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PrioCHECK® BRSV Ab ELISA para la detección in vitro de anticuerpos dirigidos contra el Virus Respiratorio Sincicial Bovino en suero de bovinos 2 placas para 22 muestras © Prionics AG Versión 1.0_es Introducción El virus respiratorio sincicial bovino (BRSV) pertenence al género Pneumovirus de la familia Paramyxoviridae. El BRSV está muy relacionado con el RSV de humanos, ovinos y caprinos. Una infección primaria con BRSV puede resultar en una enfermedad grave de las vías respiratorias inferiores en el ganado bovino susceptible. Asimismo, es posible que se produzcan infecciones asintomáticas. En áreas endémicas, la enfermedad producida por el BRSV es la que más afecta a los terneros, y sus síntomas se asemejan a los que presentan los niños infectados con HRSV. Después de una infección primaria con BRSV o HRSV, la protección contra una posterior infección es de corta duración, por lo que es frecuente la aparición de múltiples infecciones. Las infecciones primarias con BRSV en animales individuales se pueden ser fácilmente monitoreadas mediante la titulación de muestras de suero secuenciales. Si el título de anticuerpos específicos en dos muestras de suero sucesivas aumenta cuatro veces, se puede considerar que se está en presencia de una seroconversión (= infección primaria) (4). ® PrioCHECK BRSV Ab es una modificación del ensayo descrito por Westenbrink y col. En comparación con la neutralización del virus, la ELISA tiene una sensibilidad relativa de aproximadamente 90% y una especificidad relativa del 100%. Principio del ensayo ® PrioCHECK BRSV Ab es un ensayo basado en una ELISA indirecta. La placa de microtitulación se encuentra recubierta con anticuerpos monoclonales dirigidos contra BRSV que capturan el antígeno de BRSV. La placa también está recubierta con una proteína irrelevante para bloquear lugares de unión inespecíficos. Los sueros a analizar se diluyen (1:80) y se agregan a los pocillos que contienen el antígeno. Los anticuerpos dirigidos contra BRSV, se unirán al antígeno de la muestra durante la incubación. Los anticuerpos unidos se detectan usando un anticuerpo policlonal anti-Ig, conjugado con peroxidasa (HRPO). El conjugado unido se visualiza añadiendo sustrato cromógeno (TMB). Para finalizar, se mide el desarrollo del color a una longitud de onda de 450 nm. Componentes del kit Conserve el kit a 5±3°C hasta su fecha de vencimiento. Consulte la etiqueta del kit para ver la fecha de vencimiento real. La vida útil de los componentes diluidos, abiertos o reconstituidos se detalla a continuación, cuando corresponda. Tiene a su disposición los datos relativos a los riesgos químicos en la sección "Normas y declaraciones de seguridad" (Anexo II). Componente 1 Placa de ensayo Dos placas de ensayo tipo tira. Componente 2 Conjugado (30x) (Concentrado 30X, diluir antes de usar) Un vial con 1,5 ml de conjugado. El conjugado diluido no es estable, por lo que debe prepararse inmediatamente antes de ser utilizado. Componente 3 Tampón de dilución (5x) (Concentrado 5X, diluir antes de usar). Un vial con 60 ml de tampón de dilución. Vida media de la solución de trabajo del tampón de dilución: 5 horas a 22±3°C. Instrucciones de uso Componente 4 Líquido de lavado (200X) (Concentrado 200X, diluir antes de usar) Un vial con 60 ml de líquido de lavado. Vida media de la solución de lavado: una semana a temperatura ambiente (22±3°C). Componente 5 Agua desmineralizada Un vial con 10 ml de agua desmineralizada. Componente 6 Suero equino (liofilizado) Un vial con 6,0 ml de suero equino liofilizado. Vida media del suero equino reconstituido, almacenado a -20°C: hasta su fecha de vencimiento. Componente 7 Antígeno (liofilizado) Dos viales con 10 ml de antígeno liofilizado. Vida media del antígeno reconstituido, almacenado en alícuotas a -20°C: hasta su fecha de vencimiento. Componente 8 Suero de referencia 1 (liofilizado) Un vial con 0,25 ml de suero de referencia 1. Vida media del suero de referencia 1 reconstituido, almacenado a -20°C: hasta su fecha de vencimiento. Componente 9 Suero de referencia 2 (liofilizado) Un vial con 0,25 ml de suero de referencia 2. Vida media de suero de referencia 2 reconstituido, almacenado a -20°C: hasta su fecha de vencimiento. Componente 10 Suero de referencia 3 (liofilizado) Un vial con 0,25 ml de suero de referencia 3. Vida media de suero de referencia 3 reconstituido, almacenado a -20°C: hasta su fecha de vencimiento. Componente 11 Sustrato Cromógeno (TMB) (listo para usar) Un vial con 60 ml de sustrato cromógeno (TMB). Componente 12 Solución de frenado (listo para usar) Un vial con 60 ml de solución de frenado. Contenido adicional del kit: - Instrucciones de uso - 1 Tapa para cubrir las tiras durante la incubación - Certificado de análisis Material necesario adicional General: Equipo de laboratorio según las normas de seguridad nacionales. Incubación: Incubador de micro-placas (que llegue al menos a 50°C). Análisis de los resultados: Lector de placas, p. ej., Multiscan EX o equivalente. El lector tiene que tener un filtro apropiado para leer placas a 450 nm. Opcional: Lavador de placas p. ej., Tecan EIA Tray Washer o equivalente. Procedimiento Precauciones Debe seguir estrictamente a las normas nacionales ® para el trabajo con muestras animales. PrioCHECK BRSV Ab debe utilizarse en laboratorios adecuados Sólo para diagnóstico in vitro en uso veterinario Guardar de 5±3°C Nº de producto 7588991 para este propósito. Las muestras deben ser consideradas como potencialmente infecciosas y todos los objetos que entren en contacto con las muestras como potencialmente contaminados. Tiene a su disposición los datos relativos a los riesgos químicos en la sección "Normas y declaraciones de seguridad" (Anexo II). Notas ® Para lograr resultados óptimos con el PrioCHECK BRSV Ab, debe tener en cuenta lo siguiente:
Debe seguir estrictamente el protocolo del ensayo.
Todos los reactivos del kit deben equilibrarse a temperatura ambiente (22±3°C) antes de usarse.
Debe cambiar las puntas de las pipetas después de cada pipeteo.
Utilice recipientes diferentes para cada reactivo.
Los componentes del kit no deben ser utilizados pasada la fecha de vencimiento, o si se observan cambios en su aspecto.
No debe utilizar componentes con diferentes números de lote al mismo tiempo.
Debe utilizar agua desmineralizada durante todo el ensayo. SOLUCIONES QUE DEBE TENER PREPARADAS Solución de trabajo del tampón de dilución Diluya el tampón de dilución concentrado (5X) (Componente 3) en agua desmineralizada. Estabilidad de la solución de trabajo del tampón de dilución: 5 horas a 22±3°C. Suero equino 1 Reconstituya el suero equino (Componente 6) con 6 ml de agua desmineralizada (Componente 5). Guarde el suero equino reconstituido a -20°C y homogenice bien después de descongelar. Tampón de ELISA Agregue suero equino reconstituido a la solución de trabajo del tampón de dilución hasta lograr una concentración final del 4%. Agregue 400 µl de suero equino a 9,6 ml de la solución de trabajo del tampón de dilución. El tampón de ELISA puede almacenarse hasta 4 horas a 22±3°C. Antígeno 1 Reconstituya el antígeno (Componente 7) con 10 ml tampón de ELISA. Para un uso parcial del kit, debe separar el antígeno reconstituido en alícuotas de 1,6 ml (para un máximo de 6 ciclos de ensayo por placa). Evite los ciclos de congelado y descongelado y guarde las alícuotas en viales pequeños a -20°C. Dilución del Conjugado Diluya del conjugado (30X) (Componente 2) 1/30 en tampón de ELISA. Prepare 1,8 ml para realizar un ensayo con dos tiras. Nota: debe preparar la dilución de trabajo justo antes de usarla. Sueros de referencia 1 Reconstituya los sueros (Componentes 8, 9 y 10) con 250 µl agua desmineralizada (Componente 5). 1 - La reconstitución de reactivos liofilizados debe hacerse del siguiente modo: Equilibre los viales a temperatura ambiente (22±3°C). Con el vial en posición vertical, dé suavemente unos golpecitos contra la mesa para asegurarse de que el contenido esté en el fondo del vial. Abra el vial. Agregue la cantidad necesaria de agua desmineralizada. Deje que el material liofilizado se disuelva. Cambie el tapón del vial y gire con cuidado el vial de modo que el material seco que quede se disuelva. Deje el material liofilizado en reposo a 22±3°C d urante 15 minutos. Invierta el vial con cuidado de vez en cuando (debe evitar la formación de espuma).  PrioCHECK® BRSV Ab Después de la reconstitución de los sueros de referencia, se recomienda preparar alícuotas de 20 µl. Evite los ciclos de congelado y descongelado y guarde las alícuotas en viales pequeños a -20°C. Líquido de lavado El líquido de lavado (200X) (Componente 4) debe diluirse 1/200 en agua desmineralizada y es suficiente para un volumen final de 12 litros. Estabilidad de la solución de lavado: 1 semana a temperatura ambiente (22±3°C). Nota: Se pueden utilizar lavadores ELISA comerciales. Si no tiene uno a su disposición, puede lavar las placas agregando 250–300 µl de líquido de lavado a todos los pocillos (No es necesario empapar la placa). Después, vacíe la placa y repita el proceso las veces necesarias. Golpee bien la placa invertida sobre papel absorbente después del último lavado. PREPARACIÓN DE LAS DILUCIONES DEL SUERO 1.1 Realice una dilución 1:80 de los sueros de referencia 1, 2 y 3 y de las muestras suero del ensayo mezclando 10 µl de suero con 790 µl de tampón de ELISA. INCUBACIÓN DEL ANTÍGENO 2.1 2.2 2.3 2.4 Rotule cada placa de ensayo (Componente 1) con un marcador indeleble. (Se necesita una placa para 11 muestras tituladas). Agregue 100 µl de tampón de ELISA a pocillos de la fila A, con excepción del pocillo A1. Los pocillos de la fila A son los pocillos de referencia. Agregue 100 µl de antígeno al resto de los pocillos. Tape la placa e incúbela durante 60±5 minutos a 37±1°C. INCUBACIÓN DE LAS MUESTRAS 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.7 3.8 Vacíe la placa y lávela 6 veces con 200 a 300 µl de solución de lavado. No es necesario empapar los pocillos con solución de lavado. Golpee bien la placa después del último lavado. Agregue 100 µl de tampón de ELISA a los pocillos A1 y B1 (= blanco). Agregue 100 µl de suero de referencia 1 diluido 1:80, a los pocillos C1 y D1. Agregue 100 µl de suero de referencia 2 diluido 1:80, a los pocillos E1 y F1. Agregue 100 µl de suero de referencia 3 diluido 1:80, a los pocillos G1 y H1. Agregue 100 µl de tampón de ELISA a los pocillos C2 a H12. Agregue 100 µl de muestra, diluida 1:80, a los pocillos A2 y B2. Después, realice diluciones seriadas al medio de las muestras: en el pocillo C2: 1:160 = 100 µl 1:80 + 100 µl de tampón de ELISA. en el pocillo D2: 1:320 = 100 µl 1:160 + 100 µl de tampón de ELISA. en el pocillo E2: 1:640 = 100 µl 1:320 + 100 µl de tampón de ELISA. hasta el pocillo H2. La dilución final es 1:5120 Quite 100 µl del pocillo H2 y descártelos. Agregue 100 µl de las muestras, diluidas 1:80, al resto de pocillos de las filas A, B y C de la placa de ensayo y realice titulaciones del mismo modo que con la primera muestra. Tape e incube la placa 60±5 minutos a 37±1°C. INCUBACIÓN CON EL CONJUGADO 4.1 4.2 4.3 Vacíe la placa después del periodo de incubación y lávela 6 veces con solución de lavado como se describe en el punto 3.1. Agregue 100 µl de conjugado diluido a todos los pocillos. Selle e incube la placa de ensayo 45 minutos a 37 °C. INCUBACIÓN CON EL SUSTRATO CROMÓGENO 5.1 Vacíe la placa después del periodo de incubación y lávela 6 veces con 200 a 300 µl de solución de lavado. No es necesario empapar los pocillos con solución de lavado. Golpee bien la placa después del último lavado. 5.2 Agregue 100 µl de sustrato cromógeno (TMB) (Componente 11) a cada pocillo. 5.3 Incube la placa de ensayo 15 minutos a temperatura ambiente (22±3°C). 5.4 Agregue 100 µl de solución de frenado (Componente 12) a cada pocillo. 5.5 Mezcle el contenido de los pocillos. Nota: Inicie la adición de solución de frenado 15 minutos después de haber llenado el primer pocillo con sustrato cromógeno (TMB). Agregue la solución de frenado en el mismo orden y al mismo ritmo que la solución de sustrato cromógeno (TMB). LECTURA DEL ENSAYO Y CÁLCULO DE LOS RESULTADOS 6.1 6.2 6.3 Mida la densidad óptica (DO) de los pocillos a 450 nm, antes de que pasen 15 minutos desde que agregó la solución de frenado. Calcule la media de la DO450 del blanco (pocillos A1 y B1). Calcule la DO450 corregida de cada muestra de suero (o dilución de suero) restando la media de la DO450 del blanco. Calcule la media de la DO450 de los sueros de referencia. El porcentaje de positividad (PP) se expresa como la DO450 corregida de las muestras sobre la DO450 corregida de la dilución 1:80 del control positivo (pocillos C1 y D1). PP = DO450 corregida de la muestra del ensayo -----------------------------------------------------------DO450 corregida de la referencia 1 x 100 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Criterios de validación 7.1 La media de la DO450 del blanco (pocillos A1 y B1) debe ser > 0,300. 7.2 La DO450 corregida del suero de referencia 1 (=control positivo), diluido 1:80 (pocillos C1 y D1) debe ser ≥1,000. 7.3 La media del PP del suero de referencia 3 (=control positivo débil) debe ser positiva. 7.4 La media del PP del suero de referencia 2 (=control negativo) debe ser negativa. 7.5 Las muestras que tengan una reacción positiva en el pocillo de control de suero (fila A) deben evaluarse como se indica a continuación. Una muestra reacciona de forma no específica con la ELISA con Ac BRSV cuando el PP del pocillo de control es >30% y el PP de la muestra diluida 1:80 es inferior a 2 veces (< 2x) al PP del pocillo de control correspondiente. 7.6 El incumplimiento de estos criterios es motivo suficiente para descartar los resultados de una placa específica. Nota: si la DO450 corregida del suero de referencia 1 es inferior a 1,000, es posible que la solución de sustrato cromógeno (TMB) se encuentre demasiado fría. En ese caso, caliente la solución hasta 22±3°C o incube durante 30 minutos. Si la DO450 corregida del suero de referencia 1 es superior a 2,000, se recomienda un periodo de incubación más corto con la solución de sustrato cromógeno (TMB). Interpretación del porcentaje de positividad PP = < 15% La muestra no contiene anticuerpos específicos contra BRSV. PP = ≥15% La muestra contiene anticuerpos específicos contra BRSV. Anexo I Nota informativa Este manual se considera completo y correcto en el momento de su publicación. Prionics AG no asume ninguna responsabilidad por incidencias o daños relacionados por el uso de este manual Responsabilidad Prionics AG garantiza que sus productos cumplen las correspondientes especificaciones publicadas, siempre que se usen de acuerdo con las instrucciones correspondientes que sean del caso y dentro de la fecha de caducidad de los productos. Prionics AG no da ninguna otra garantía, explícita o implícita. No hay ninguna garantía de comercialidad o idoneidad para un uso particular. La garantía aquí ofrecida y los datos, especificaciones y descripciones de los productos Prionics AG que aparecen en catálogos de Prionics AG impresos y en la bibliografía sobre los productos no pueden ser modificados salvo tras acuerdo escrito explícito firmado por un representante autorizado de Prionics AG. Cualquier reproducción oral o escrita en contradicción con esta garantía o con dichas publicaciones no está autorizada y Prionics no se hace responsable. En caso de incumplimiento de la garantía susodicha, la única obligación de Prionics AG consistirá, a su elección, en reparar o remplazar el producto en cuestión o parte del mismo, siempre que el cliente notifique el incumplimiento a Prionics AG sin demora. Si, tras esfuerzos razonables, Prionics AG resulta incapaz de reparar o restituir el producto o parte del mismo, entonces Prionics AG restituirá al cliente todos los efectivos pagados por el producto o la parte en cuestión. Prionics AG no asume ninguna responsabilidad por daños indirectos fortuitos, consiguientes, especiales o de cualquier otro tipo que resulten de pérdidas económicas o daños a la propiedad sufridos por cualquier cliente como consecuencia del uso de sus productos. Prionics AG y Prionics Lelystad B.V. son empresas certificadas ISO 9001:2000. Anexo II Normas y declaraciones de seguridad Se deben seguir estrictamente las normas nacionales de seguridad. Componente 1 Placa de ensayo Código de riesgo: este producto no está clasificado según las normas de la UE. Componente 2 Conjugado (30x) Código de riesgo: este producto no está clasificado según las normas de la UE. Componente 3 Tampón de dilución (listo para usar) Código de riesgo: este producto no está clasificado según las normas de la UE. Componente 4 Líquido de lavado (200X) Código de riesgo: este producto no está clasificado según las normas de la UE. Componente 5 Agua desmineralizada Código de riesgo: este producto no está clasificado según las normas de la UE. Componente 6 Suero equino (liofilizado) Código de riesgo: este producto no está clasificado según las normas de la UE. Componente 7 Antígeno (liofilizado) Código de riesgo: este producto no está clasificado según las normas de la UE. Componente 8 Suero de referencia 1 (liofilizado) Código de riesgo: este producto no está clasificado según las normas de la UE. Componente 9 Suero de referencia 2 (liofilizado) Código de riesgo: este producto no está clasificado según las normas de la UE. Componente 10 Suero de referencia 3 (liofilizado) Código de riesgo: este producto no está clasificado según las normas de la UE. Componente 11 Sustrato Cromógeno (TMB) (listo para usar) Código de riesgo: este producto no está clasificado según las normas de la UE. Componente 12 Solución de frenado (listo para usar) Código de riesgo: R35: provoca quemaduras graves. S26: en caso de contacto con los ojos, lávese inmediata y abundantemente con agua y acuda a un médico. S36/37/39: utilice indumentaria y guantes adecuados y protección para los ojos/la cara. S45: en caso de accidente o malestar, acuda inmediatamente al médico (si es posible, muéstrele la etiqueta). Anexo III Bibliografía (1) Paccaud MF and Jacquier Cl. Arch. für die gesamte Virusforschung. 30, 327-342, 1970. (2) Collins PL. Plenum Press, New York, p. 103-162. (3) Westenbrink F, Brinkhof JMA, Straver PJ, Quak J and de Leeuw PW. Research in Vet. Sci. 38, 334-340, 1985. (4) Martin SW, Shoukri M and Thorburn MA. Preventive Vet. Med. 14, 33-43, 1992. (5) Van der Poel WHM, Kramps JA, Middel WGJ, Van Oirschot JT and Brand A. Arch. Virol. 133, 309-321, 1993. (6) Schrijver RS. Thesis 1997 (ISBN 90-393-1499-3). (7) Van der Poel WHM. J. of Infection. 29, 215-228, 1994. Contacto [email protected] Para ver nuestra red de distribuidores, por favor, visite www.prionics.com