Thermo Fisher Scientific PrioCHECK CSFV Ag whole blood serum plasma tissue pig 7610050 ES Guía del usuario

Marca: Thermo Fisher Scientific

Modelo: PrioCHECK CSFV Ag whole blood serum plasma tissue pig 7610050 ES

Tipo: Guía del usuario

PrioCHECK® CSFV Ag

ELISA para detección in vitro de antígeno del virus de la peste porcina clásica en sangre, suero, plasma y

muestras de tejido de cerdos

5 placas para 450 muestras

©Prionics AG

Versión 1.0_es

Sólo para diagnóstico in Vitro en uso veterinario

Guardar a 5±3°C

Nº de producto 7610050

Introducción

La detección temprana de cerdos infectados con

CSFV es de gran importancia para contener la

diseminación del virus. El diagnostico precoz del

ganado infectado se realiza mediante la detección de

antígeno del CSFV en lugar de anticuerpos, ya que

estos aparecen a partir de los 14 días posteriores a la

infección.

PrioCHECK® CSFV Ag es una valiosa herramienta

para aumentar la certeza en el diagnóstico de CSFV.

El test brinda la máxima sensibilidad posible,

minimizando la posibilidad de falsos positivos (alta

especificidad y selectividad). PrioCHECK® CSFV Ag

se puede utilizar en relevamientos de hatos en lo que

sospecha infección por CSFV. En países (áreas)

endémicos para CSF en los que se administra una

vacunación, el ensayo se puede usar para trazar focos

residuales de CSFV. Los resultados positivos de un

ensayo se confirman con una prueba considerada de

referencia “gold standard” (Ej., aislamiento del virus en

un cultivo celular).

Principio del ensayo

PrioCHECK® CSFV Ag se basa en el principio del

sándwich de doble anticuerpo (DAS, por sus siglas en

inglés). Se han recubierto tiras de ocho pocillos con

anticuerpos específicos contra CSFV. En el primer

paso, se añaden a los pocillos el diluyente, la muestra

(sangre, suero, plasma, concentrado de leucocitos o

un extracto de tejido) y se incuba. En segundo lugar,

se lavan las tiras y se coloca en los pocillos el

anticuerpo monoclonal conjugado anti-CSFV de gran

especificidad. Después del periodo de incubación, se

lavan las tiras y se visualiza el conjugado unido

seguido de otra incubación con el sustrato cromógeno

(TMB). Luego de la adición de la solución de frenado,

se termina la reacción. La presencia de antígenos del

virus de la peste porcina clásica la determina el

desarrollo del color medido a una longitud de onda de

450 nm.

Componentes del kit

Conserve el kit a 5±3°C hasta su fecha de

vencimiento. Consulte la etiqueta del kit para ver la

fecha de caducidad real. La vida útil de los

componentes diluidos, abiertos o reconstituidos

aparece a continuación. Tiene a su disposición los

datos sobre los riesgos químicos en la sección

"Normas de seguridad y declaraciones de I+S"

(Apéndice II).

Componente 1

Placa del ensayo

Cingo placas de ensayo tipo tira.

Componente 2

Conjugado (30x)

(Concentrado 30X, diluir antes de usar). Un vial con

2,2 ml de conjugado.

El conjugado diluido no es estable, prepárelo

inmediatamente antes de su utilización.

Componente 3

Tampón de dilución (listo para usar)

Un vial contiene 60 ml de tampón de dilución.

Componente 4

Aditivo para el conjugado (listo para usar)

Un vial con 12,0 ml de aditivo conjugado.

Componente 5

Agua desmineralizada

Un vial con 10 ml de agua desmineralizada.

Componente 6

Líquido de lavado (200X)

(Concentrado 200X, diluir antes de usar). Un vial

contiene 60 ml de líquido de lavado.

Vida media de la solución de lavado: 1 semana a

22±3°C.

Componente 7

Diluyente de muestra (listo para usar)

Tres viales con 10 ml de diluyente de muestra.

Componente 8

Suero de referencia 1 (liofilizado)

Un vial con 1,5 ml de suero de referencia 1 (control

positivo concentrado).

Vida media del suero de referencia 1 reconstituido:

Hasta su fecha de vencimiento a -20°C.

Componente 9

Suero de referencia 2 (liofilizado)

Un vial con 1,5 ml de suero de referencia 2 (blanco).

Vida media del suero de referencia 2 reconstituido:

Hasta su fecha de vencimiento a -20°C.

Componente 10

Suero de referencia 3 (liofilizado)

Un vial con 1,5 ml de suero de referencia 3 (control

positivo débil).

Vida media del suero de referencia 3 reconstituido:

Hasta su fecha de vencimiento a -20°C.

Componente 11

Cromógeno (TMB) sustrato (listo para usar)

Un vial con 60 ml de cromógeno (TMB) sustrato.

Componente 12

Solución de frenado (listo para usar)

Un vial que contiene 60 ml de tampón de solución de

frenado.

Contenido adicional del kit:

- 10 selladores de placas

- Instrucciones de uso

- Certificado de análisis

Material necesario adicional

General:

Equipo de laboratorio según las normas de seguridad

nacionales.

Análisis de los resultados:

Lector de placas, p. ej., Multiscan EX o equivalente.

El lector tiene que tener un filtro apropiado para leer

placas a 450 nm.

Opcional:

Lavador de placas p. Ej., Tecan EIA Tray

Washer o equivalente.

Procedimiento del ensayo

Precauciones

Deben seguirse estrictamente todas las disposiciones

nacionales cuando se trabaja con muestras de

animales. PrioCHECK® CSFV Ag debe usarse en

laboratorios adecuados para este propósito.

Las muestras tienen que considerarse siempre como

potencialmente infecciosas; mientras que aquellos

objetos que entren en contacto con las muestras,

deben manejarse como potencialmente contaminados.

Para la descontaminación se puede usar halamid

(1%), hidróxido de sodio (0,4%) o glutaraldehído (1%)

(reducción de 4-5 unidades logarítmicas de CSFV en 6

minutos).

Debe mantenerse la esterilidad de las muestras para

posibilitar la posterior confirmación en el ensayo

de aislamiento del virus.

Tiene a su disposición los de los riesgos químicos en

la sección "Normas de seguridad y declaraciones de

I+S" (Apéndice II).

Notas

Para lograr resultados óptimos con la tira PrioCHECK®

CSFV Ag, debe tenerse en cuenta lo siguiente:

 Hay que seguir estrictamente el protocolo del

ensayo.

 Todos los reactivos del kit deben equilibrarse a

temperatura ambiente (22±3°C) antes de usarse.

 Las puntas de las pipetas deben cambiarse

luego de cada uso.

 Coloque cada reactivo en un recipiente diferente.

 Los componentes del kit no deben utilizarse si se

observan cambios en su aspecto, o tras su fecha

de vencimiento.

 No hay que utilizar componentes con distinto

número de lote al mismo tiempo.

 Se debe usar agua desmineralizada para el

ensayo.

SOLUCIONES QUE DEBE TENER PREPARADAS

Referencias

Reconstituya∗ las referencias (Componente 8 – 10) con

1.5 ml agua desmineralizada (Componente 5).

Después de reconstituir las muestras de referencia

liofilizadas debe alicuotarlas en viales pequeños y

guardarlas a -20 °C hasta su fecha de vencimiento. El

número de alícuotas depende del número de ensayos

que se desee realizar (máx. 12 ensayos

independientes).

Dilución del Conjugado

Diluya el conjugado (30X) (Componente 2) en el

tampón de dilución (componente 3). Prepare la

dilución del conjugado (30x) (Componente 2) en

tampón de dilución (Componente 3) con un 20% (v/v)

de aditivo para el conjugado. Por ejemplo, para

realizar un ensayo con una placa prepare 12 ml de

conjugado diluido (agregue 2,4 ml de aditivo

conjugado a 9,2 ml de tampón de dilución. Después,

agregue 400 µl de conjugado concentrado (30x)).

Líquido de lavado

El líquido de lavado (Componente 6) debe diluirse

1/200 en agua desmineralizada y es suficiente para un

volumen final de 12 litros.

Se puede mantener estable durante 1 semana a

22±3°C.

Nota: El lavado de los pocillos después de la incubación es

crítico. Si se registra una densidad óptica blanca (DO de

referencia 2) >0,300, es probable que se los pocillos no estén

correctamente lavados. Los mismos tienen que lavarse

manualmente al menos 6 veces. Para ello, añada 300 µl de

solución de lavado a cada pocillo, vacíelos con cuidado dando

golpecitos y vuelva a llenarlos. Evite la formación de burbujas

de aire cuando los llene. Elimine cualquier residuo que pueda

quedar luego del último lavado golpeando a las placas

invertidas sobre papel absorbente. Si utiliza lavadores

automáticos y obtiene valores de DO blanco >0,300, lave

manualmente como se indica anteriormente.

Nota: consulte el apéndice IV para ver el

procedimiento de preparación de muestras y su

almacenamiento

INCUBACIÓN DEL SUERO Y DE LA MUESTRA

1.1 Etiquete cada tira (Componente 1) de ensayo

con un bolígrafo indeleble.

1.2 Agregue 50 µl de diluyente de muestra

(Componente 7) a todos los pocillos.

1.3 Agregue 50 µl del suero de referencia 1

reconstituido a los pocillos A1 y B1.

1.4 Agregue 50 µl de suero de referencia 2

reconstituido a los pocillos C1 y D1.

∗La reconstitución de ingredientes liofilizados debe hacerse del siguiente

modo:

- Equilibre el vial a 22±3°C.

- Con el vial en posición vertical, dé golpecitos suaves contra la mesa

para asegurarse de que el contenido esté en el fondo del vial.

- Abra el vial.

- Agregue la cantidad de agua desmineralizada necesaria (véase la

etiqueta del vial).

- Cambie el tapón del vial y deje que el material liofilizado se disuelva.

- Agite suavemente de modo que el material seco se disuelva.

- Deje el material liofilizado en reposo a 22±3°C durante 15 minutos.

- Invierta con cuidado de vez en cuando el vial (debe evitar la

formación de espuma).

Instrucciones de uso

PrioCHECK

CSFV Ag

1.5 Agregue 50 µl de suero de referencia 3

reconstituido a los pocillos E1 y F1.

1.6 Agregue 50 µl de muestra al resto de los

pocillos.

1.7 Selle las placas con sellador y agite las placas

con cuidado.

1.8 Incube durante 180±5 minutos a 22±3°C.

Nota: Al añadir muestras de sangre entera, asegúrese

de no dejar ningún resto en la punta de la pipeta.

INCUBACIÓN CON EL CONJUGADO

2.1 Lave las tiras del ensayo 6 veces con 300 µl de

solución de lavado en cada pocillo. Golpee bien

la placa después del último ciclo de lavado.

Nota: No debe quedar ningún residuo en los pocillos,

2.2 Agregue 100 µl de dilución de conjugado a cada

pocillo

2.3 Selle la placas con sellador.

2.4 Incube durante 60±5 minutos a 22±3°C.

INCUBACIÓN CON LA SOLUCIÓN DE SUSTRATO

CROMÓGENO (TMB)

3.1 Lave la placa 6 veces con 300 µl de solución de

lavado en cada pocillo. Seque bien las placas

(invertidas sobre papel absorbente) luego del

último ciclo de lavado.

3.2 Agregue 100 µl de sustrato cromógeno (TMB)

(Componente 11) a todos los pocillos.

3.3 Incube durante 15 minutos a 22±3°C. No agite.

3.4 Agregue 100 µl de solución de frenado

(Componente 12).

3.5 Mezcle el contenido de los pocillos de la placa.

Nota: Agregue la solución de frenado 15 minutos

después de haber llenado el primer pocillo con la

solución de sustrato cromógeno (TMB).

Añada la solución de frenado en el mismo orden y

lugar que la solución de sustrato cromógeno (TMB).

LECTURA DEL ENSAYO Y CÁLCULO DE LOS

RESULTADOS

4.1 Mida la densidad óptica (DO) de los pocillos a

450 nm, antes de que pasen 15 minutos desde

que el desarrollo de color se detenga.

4.2 Calcule la DO450 media de los pocillos C1 y D1

(referencia 2 = DO450 blanco).

4.3 Calcule la DO450 corregida de la Referencia 1 y

de todas las muestras, restando la DO450 blanco

a la DO450 de la muestra.

4.4 La positividad porcentual (PP) de la referencia 3

y de las muestras se calcula según la

siguiente fórmula:

Los valores de DO450 corregidos de todas las muestras

se expresan como la positividad relativa (PP) con

relación al valor de la DO450 media corregida de la

referencia 1.

450

corregida de la muestra

PP = -------------------------------------------- x 100

450

corregida de la referencia 1

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Criterios de validación

5.1 La DO450 de la referencia 2 debe ser <0,350.

5.2 La DO450 corregida de la referencia 1 debe ser

0,750.

5.3 La PP de la referencia 3 debe ser >20%.

Nota: Si no se cumplen estos criterios, debe descartar

los resultados del ensayo.

Nota: Si la DO450 media corregida de la referencia 1

es inferior a 0,750, es posible que la solución de

sustrato cromógeno (TMB) esté demasiado fría. En

ese caso, lleve la solución hasta 22±3°C o incube

durante 30 minutos. Si la DO450 media corregida de la

referencia 1 es superior a 2,000, se recomienda un

periodo de incubación más corto con la solución de

sustrato cromógeno (TMB).

Interpretación de la inhibición porcentual

PP = < 15% Negativo

La muestra no presenta antigenos (detectables) contra

CSFV.

PP = ≥15% Positivo

La muestra contiene antigenos contra CSFV.

La presencia de CSFV en muestras de que han dado

positivo para el antígeno debe confirmarse con un

aislamiento del virus.

Apéndice I

Nota informativa

Este manual se considera completo y correcto en el momento

de su publicación. Prionics AG no asume ninguna

responsabilidad por daños fortuitos o consiguientes en relación

con o tras el uso de este manual.

Responsabilidad

Prionics AG garantiza que sus productos cumplen las

correspondientes especificaciones publicadas, siempre que se

usen de acuerdo con las instrucciones correspondientes que

sean del caso y dentro de la fecha de caducidad de los

productos. Prionics AG no da ninguna otra garantía, explícita o

implícita. No hay ninguna garantía de comercialidad o idoneidad

para un uso particular. La garantía aquí ofrecida y los datos,

especificaciones y descripciones de los productos Prionics AG

que aparecen en catálogos de Prionics AG impresos y en la

bibliografía sobre los productos no pueden ser modificados

salvo tras acuerdo escrito explícito firmado por un representante

autorizado de Prionics AG. Cualquier representación oral o

escrita en contradicción con esta garantía o con dichas

publicaciones no está autorizada y, si ha sido dada no es de

fiar.

En caso de incumplimiento de la garantía susodicha, la única

obligación de Prionics AG consistirá, a su elección, en reparar o

remplazar el producto en cuestión o parte del mismo, siempre

que el cliente notifique el incumplimiento a Prionics AG sin

demora. Si, tras esfuerzos razonables, Prionics AG resulta

incapaz de reparar o restituir el producto o parte del mismo,

entonces Prionics AG restituirá al cliente todos los efectivos

pagados por el producto o la parte en cuestión.

Prionics AG no asume ninguna responsabilidad por daños

indirectos fortuitos, consiguientes, especiales o de cualquier

otro tipo que resulten de pérdidas económicas o daños a la

propiedad sufridos por cualquier cliente como consecuencia del

uso de sus productos.

Prionics AG y Prionics Lelystad BV son empresas certificadas

ISO 9001:2000.

Apéndice II

Normas de seguridad y declaraciones de I+S

Deben seguirse estrictamente todas las normas de

seguridad nacionales.

Componente 1

Placa del ensayo