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PrioCHECK® PPV Ab ELISA para la detección in vitro de anticuerpos dirigidos contra el Parvovirus porcino en suero de cerdos 2 placas para 176 muestras © Prionics AG Versión 1.1_es Introducción El parvovirus porcino (PPV) es un virus pequeño de ADN monocatenario que pertenece a la familia de los parvoviridae. El virus- que posee la capacidad de atravesar la placenta- es un agente infeccioso ubicuo que provoca infecciones y fallas reproductivas en las piaras, por lo que es una preocupación importante desde el punto de vista económico para los criadores de todo el mundo. Las consecuencias de una infección con PPV dependen del estado inmunitario de los progenitores durante la gestación, momento en que se produce la infección. Cuando los progenitores no poseen defensas, las infecciones por PPV, que se producen antes del día 35 de gestación, pueden provocar la muerte del embrión. Después de aproximadamente 70 días- cuando los fetos son inmunocompetentes- se genera una respuesta inmunitaria (se producen anticuerpos contra PPV) y es posible que los fetos sobrevivan a la infección. Normalmente esto resulta en el nacimiento de lechones sanos serológicamente positivos. ® PrioCHECK PPV Ab detecta anticuerpos específicos tan solo siete días después de la infección primaria. La titulación de anticuerpos se estabiliza aproximadamente 10 días después de la infección. Mediante la titulación de muestras de suero recogidas de una población en intervalos de varias semanas, se puede monitorear el estado de la infección. Esto permite tomar decisiones sobre cómo se controlará la enfermedad. Principio del ensayo ® La ELISA PrioCHECK PPV Ab es un ensayo de una sola dilución. Las muestras de suero se analizan en una dilución 1:5. Para llevar a cabo este ensayo, el suero a analizar diluido se preincuba con antígeno de PPV. Durante esta etapa- si la muestra tuviese anticuerpos específicos- se formaría un complejo inmunitario con el antígeno. Después de la preincubación, se transfiere la mezcla a una placa de ensayo recubierta. Durante la incubación en la placa de ensayo, el antígeno libre de la muestra se une a los anticuerpos que recubren los pocillos de la placa. Por otro lado, los complejos antígenoanticuerpo que se hayan formado durante la preincubación son eliminados durante la etapa de lavado. Luego, se agrega conjugado, se vuelve a lavar la placa y se agrega sustrato cromógeno (TMB). Para finalizar, se detiene el desarrollo de color y se mide a una longitud de onda de 450 nm. Componentes del kit Conserve el kit a 5±3°C hasta su fecha de vencimiento. Consulte la etiqueta del kit para ver la fecha de vencimiento real. La vida útil de los componentes diluidos, abiertos o reconstituidos se detalla a continuación, cuando corresponda. Tiene a su disposición los datos relativos a los riesgos químicos en la sección "Normas y declaraciones de seguridad" (Anexo II). Instrucciones de uso Tampón de dilución (5x) (Concentrado 5X, diluir antes de usar). Un vial con 60 ml de tampón de dilución. Vida media de la solución de trabajo del tampón de dilución: 5 horas a 22±3°C. Componente 4 Líquido de lavado (200X) (Concentrado 200X, diluir antes de usar) Un vial con 60 ml de líquido de lavado. Vida media de la solución de lavado: una semana a temperatura ambiente 22±3°C. Componente 5 Agua desmineralizada Un vial con 10 ml de agua desmineralizada. Procedimiento del ensayo Precauciones Debe seguir estrictamente las normas nacionales para ® el trabajo con muestras animales. PrioCHECK PPV Ab debe utilizarse en laboratorios adecuados para este propósito. Las muestras deben ser consideradas como potencialmente infecciosas y todos los objetos que entren en contacto con las muestras como potencialmente contaminados. Tiene a su disposición los datos relativos a los riesgos químicos en la sección "Normas y declaraciones de seguridad" (Anexo II). Notas Componente 6 Suero equino (liofilizado) Un vial con 3,5 ml de suero equino liofilizado. Vida media de suero equino reconstituido, almacenado a -20°C: hasta su fecha de vencimiento. Componente 7 Antígeno (liofilizado) Dos viales con 6,0 ml de antígeno liofilizado. Vida media de antígeno reconstituido almacenado en alícuotas a -20°C: hasta su fecha de vencimiento. Componente 8 Suero de referencia 1 (listo para usar) Un vial con 1,0 ml de suero de referencia 1 (control positivo) Componente 9 Suero de referencia 2 (listo para usar) Un vial con 1,0 ml de suero de referencia 2 (control negativo) Componente 10 Sustrato Cromógeno (TMB) (listo para usar) Un vial con 60 ml de sustrato cromógeno (TMB). Componente 11 Solución de frenado (listo para usar) Un vial con 60 ml de solución de frenado. Contenido adicional del kit: - Instrucciones de uso - 1 Tapa para cubrir las tiras durante la incubación - Certificado de análisis Material necesario adicional General: Equipo de laboratorio según las normas de seguridad nacionales. Placas sin recubrir: Prepare placas sin recubrir para la dilución de las muestras y preincúbelas con el antígeno. Aconsejamos placas con fondo en forma de U (Greiner, nº de catálogo 6501101). Sin embargo, se pueden utilizar otras placas o tubos sin unión. Componente 1 Placa de ensayo Dos placas de ensayo tipo tira. Incubación: Incubador de micro-placas (que llegue al menos a 50°C). Componente 2 Conjugado (30x) (Concentrado 30X, diluir antes de usar) Un vial con 1,5 ml de conjugado. El conjugado diluido no es estable, por lo que debe prepararse antes de ser utilizado. Análisis de los resultados: Lector de placas, p. ej., Multiscan EX o equivalente. El lector debe tener un filtro apropiado para leer placas a 450 nm. Componente 3 Sólo para diagnóstico in vitro en uso veterinario Guardar de 5±3°C Nº de producto 7588981 Opcional: Lavador de placas p. ej., Tecan EIA Tray Washer o equivalente. Para lograr resultados óptimos con el PrioCHECK® PPV Ab, debe tener en cuenta los siguientes aspectos:
Hay que seguir estrictamente el protocolo del ensayo.
Todos los reactivos del kit deben equilibrarse a temperatura ambiente (22±3°C) antes de usarse.
Se deben cambiar las puntas de las pipetas después de cada pipeteo.
Hay que usar recipientes independientes para cada reactivo.
Los componentes del kit no deben ser utilizados tras la fecha de caducidad o si se observan cambios en su aspecto.
No deben utilizarse juntos componentes de kits con números de lote diferentes.
Se debe usar agua destilada para el ensayo. SOLUCIONES QUE DEBE TENER PREPARADAS Solución de trabajo del tampón de dilución Diluya el tampón de dilución concentrado (5X) (Componente 3) en agua desmineralizada. Estabilidad de la solución de trabajo del tampón de dilución: 5 horas a 22±3°C. Suero equino 1 Reconstituya el suero equino (Componente 6) con 3.5 ml de agua desmineralizada (Componente 5). El suero equino reconstituido puede mantenerse a -20°C hasta su fecha de vencimiento. Tampón del conjugado Para realizar un ensayo con dos tiras, agregue 0,1 ml de suero equino reconstituido a 1,9 ml de la solución de trabajo del tampón de dilución, (la concentración final de suero equino debe ser 5% (v/v)). El tampón de dilución del conjugado puede almacenarse hasta 24 horas a 5±3°C. Dilución del Conjugado Diluya del conjugado (30X) (Componente 2) 1/30 en tampón de conjugado. Prepare 1,8 ml para realizar una prueba con dos tiras. Nota: debe preparar la dilución de trabajo justo antes de usarla. Antígeno 1 Reconstituya el antígeno (Componente 7) con 6 ml de la solución de trabajo del tampón de dilución. Para el uso 1 - La reconstitución de reactivos liofilizados debe hacerse del siguiente modo: Equilibre los viales a temperatura ambiente (22±3°C). Con el vial en posición vertical, golpéelo contra la mesa para asegurarse de que el contenido esté en el fondo del vial. Abra el vial. Agregue la cantidad necesaria de agua desmineralizada. Deje que el material liofilizado se disuelva. Cambie el tapón del vial y gire con cuidado el vial de modo que el material seco que quede se disuelva. Deje el material liofilizado en reposo a 22±3°C d urante 15 minutos. Invierta el vial con cuidado de vez en cuando (debe evitar la formación de espuma). PrioCHECK® PPV Ab parcial del kit, debe dividir el antígeno reconstituido en alícuotas de 1,0 ml (para un máximo de 6 ciclos de ensayo por placa). Evite los ciclos de congelado y descongelado y guarde las alícuotas en viales pequeños a -20°C. Líquido de lavado El líquido de lavado (200X) (Componente 4) debe diluirse 1/200 en agua desmineralizada y es suficiente para un volumen final de 12 litros. Estabilidad de la solución de lavado: 1 semana a temperatura ambiente (22±3°C). Nota: Se pueden utilizar lavadores ELISA comerciales. Si no tiene uno a su disposición, puede lavar las placas agregando 200 – 300 µl de líquido de lavado a todos los pocillos de las placas. Después, vacíe las placas y repita el proceso las veces necesarias. No es necesario empapar las placas. Golpee bien las placas después del último lavado. INCUBACIÓN PREVIA DE LAS MUESTRAS Y EL ANTÍGENO 1.1 1.2 1.3 1.4 Mezcle 96 µl de la solución de trabajo del tampón de dilución con 24 µl de suero de referencia 1 (Componente 8) y 120 µl de antígeno reconstituido. Mezcle 96 µl de la solución de trabajo del tampón de dilución con 24 µl de suero de referencia 2 (Componente 9) y 120 µl de antígeno reconstituido. Mezcle 12 µl de cada muestra de suero con 48 µl de de la solución de trabajo del tampón de dilución y 60 µl de antígeno reconstituido. Incube 60±5 minutos a 37±1°C. INCUBACIÓN EN LA PLACA DE ENSAYO 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 Etiquete cada placa de ensayo (Componente 1) con un marcador indeleble. Agregue 100 µl de la solución de trabajo del tampón de dilución A1 y B1. Agregue 50 µl de la solución de trabajo del tampón de dilución a los pocillos C1 y D1. Agregue 50 µl de antígeno reconstituido a los pocillos C1 y D1 y mezcle. Agregue 100 µl de la mezcla del suero de referencia 1 con el antígeno, a los pocillos E1 y F1. Agregue 100 µl de la mezcla del suero de referencia 2 con el antígeno, a los pocillos G1 y H1. Agregue 100 µl de la mezcla de la muestra con el antígeno al resto de pocillos. Selle e incube las placas de ensayo 120±5 minutos a 37±1°C. INCUBACIÓN CON EL CONJUGADO 3.1 3.2 3.3 Vacíe la placa y lávela 6 veces con 200 a 300 µl de líquido de lavado. Golpee bien la placa después del último ciclo de lavado. Agregue 100 µl de conjugado diluido a todos los pocillos. Selle e incube las placas 60±5 minutos a 37±1°C. INCUBACIÓN CON EL SUSTRATO CROMÓGENO (TMB) 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 Vacíe la placa y lávela 6 veces con 200 a 300 µl de líquido de lavado. Golpee bien la placa después del último ciclo de lavado. Agregue 100 µl de sustrato cromógeno (TMB) (Componente 10) a cada pocillo. Incube la placa 15 minutos a temperatura ambiente (22±3°C). Agregue 100 µl de la solución de frenado (Componente 11) a cada pocillo. Mezcle el contenido de los pocillos antes de realizar la medición. Nota: Agregue la solución de frenado 15 minutos después de haber llenado el primer pocillo con sustrato cromógeno (TMB). Agregue la solución de frenado en el mismo orden y al mismo ritmo en que agregó el sustrato cromógeno (TMB). LECTURA DEL ENSAYO Y CÁLCULO DE LOS RESULTADOS 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 Mida la densidad óptica (DO) de los pocillos a 450 nm, antes de que pasen 15 minutos desde que agregó la solución de frenado. Calcule la DO450 media de los pocillos A1 y B1 (=DO450 blanco). Calcule la DO450 corregida de los sueros de referencia 1 y 2 y de las muestras restando la media de la DO450 blanco. Calcule la media de la DO450 corregida de los pocillos C1 y D1 (= DO450 máx). El porcentaje de inhibición (PP) se calcula según la siguiente fórmula: Nota: el porcentaje de inhibición (PP) de las muestras se expresa como la DO450 corregida sobre la DO450 máx. PP = 100- DO450 corregida de la muestra ---------------------------------------DO450 máx corregida x 100 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Criterios de validación 6.1 La media de la DO450 blanco (pocillos A1 y B1) debe ser <0,300. 6.2 La DO450 máx. corregida (pocillos C1 y D1) debe ser > 1,000. 6.3 El PP del suero de referencia 1 (control positivo) debe ser >50%. 6.4 El PP del suero de referencia 2 (control negativo) debe ser <50%. 6.5 El incumplimiento de estos criterios es motivo suficiente para descartar los resultados de un ensayo específico. Nota: Si la DO450 máx. corregida es inferior a 1,000, es posible que la solución de sustrato cromógeno (TMB) se encuentre demasiado fría. En ese caso, caliente la solución hasta 22±3°C o incube durante 30 minutos. Si la media de la DO450 corregida es superior a 2,000, se recomienda un periodo de incubación más corto con el sustrato cromógeno (TMB). Interpretación del porcentaje de inhibición PP = ≥ 50% La muestra contiene anticuerpos específicos contra PPV. PP = < 50% La muestra no contiene anticuerpos específicos contra PPV. Anexo I Nota informativa Este manual se considera completo y correcto en el momento de su publicación. Prionics AG no asume ninguna responsabilidad por incidencias o daños relacionados por el uso de este manual Responsabilidad Prionics AG garantiza que sus productos cumplen las correspondientes especificaciones publicadas, siempre que se usen de acuerdo con las instrucciones correspondientes que sean del caso y dentro de la fecha de caducidad de los productos. Prionics AG no da ninguna otra garantía, explícita o implícita. No hay ninguna garantía de comercialidad o idoneidad para un uso particular. La garantía aquí ofrecida y los datos, especificaciones y descripciones de los productos Prionics AG que aparecen en catálogos de Prionics AG impresos y en la bibliografía sobre los productos no pueden ser modificados salvo tras acuerdo escrito explícito firmado por un representante autorizado de Prionics AG. Cualquier reproducción oral o escrita en contradicción con esta garantía o con dichas publicaciones no está autorizada y Prionics no se hace responsable. En caso de incumplimiento de la garantía susodicha, la única obligación de Prionics AG consistirá, a su elección, en reparar o remplazar el producto en cuestión o parte del mismo, siempre que el cliente notifique el incumplimiento a Prionics AG sin demora. Si, tras esfuerzos razonables, Prionics AG resulta incapaz de reparar o restituir el producto o parte del mismo, entonces Prionics AG restituirá al cliente todos los efectivos pagados por el producto o la parte en cuestión. Prionics AG no asume ninguna responsabilidad por daños indirectos fortuitos, consiguientes, especiales o de cualquier otro tipo que resulten de pérdidas económicas o daños a la propiedad sufridos por cualquier cliente como consecuencia del uso de sus productos. Prionics AG y Prionics Lelystad B.V. son empresas certificadas ISO 9001:2000. Anexo II Normas y declaraciones de seguridad Se deben seguir estrictamente las normas nacionales de seguridad. Componente 1 Placa de ensayo Código de riesgo: este producto no está clasificado según las normas de la UE. Componente 2 Conjugado (30x) Código de riesgo: este producto no está clasificado según las normas de la UE. Componente 3 Tampón de dilución (5x) Código de riesgo: este producto no está clasificado según las normas de la UE. Componente 4 Líquido de lavado (200X) Código de riesgo: este producto no está clasificado según las normas de la UE. Componente 5 Agua desmineralizada Código de riesgo: este producto no está clasificado según las normas de la UE. Componente 6 Suero equino (liofilizado) Código de riesgo: este producto no está clasificado según las normas de la UE. Componente 7 Antígeno (liofilizado) Código de riesgo: este producto no está clasificado según las normas de la UE. Componente 8 Suero de referencia 1 (listo para usar) Código de riesgo: este producto no está clasificado según las normas de la UE. Componente 9 Suero de referencia 2 (listo para usar) Código de riesgo: este producto no está clasificado según las normas de la UE. Componente 10 Sustrato Cromógeno (TMB) (listo para usar) Código de riesgo: este producto no está clasificado según las normas de la UE. Componente 11 Solución de frenado (lista para usar) Código de riesgo: R35: provoca quemaduras graves. S26: en caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y abundantemente con agua y acúdase a un médico. S36/37/39: úsese indumentaria y guantes adecuados y protección para los ojos/la cara. S45: en caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico (si es posible, muéstrele la etiqueta). Anexo III Bibliografía (1) F. Westenbrink, M.A. Veldhuis and J.M.A. Brinkhof Journal of Virological Methods, 23 (1989) 169-178. Contacto Prionics Lelystad B.V. Platinastraat 33 P.O. Box 2271 NL-8203 AG Lelystad Países Bajos Tel. +31 320 714000 Fax +31 320 714029 Prionics AG Wagistrasse 27a CH-8952 Schlieren-Zurich Suiza Tel. +41 44 200 2000 Fax +41 44 200 2010 www.prionics.com [email protected] Para ver nuestra red de distribuidores, por favor, visite www.prionics.com