, especiales o

de cualquier otro tipo que resulten de pérdidas eco-

nómicas o daños a la propiedad sufridos por cualquier

cliente como consecuencia del uso de sus productos.

Prionics AG y Prionics Lelystad B.V. son empresas

certificadas ISO 9001:2000.

Apéndice II

Normas de seguridad y declaraciones de I+S

1. Se deben seguir estrictamente las normas

nacionales de seguridad.

Componente 1

Placa del ensayo