Thermo Fisher Scientific PrioCHECK CSFV Ag Strip Kit Instrucciones de operación

Marca
Thermo Fisher Scientific
Modelo
PrioCHECK CSFV Ag Strip Kit
Tipo
Instrucciones de operación
Sólo para uso veterinario. Sólo para uso In Vitro.
INSTRUCCIONES DE USO
PrioCHECK™ CSFV Ag Strip Kit
ELISA para detección
in vitro
de antígeno del virus de la peste porcina clásica en sangre, suero, plasma y muestras de tejido de cerdos
Número de Catálogo 7610050
N.º de Pub. MAN0013845 Rev. A.0
¡ADVERTENCIA!
Lea las hojas de datos de seguridad (SDS) y siga las instrucciones de manipulación. Lleve el equipo de protección individual (EPI)
adecuado (gafas, ropa, guantes). Las hojas de datos de seguridad (SDS) se encuentran disponibles en thermofisher.com/support.
¡ADVERTENCIA! POSIBLE RIESGO BIOLÓGICO.
Lea la información sobre seguridad frente a los riesgos biológicos en la página de este producto en
thermofisher.com. Lleve el equipo de protección individual (EPI) adecuado (gafas, ropa, y guantes)
Introducción
La detección temprana de cerdos infectados con CSFV es de gran importancia para contener la diseminación del virus. El diagnostico precoz del ganado infectado se
realiza mediante la detección de antígeno del CSFV en lugar de anticuerpos, ya que estos aparecen a partir de los 14 días posteriores a la infección.
Applied Biosystems™ PrioCHECK™ CSFV Ag Strip Kit es una valiosa herramienta para aumentar la certeza en el diagnóstico de CSFV. El test brinda la máxima
sensibilidad posible, minimizando la posibilidad de falsos positivos (alta especificidad y selectividad). PrioCHECK™ CSFV Ag Strip Kit se puede utilizar en
relevamientos de hatos en lo que sospecha infección por CSFV. En países (áreas) endémicos para CSF en los que se administra una vacunación, el ensayo se puede
usar para trazar focos residuales de CSFV. Los resultados positivos de un ensayo se confirman con una prueba considerada de referencia “gold standard” (Ej.,
aislamiento del virus en un cultivo celular).
Principio del ensayo
PrioCHECK™ CSFV Ag Strip Kit se basa en el principio del sándwich de doble anticuerpo (DAS, por sus siglas en inglés). Se han recubierto tiras de ocho pocillos con
anticuerpos específicos contra CSFV. En el primer paso, se añaden a los pocillos el diluyente, la muestra (sangre, suero, plasma, concentrado de leucocitos o un
extracto de tejido) y se incuba. En segundo lugar, se lavan las tiras y se coloca en los pocillos el anticuerpo monoclonal conjugado anti-CSFV de gran especificidad.
Después del periodo de incubación, se lavan las tiras y se visualiza el conjugado unido seguido de otra incubación con el sustrato cromógeno (TMB). Luego de la
adición de la solución de frenado, se termina la reacción. La presencia de antígenos del virus de la peste porcina clásica la determina el desarrollo del color medido a
una longitud de onda de 450 nm.
Componentes del kit
Kit de 5 placas para 450 muestras. Conserve el kit a 5±3°C hasta su fecha de
vencimiento. Consulte la etiqueta del kit para ver la fecha de caducidad real. La
vida útil de los componentes diluidos, abiertos o reconstituidos aparece a
continuación.
Componente
Descripción
Componente 1:
Placa del ensayo
Cinco placas de ensayo tipo tira.
Componente 2:
Conjugado (30x)
Concentrado 30x, diluir antes de usar. Un vial con 2.2 mL
de conjugado. El conjugado diluido no es estable,
prepárelo inmediatamente antes de su utilización.
Componente 3:
Tampón de dilución
Listo para usar. Un vial contiene 60 mL de tampón de
dilución.
Componente 4:
Aditivo para el conjugado
Listo para usar. Un vial con 12.0 mL de aditivo
conjugado.
Componente 5:
Agua desmineralizada
Un vial con 10 mL de agua desmineralizada.
Componente 6:
Líquido de lavado (200x)
Concentrado 200x, diluir antes de usar. Un vial
contiene 60 mL de líquido de lavado. Vida media de la
solución de lavado: 1 semana a 22±3°C.
Componente 7:
Diluyente de muestra
Listo para usar. Tres viales con 10 mL de diluyente
de muestra.
Componente 8:
Suero de referencia 1
Liofilizado. Un vial con 1.5 mL de suero de referencia 1
(control positivo concentrado). Vida media del suero de
referencia 1 reconstituido: Hasta su fecha de
vencimiento a −20°C.
Componente 9:
Suero de referencia 2
Liofilizado. Un vial con 1.5 mL de suero de referencia 2
(blanco). Vida media del suero de referencia 2
reconstituido: Hasta su fecha de vencimiento a −20°C.
Componente 10:
Suero de referencia 3
Liofilizado. Un vial con 1.5 mL de suero de referencia 3
(control positivo débil). Vida media del suero de
referencia 3 reconstituido: Hasta su fecha de
vencimiento a −20°C.
Componente 11:
Cromógeno (TMB) sustrato
Listo para usar. Un vial con 60 mL de cromógeno
(TMB) sustrato.
Componente 12:
Solución de frenado
Listo para usar. Un vial que contiene 60 mL de
tampón de solución de frenado.
Contenido adicional del kit
• 10 selladores de placas
• Instrucciones de uso
Material necesario adicional
Uso
General
Análisis de los
resultados
Opcional
(1) A menos que se indique lo contrario, todos los materiales están disponibles en
thermofisher.com.
Procedimiento del ensayo
Precauciones
• Se deben seguir estrictamente las normas nacionales de seguridad.
• PrioCHECK™ CSFV Ag Strip Kit debe usarse en laboratorios adecuados para
este propósito.
• Las muestras tienen que considerarse siempre como potencialmente infecciosas;
mientras que aquellos objetos que entren en contacto con las muestras, deben
manejarse como potencialmente contaminados. Para la descontaminación se
puede usar halamid (1%), hidróxido de sodio (0.4%) o glutaraldehído (1%)
(reducción de 4–5 unidades logarítmicas de CSFV en 6 minutos).
• Debe mantenerse la esterilidad de las muestras para posibilitar la posterior
confirmación en el ensayo de aislamiento del virus.
Notas
Para lograr resultados óptimos con la tira PrioCHECK™ CSFV Ag Strip Kit, debe
tenerse en cuenta lo siguiente:
• Hay que seguir estrictamente el protocolo del ensayo.
• Todos los reactivos del kit deben equilibrarse a temperatura ambiente
(22±3°C) antes de usarse.
• Las puntas de las pipetas deben cambiarse luego de cada uso.
• Coloque cada reactivo en un recipiente diferente.
• Los componentes del kit no deben utilizarse si se observan cambios en su
aspecto, o tras su fecha de vencimiento.
• No hay que utilizar componentes con distinto número de lote al mismo tiempo.
• Se debe usar agua desmineralizada para el ensayo.
Soluciones que debe tener preparadas
Referencias
Reconstituya las referencias (Componente 8–10) con 1.5 mL agua
desmineralizada (Componente 5). Después de reconstituir las muestras de
referencia liofilizadas debe alicuotar las en viales pequeños y guardarlas a −20°C
hasta su fecha de vencimiento. El número de alícuotas depende del número de
ensayos que se desee realizar (máx. 12 ensayos independientes).
La reconstitución de ingredientes liofilizados debe hacerse del siguiente modo:
1. Equilibre el vial a 22±3°C.
2. Con el vial en posición vertical, dé golpecitos suaves contra la mesa para
asegurarse de que el contenido esté en el fondo del vial.
3. Abra el vial.
4. Agregue la cantidad de agua desmineralizada necesaria (véase la etiqueta del vial).
5. Cambie el tapón del vial y deje que el material liofilizado se disuelva.
6. Agite suavemente de modo que el material seco se disuelva.
7. Deje el material liofilizado en reposo a 22±3°C durante 15 minutos.
8. Invierta con cuidado de vez en cuando el vial (debe evitar la formación de
espuma).
Dilución del conjugado
Diluya el conjugado (30x) (Componente 2) en el tampón de dilución
(componente 3). Prepare la dilución del conjugado (30x) (Componente 2) en
tampón de dilución (Componente 3) con un 20% (v/v) de aditivo para el
conjugado. Por ejemplo, para realizar un ensayo con una placa prepare 12 mL de
conjugado diluido (agregue 2.4 mL de aditivo conjugado a 9.2 mL de tampón de
dilución. Después, agregue 400 µL de conjugado concentrado (30x)).
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11 Marzo 2019
Líquido de lavado
El líquido de lavado (Componente 6) debe diluirse 1:200 en agua
desmineralizada y es suficiente para un volumen final de 12 litros.
Se puede mantener estable durante 1 semana a 22±3°C.
Nota: El lavado de los pocillos después de la incubación es crítico. Si se registra
una densidad óptica blanca (DO de referencia 2) >0.300, es probable que se los
pocillos no estén correctamente lavados. Los mismos tienen que lavarse
manualmente al menos 6 veces. Para ello, añada 300 µL de solución de lavado a
cada pocillo, vacíelos con cuidado dando golpecitos y vuelva a llenarlos. Evite la
formación de burbujas de aire cuando los llene. Elimine cualquier residuo que
pueda quedar luego del último lavado golpeando a las placas invertidas sobre
papel absorbente. Si utiliza lavadores automáticos y obtiene valores de DO
blanco >0.300, lave manualmente como se indica anteriormente.
Nota: Consulte el apéndice B para ver el procedimiento de preparación de
muestras y su almacenamiento.
Incubación del suero y de la muestra
1. Etiquete cada tira (Componente 1) de ensayo con un bolígrafo indeleble.
2. Agregue 50 µL de diluyente de muestra (Componente 7) a todos los pocillos.
3. Agregue 50 µL del suero de referencia 1 reconstituido a los pocillos A1 y B1.
4. Agregue 50 µL de suero de referencia 2 reconstituido a los pocillos C1 y D1.
5. Agregue 50 µL de suero de referencia 3 reconstituido a los pocillos E1 y F1.
6. Agregue 50 µL de muestra al resto de los pocillos.
7. Selle las placas con sellador y agite las placas con cuidado.
8. Incube durante 180±5 minutos a 22±3°C.
Nota: Al añadir muestras de sangre entera, asegúrese de no dejar ningún resto
en la punta de la pipeta.
Incubación con el conjugado
1. Lave las tiras del ensayo 6 veces con 300 µL de solución de lavado en cada
pocillo. Golpee bien la placa después del último ciclo de lavado.
Nota: No debe quedar ningún residuo en los pocillos.
2. Agregue 100 µL de dilución de conjugado a cada pocillo.
3. Selle la placas con sellador.
4. Incube durante 60±5 minutos a 22±3°C.
Incubación con la solución de sustrato cromógeno (TMB)
1. Lave la placa 6 veces con 300 µL de solución de lavado en cada pocillo.
Seque bien las placas (invertidas sobre papel absorbente) luego del último
ciclo de lavado.
2. Agregue 100 µL de sustrato cromógeno (TMB) (Componente 11) a todos los
pocillos.
3. Incube durante 15 minutos a 22±3°C. No agite.
4. Agregue 100 µL de solución de frenado (Componente 12).
5. Mezcle el contenido de los pocillos de la placa.
Nota: Agregue la solución de frenado 15 minutos después de haber llenado el
primer pocillo con la solución de sustrato cromógeno (TMB).
Añada la solución de frenado en el mismo orden y lugar que la solución de
sustrato cromógeno (TMB).
Lectura del ensayo y cálculo de los resultados
1. Mida la densidad óptica (DO) de los pocillos a 450 nm, antes de que pasen
15 minutos desde que el desarrollo de color se detenga.
2. Calcule la DO450 media de los pocillos C1 y D1 (referencia 2 = DO450 blanco).
3. Calcule la DO450 corregida de la referencia 1 y de todas las muestras,
restando la DO450 blanco a la DO450 de la muestra.
4. La positividad porcentual (PP) de la referencia 3 y de las muestras se
calcula según la siguiente fórmula:
Los valores de DO450 corregidos de todas las muestras se expresan como la
positividad relativa (PP) con relación al valor de la DO450 media corregida de la
referencia 1.
PP = (DO450 corregida de la muestra / DO450 corregida de la referencia 1) × 100
Interpretación de los resultados
Criterios de validación
1. La DO450 de la referencia 2 debe ser <0.350.
2. La DO450 corregida de la referencia 1 debe ser 0.750.
3. La PP de la referencia 3 debe ser >20%.
Nota: Si no se cumplen estos criterios, debe descartar los resultados del ensayo.
Nota: Si la DO450 media corregida de la referencia 1 es inferior a 0.750, es posible
que la solución de sustrato cromógeno (TMB) esté demasiado fría. En ese caso,
lleve la solución hasta 22±3°C o incube durante 30 minutos. Si la DO450 media
corregida de la referencia 1 es superior a 2.000, se recomienda un periodo de
incubación más corto con la solución de sustrato cromógeno (TMB).
Interpretación de la positividad relativa (PP)
PP = <15% Negativo
La muestra no presenta antigenos (detectables) contra
CSFV.
PP = ≥15%
Positivo
La muestra contiene antigenos contra CSFV.
La presencia de CSFV en muestras de que han dado positivo para el antígeno
debe confirmarse con un aislamiento del virus.
Apéndice A - Bibliografía
1. Ressang AA (1972). Zbl Vet Med B 20:256–271.
2. Wensvoort et al (1986). Vet Microbiol 12:101–108.
3. Kaden et al (1999). Berl Münch Tierärtzl Wschr 112:52–57.
4. Martin et al (1992). Prev Vet Med 14:33–34.
Apéndice B - Preparación y almacenamiento de las muestras
Puede seguir varios procedimientos para preparar una muestra para realizar un
ensayo con el PrioCHECK™ CSFV Ag Strip Kit El procedimiento que se describe a
continuación está adaptado del método de rutina usado en el Laboratorio de
Referencia para CSF del Institute for Animal Health and Science de los Países Bajos.
Muestras de sangre y plasma
Las muestras de sangre con anticoagulante (preferentemente sangre con
heparina) o de plasma no deben congelarse, sino que deben almacenarse a 5±3°C
(máx. 7 días) antes de su análisis.
Suero
Las muestras de suero se pueden analizar directamente o pueden almacenarse
a −70°C. Después del ensayo, las muestras de suero se pueden conservar a −70°C
(para preservar la viabilidad de los virus).
Preparación de muestra de tejido
1. Corte 1–2 gramos de tejido en pequeños trozos y tritúrelos hasta alcanzar
una pasta homogénea usando un mortero y un poco de medio. Use arena
estéril como abrasivo si fuera necesario.
2. Agregue 9 mL de Earle’s MEM (complementado con 5 veces la
concentración normal de antibióticos: estreptomicina, penicilina y
micostatina) por gramo de tejido.
3. Incube 1 hora a 22±3°C.
4. Centrifugue la suspensión durante 20±1 min. a 6000 × g.
5. Recoja con cuidado el sobrenadante y descarte el sedimento.
6. Alicuote la suspensión en al menos 2 viales.
7. Guarde los viales a −70°C.
Preparación de concentrado de leucocitos
Es conveniente que antes del ensayo, las fracciones de leucocitos tomadas de una
muestra de sangre estén congeladas (−20 °C) y descongeladas.
1. Agregue 8 mL de solución de NH4Cl al 0.83% en un tubo de 15 mL.
2. Agregue 4 mL de sangre anticoagulada.
3. Mezcle el contenido del tubo e incube 30 minutos a 22±3°C para obtener una
lisis total de los glóbulos rojos.
4. Centrifugue durante 10 minutos a 500 × g a 22±3°C.
5. Descartar el sobrenadante.
6. Resuspenda el pellet de leucocitos en 400 µL de Earle’s MEM
(complementado con suero fetal al 5% y antibióticos: estreptomicina,
penicilina y micostatina).
7. Guardar a −70°C (para conservar la viabilidad de los virus).
Asistencia al cliente y soporte técnico
Asistencia técnica: visite thermofisher.com/askaquestion
Visite thermofisher.com/support para conocer lo último en servicios y
asistencia, incluyendo lo siguiente:
• Números de teléfono de contacto de todo el mundo
• Pedidos y soporte web
• Guías de usuario, manuales y protocolos
• Certificados de análisis
• Fichas técnicas de seguridad (Safety Data Sheets, SDS; también conocidas
como MSDS)
NOTA: Para conocer las SDS de los reactivos y productos químicos de otros
fabricantes, póngase en contacto con el fabricante.
Garantía limitada del producto
Life Technologies Corporation y/o su(s) filiale(s) garantizan sus productos tal y
como se establece en los términos y condiciones generales de venta de
Life Technologies, que se pueden encontrar en el sitio web de Life Technologies
www.thermofisher.com/us/en/home/global/
terms-and-conditions. Si tiene alguna duda, póngase en contacto con
Life Technologies en thermofisher.com/support.
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Historial de revisiones: N.º de Pub. MAN0013845 (Español)
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Fecha
Descripción
A.0 11 Marzo 2019
Documento nuevo. Se ha convertido el documento anterior (PrioCHECK
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actualizaciones asociadas a la información sobre la licencia limitada, la
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