Thermo Fisher Scientific PrioCHECK Porcine Parvovirus Ab Plate Kit Instrucciones de operación

Marca
Thermo Fisher Scientific
Modelo
PrioCHECK Porcine Parvovirus Ab Plate Kit
Tipo
Instrucciones de operación
Sólo para uso veterinario. Sólo para uso In Vitro.
INSTRUCCIONES DE USO
PrioCHECK™ Porcine Parvovirus Ab Plate Kit
ELISA para la detección
in vitro
de anticuerpos dirigidos contra el parvovirus porcino en suero de cerdos
Número de Catálogo 7588981
N.º de Pub. MAN0013813 Rev. A.0
¡ADVERTENCIA!
Lea las hojas de datos de seguridad (SDS) y siga las instrucciones de manipulación. Lleve el equipo de protección individual
(EPI) adecuado (gafas, ropa, guantes). Las hojas de datos de seguridad (SDS) se encuentran disponibles en
thermofisher.com/support.
¡ADVERTENCIA! POSIBLE RIESGO BIOLÓGICO.
Lea la información sobre seguridad frente a los riesgos biológicos en la página de este producto
en thermofisher.com. Lleve el equipo de protección individual (EPI) adecuado (gafas, ropa, y guantes)
Introducción
El parvovirus porcino (PPV) es un virus pequeño de ADN monocatenario que pertenece a la familia de los Parvoviridae. El virus- que posee la capacidad
de atravesar la placenta- es un agente infeccioso ubicuo que provoca infecciones y fallas reproductivas en las piaras, por lo que es una preocupación
importante desde el punto de vista económico para los criadores de todo el mundo. Las consecuencias de una infección con PPV dependen del estado
inmunitario de los progenitores durante la gestación, momento en que se produce la infección. Cuando los progenitores no poseen defensas, las infecciones
por PPV, que se producen antes del día 35 de gestación, pueden provocar la muerte del embrión. Después de aproximadamente 70 días- cuando los fetos
son inmunocompetentes- se genera una respuesta inmunitaria (se producen anticuerpos contra PPV) y es posible que los fetos sobrevivan a la infección.
Normalmente esto resulta en el nacimiento de lechones sanos serológicamente positivos.
Applied Biosystems™ PrioCHECK™ Porcine Parvovirus Ab Plate Kit detecta anticuerpos específicos tan solo siete días después de la infección primaria. La
titulación de anticuerpos se estabiliza aproximadamente 10 días después de la infección.
Mediante la titulación de muestras de suero recogidas de una población en intervalos de varias semanas, se puede monitorear el estado de la infección. Esto
permite tomar decisiones sobre cómo se controlará la enfermedad.
Principio del ensayo
La ELISA PrioCHECK™ Porcine Parvovirus Ab Plate Kit es un ensayo de una sola dilución. Las muestras de suero se analizan en una dilución 1:5.
Para llevar a cabo este ensayo, el suero a analizar diluido se preincuba con antígeno de PPV. Durante esta etapa- si la muestra tuviese anticuerpos
específicos- se formaría un complejo inmunitario con el antígeno.
Después de la pre-incubación, se transfiere la mezcla a una placa de ensayo recubierta. Durante la incubación en la placa de ensayo, el antígeno libre de la
muestra se une a los anticuerpos que recubren los pocillos de la placa. Por otro lado, los complejos antígeno-anticuerpo que se hayan formado durante la
pre-incubación son eliminados durante la etapa de lavado. Luego, se agrega conjugado, se vuelve a lavar la placa y se agrega sustrato cromógeno (TMB).
Para finalizar, se detiene el desarrollo de color y se mide a una longitud de onda de 450 nm.
Componentes del kit
Kit de 2 placas para 176 muestras. Conserve el kit a 5±3°C hasta su fecha de
vencimiento. Consulte la etiqueta del kit para ver la fecha de vencimiento
real. La vida útil de los componentes diluidos, abiertos o reconstituidos se
detalla a continuación, cuando corresponda.
Componente
Descripción
1: Placa de ensayo
Dos placas de ensayo tipo tira.
2: Conjugado (30x)
Concentrado 30x, diluir antes de usar. Un vial
con 1.5 mL de conjugado. El conjugado diluido
no es estable, por lo que debe prepararse antes
de ser utilizado.
3: Tampón de dilución (5x)
Concentrado 5x, diluir antes de usar. Un vial con
60 mL de tampón de dilución. Vida media de la
solución de trabajo del tampón de dilución:
5 horas a 22±3°C.
4: Líquido de lavado (200x)
Concentrado 200x, diluir antes de usar. Un vial
con 60 mL de líquido de lavado. Vida media de la
solución de lavado: una semana a temperatura
ambiente 22±3°C.
5: Agua desmineralizada
Un vial con 10 mL de agua desmineralizada.
6: Suero equino
Liofilizado. Un vial con 3.5 mL de suero equino
liofilizado. Vida media de suero equino
reconstituido, almacenado a −20°C:
hasta su fecha de vencimiento.
7: Antígeno
Liofilizado. Dos viales con 6.0 mL de antígeno
liofilizado. Vida media de antígeno reconstituido
almacenado en alícuotas a −20°C: hasta su fecha
de vencimiento.
8: Suero de referencia 1
Listo para usar. Un vial con 1.0 mL de suero de
referencia 1 (control positivo).
9: Suero de referencia 2
Listo para usar. Un vial con 1.0 mL de suero de
referencia 2 (control negativo).
10: Sustrato Cromógeno (TMB)
Listo para usar. Un vial con 60 mL de sustrato
cromógeno (TMB).
11: Solución de frenado
Listo para usar. Un vial con 60 mL de solución
de frenado.
Contenido adicional del kit
•Instrucciones de uso
•1 Tapa para cubrir las tiras durante la
incubación
Material necesario adicional
A menos que se indique lo contrario, todos los materiales están disponibles
en thermofisher.com.
Uso
Descripción
General
Equipo de laboratorio según las normas de seguridad nacionales.
Pre-incubación
Prepare placas sin recubrir para la dilución de las muestras y
preincúbelas con el antígeno. Aconsejamos placas con fondo en
forma de U (N.º de Cat. 267245). Sin embargo, se pueden utilizar
otras placas o tubos sin unión.
Incubación
Incubador de micro-placas (que llegue al menos a 50°C).
Análisis de los
resultados
Lector de placas. El lector debe tener un filtro apropiado para
leer placas a 450 nm.
Opcional
Lavador de placas.
Procedimiento del ensayo
Precauciones
•Se deben seguir estrictamente las normas nacionales de seguridad.
•PrioCHECK™ Porcine Parvovirus Ab Plate Kit debe utilizarse en
laboratorios adecuados para este propósito.
•Las muestras deben ser consideradas como potencialmente infecciosas
y todos los objetos que entren en contacto con las muestras como
potencialmente contaminados.
Notas
Para lograr resultados óptimos con el PrioCHECK™ Porcine Parvovirus Ab
Plate Kit, debe tener en cuenta los siguientes aspectos:
•Hay que seguir estrictamente el protocolo del ensayo.
•Todos los reactivos del kit deben equilibrarse a temperatura ambiente
(22±3°C) antes de usarse.
•Se deben cambiar las puntas de las pipetas después de cada pipeteo.
•Hay que usar recipientes independientes para cada reactivo.
•Los componentes del kit no deben ser utilizados tras la fecha de
caducidad o si se observan cambios en su aspecto.
•No deben utilizarse juntos componentes de kits con números de lote
diferentes.
•Se debe usar agua destilada para el ensayo.
Soluciones que debe tener preparadas
Solución de trabajo del tampón de dilución
Diluya el tampón de dilución concentrado (5x) (Componente 3) en agua
desmineralizada. Estabilidad de la solución de trabajo del tampón de
dilución: 5 horas a 22±3°C.
thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion
thermofisher.com
18 Marzo 2019
Suero equino
Reconstituya el suero equino (Componente 6) con 3.5 mL de agua
desmineralizada (Componente 5). El suero equino reconstituido puede
mantenerse a −20°C hasta su fecha de vencimiento.
La reconstitución de reactivos liofilizados debes hacerse del siguiente modo:
1. Equilibre los viales a temperatura ambiente (22±3°C).
2. Con el vial en posición vertical, golpéelo contra la mesa para asegurarse
de que el contenido esté en el fondo del vial.
3. Abra el vial.
4. Agregue la cantidad necesaria de agua desmineralizada.
5. Deje que el material liofilizado se disuelva.
6. Cambie el tapón del vial y gire con cuidado el vial de modo que el
material seco que quede se disuelva.
7. Deje el material liofilizado en reposo a 22±3°C durante 15 minutos.
8. Invierta el vial con cuidado de vez en cuando (debe evitar la formación
de espuma).
Tampón del conjugado
Para realizar un ensayo con dos tiras, agregue 0.1 mL de suero equino
reconstituido a 1.9 mL de la solución de trabajo del tampón de dilución, (la
concentración final de suero equino debe ser 5% (v/v)). El tampón de
dilución del conjugado puede almacenarse hasta 24 horas a 5±3°C.
Dilución del Conjugado
Diluya del conjugado (30x) (Componente 2) 1:30 en tampón de conjugado.
Prepare 1.8 mL para realizar una prueba con dos tiras.
Nota: Debe preparar la dilución de trabajo justo antes de usarla.
Antígeno
Reconstituya el antígeno (Componente 7) con 6 mL de la solución de trabajo
del tampón de dilución. Para el uso parcial del kit, debe dividir el antígeno
reconstituido en alícuotas de 1.0 mL (para un máximo de 6 ciclos de ensayo
por placa). Evite los ciclos de congelado y descongelado y guarde las
alícuotas en viales pequeños a −20°C.
Líquido de lavado
El líquido de lavado (200x) (Componente 4) debe diluirse 1:200 en agua
desmineralizada y es suficiente para un volumen final de 12 litros. Estabilidad
de la solución de lavado: 1 semana a temperatura ambiente (22±3°C).
Nota: Se pueden utilizar lavadores ELISA comerciales. Si no tiene uno a su
disposición, puede lavar las placas agregando 200-300 µL de líquido de
lavado a todos los pocillos de las placas. Después, vacíe las placas y repita
el proceso las veces necesarias. No es necesario empapar las placas. Golpee
bien las placas después del último lavado.
Incubación previa de las muestras y el antígeno
1. Mezcle 96 µL de la solución de trabajo del tampón de dilución con
24 µL de suero de referencia 1 (Componente 8) y 120 µL de antígeno
reconstituido.
2. Mezcle 96 µL de la solución de trabajo del tampón de dilución con
24 µL de suero de referencia 2 (Componente 9) y 120 µL de antígeno
reconstituido.
3. Mezcle 12 µL de cada muestra de suero con 48 µL de la solución de
trabajo del tampón de dilución y 60 µL de antígeno reconstituido.
4. Incube 60±5 minutos a 37±1°C.
Incubación en la placa de ensayo
1. Etiquete cada placa de ensayo (Componente 1) con un marcador indeleble.
2. Agregue 100 µL de la solución de trabajo del tampón de dilución A1 y B1.
3. Agregue 50 µL de la solución de trabajo del tampón de dilución a los
pocillos C1 y D1.
4. Agregue 50 µL de antígeno reconstituido a los pocillos C1 y D1 y mezcle.
5. Agregue 100 µL de la mezcla del suero de referencia 1 con el antígeno, a
los pocillos E1 y F1.
6. Agregue 100 µL de la mezcla del suero de referencia 2 con el antígeno, a
los pocillos G1 y H1.
7. Agregue 100 µL de la mezcla de la muestra con el antígeno al resto de
pocillos.
8. Selle e incube las placas de ensayo 120±5 minutos a 37±1°C.
Incubación con el conjugado
1. Vacíe la placa y lávela 6 veces con 200 a 300 µL de líquido de lavado.
Golpee bien la placa después del último ciclo de lavado.
2. Agregue 100 µL de conjugado diluido a todos los pocillos.
3. Selle e incube las placas 60±5 minutos a 37±1°C.
Incubación con el sustrato cromógeno (TMB)
1. Vacíe la placa y lávela 6 veces con 200 a 300 µL de líquido de lavado.
Golpee bien la placa después del último ciclo de lavado.
2. Agregue 100 µL de sustrato cromógeno (TMB) (Componente 10) a cada
pocillo.
3. Incube la placa 15 minutos a temperatura ambiente (22±3°C).
4. Agregue 100 µL de la solución de frenado (Componente 11) a cada pocillo.
5. Mezcle el contenido de los pocillos antes de realizar la medición.
Nota: Agregue la solución de frenado 15 minutos después de haber llenado
el primer pocillo con sustrato cromógeno (TMB). Agregue la solución de
frenado en el mismo orden y al mismo ritmo en que agregó el sustrato
cromógeno (TMB).
Lectura del ensayo y cálculo de los resultados
1. Mida la densidad óptica (DO) de los pocillos a 450 nm, antes de que
pasen 15 minutos desde que agregó la solución de frenado.
2. Calcule la DO450 media de los pocillos A1 y B1 (= DO450 blanco).
3. Calcule la DO450 corregida de los sueros de referencia 1 y 2 y de las
muestras restando la media de la DO450 blanco.
4. Calcule la media de la DO450 corregida de los pocillos C1 y D1 (= DO450 máx).
5. El porcentaje de inhibición (PI) se calcula según la siguiente fórmula:
Nota: El porcentaje de inhibición (PI) de las muestras se expresa como la
DO450 corregida sobre la DO450 máx.
PI = 100 − (DO450 corregida muestra / DO450 corregida máx) × 100
Interpretación de los resultados
Criterios de validación
1. La media de la DO450 blanco (pocillos A1 y B1) debe ser <0.300.
2. La DO450 máx corregida (pocillos C1 y D1) debe ser >1.000.
3. El PI del suero de referencia 1 (control positivo) debe ser >50%.
4. El PI del suero de referencia 2 (control negativo) debe ser <50%.
El incumplimiento de estos criterios es motivo suficiente para descartar los
resultados de un ensayo específico.
Nota: Si la DO450 máx corregida es inferior a 1.000, es posible que la solución
de sustrato cromógeno (TMB) se encuentre demasiado fría. En ese caso,
caliente la solución hasta 22±3°C o incube durante 30 minutos.
Si la media de la DO450 corregida es superior a 2.000, se recomienda un
periodo de incubación más corto con el sustrato cromógeno (TMB).
Interpretación del porcentaje de inhibición
La muestra contiene anticuerpos específicos contra PPV.
La muestra no contiene anticuerpos específicos contra PPV.
Bibliografía
Westenbrink F, Veldhuis MA and Brinkhof JA (1989). Journal of Virological
Methods 23: 169–178.
Asistencia al cliente y soporte técnico
Asistencia técnica: visite thermofisher.com/askaquestion
Visite thermofisher.com/support para conocer lo último en servicios y
asistencia, incluyendo lo siguiente:
• Números de teléfono de contacto de todo el mundo
• Pedidos y soporte web
• Guías de usuario, manuales y protocolos
• Certificados de análisis
• Fichas técnicas de seguridad (Safety Data Sheets, SDS; también
conocidas como MSDS)
NOTA: Para conocer las SDS de los reactivos y productos químicos de
otros fabricantes, póngase en contacto con el fabricante.
Garantía limitada del producto
Life Technologies Corporation y/o su(s) filiale(s) garantizan sus productos
tal y como se establece en los términos y condiciones generales de venta de
Life Technologies, que se pueden encontrar en el sitio web de
Life Technologies www.thermofisher.com/us/en/home/global/
terms-and-conditions. Si tiene alguna duda, póngase en contacto con
Life Technologies en thermofisher.com/support.
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