Thermo Fisher Scientific PrioCHECK Bovine BVDV PI focus Ag Strip Kit Instrucciones de operación

Marca
Thermo Fisher Scientific
Modelo
PrioCHECK Bovine BVDV PI focus Ag Strip Kit
Tipo
Instrucciones de operación
Sólo para uso veterinario. Sólo para uso In Vitro.
INSTRUCCIONES DE USO
PrioCHECK™ Bovine BVDV PI focus Ag Strip Kit
ELISA para la detección
in vitro
del antígeno del virus de la diarrea viral bovina en cortes de tejido auricular de ganado bovino
Número de Catálogo 7610140
N.º de Pub. MAN0013849 Rev.
A.0
¡ADVERTENCIA! Lea las hojas de datos de seguridad (SDS) y siga las instrucciones de manipulación. Lleve el equipo de protección individual
(EPI) adecuado (gafas, ropa, guantes). Las hojas de datos de seguridad (SDS) se encuentran disponibles en thermofisher.com/support.
¡ADVERTENCIA! POSIBLE RIESGO BIOLÓGICO. Lea la información sobre seguridad frente a los riesgos biológicos en la página de este producto
en thermofisher.com. Lleve el equipo de protección individual (EPI) adecuado (gafas, ropa, y guantes)
Introducción
Las infecciones por el virus de la diarrea viral bovina (BVDV) provocan enormes pérdidas económicas anuales a la industria del ganado bovino. Además, el
BVDV tiene también un impacto negativo sobre el bienestar de los animales.
Applied Biosystems™ PrioCHECK™ Bovine BVDV PI focus Ag Strip Kit está específicamente diseñado para la detección de animales con infección
persistente (IP). Esta prueba altamente especifica detecta diferentes subtipos del antígeno del BVDV (Ia, Ib, y II) en muestras de tejido auricular procedentes
de ganado bovino.
La prueba PrioCHECK™ Bovine BVDV PI focus Ag Strip Kit puede usarse para diagnosticar infecciones persistentes de BVDV en animales individuales.
Además, la prueba es una valiosa herramienta en programas de detección precoz a gran escala y programas de erradicación.
Los datos de validación muestran que la presencia de anticuerpos maternos en muestras de tejido, auricular puede alterar el resultado de Ag (efecto pantalla).
Como consecuencia, los ensayos de ELISA pueden mostrar una sensibilidad incompleta para animales con infección persistente (IP). Por lo tanto, se recomienda
un control adicional sobre la presencia de anticuerpos anti BVDV en muestras de tejido de oreja de animales bajo la influencia de anticuerpos maternos.
Principio del ensayo
PrioCHECK™ Bovine BVDV PI focus Ag Strip Kit
ELISA emplea dos anticuerpos monoclonales
(AcM). Los dos AcM reconocen diferentes
determinantes antigénicos localizados en la
proteína (p80) no estructural NS−3 altamente
conservada del BVDV. La placa se recubre con
estos anticuerpos y se usa el segundo AcM como
conjugado. Para la detección de antígenos, las
muestras de tejido auricular sin diluir se incuban
simultáneamente con tampón en los pocillos de la placa recubierta. Después de este paso de
incubación viene otro de lavado. Posteriormente, se agrega la dilución de trabajo del conjugado
(peroxidasa) y tras un periodo de incubación se somete a un segundo paso de lavado. En el
siguiente paso se adicional el sustrato cromógeno (TMB) a los pocillo y después de incubar se
detiene el desarrollo de color y se mide la densidad óptica a 450 nm.
Durante el primer periodo de incubación, los antígenos del BVDV presentes en la muestra se unirán a
los anticuerpos monoclonales específicos contra el BVDV fijados a la placa. Después, se lavan las placas
y se incuban con otro anticuerpo monoclonal específico contra el BVDV conjugado con peroxidasa
(AcM contra otro sitio antigénico de NS−3). Finalmente, el conjugado unido y por lo tanto los
antígenos de BVDV de la muestra de la prueba se visualizan añadiendo el sustrato cromógeno (TMB).
En el caso de una muestra positiva, se desarrollará color. En el caso de una muestra negativa, no habrá
desarrollo de color.
Componentes del kit
Kit de 10 placas para 900 muestras. Conserve el kit refrigerado (5±3°C) hasta la fecha de
vencimiento. Consulte la etiqueta del kit para ver la fecha de caducidad real. La vida útil de los
componentes diluidos, abiertos o reconstituidos aparece a continuación, cuando corresponda.
Componente
Descripción
1: Placa del ensayo
Diez placas de ensayo, formato tipo tira.
2:Tampón de extracción
Listo para usar. Cuatro viales, cada uno con 60 mL de tampón de extracción.
3: Aditivo de tampón de
extracción
Liofilizado. Cuatro viales, cada uno con 60 mL de Aditivo de tampón de
extracción para un vial tampón de extracción. Vida útil de solución tampón de
extracción: 1 (un) mes a 5±3°C.
4: Conjugado (30x)
Dos viales, cada uno con 2.5 ml de conjugado. El conjugado diluido no es
estable, debe prepararlo justo antes de su uso.
5: Tampón de conjugado
Listo para usar. Dos viales, cada uno con 60 mL de tampón de conjugado.
6: Tampón de dilución
Listo para usar. Dos viales, cada uno con 60 mL de tampón de dilución.
7: Líquido de lavado (200x)
Concentrado 200x, diluir antes de usar. Un vial contiene 60 mL de líquido de
lavado. Vida útil de la solución de lavado: 1 semana a 22±3°C.
8: Referencia 1
Liofilizado. Un vial contiene 2.0 mL de referencia 1. Vida útil de la referencia 1
reconstituida: hasta la fecha de caducidad a −20°C.
9: Referencia 2
Liofilizado. Un vial contiene 2.0 mL de referencia 2. Vida útil de la referencia 2
reconstituida: hasta la fecha de caducidad a −20°C.
10: Referencia 3
Liofilizado. Un vial contiene 2.0 mL de referencia 3. Vida útil de la referencia 3
reconstituida: hasta la fecha de caducidad a −20°C.
11: Sustrato cromógeno
(TMB)
Listo para usar. Dos viales, cada uno con 60 mL de sustrato cromógeno (TMB).
12: Solución de frenado
Listo para usar. Dos viales, cada uno con 60 mL de solución de frenado.
Contenido adicional del kit
• Instrucciones de uso
• 20 Selladores de placas para cubrir las tiras durante la incubación
2 PrioCHECK™ Bovine BVDV PI focus Ag Strip Kit Instrucciones de Uso
Material necesario adicional
Uso
Descripción
(1)
General
Equipo de laboratorio según las normas de seguridad
nacionales.
Análisis de los
resultados
Lector de placas. El lector tiene que tener un filtro apropiado
para leer placas a 450 nm.
Opcional
Lavador de placas. Manipulador de líquidos.
(1) A menos que se indique lo contrario, todos los materiales están disponibles en
thermofisher.com.
Procedimiento del ensayo
Precauciones
• Se deben seguir estrictamente las normas nacionales de seguridad.
• PrioCHECK™ Bovine BVDV PI focus Ag Strip Kit usarse en laboratorios
adecuados para este propósito.
• Las muestras deben ser consideradas como potencialmente infecciosas
y todos los objetos que entren en contacto con las muestras como
potencialmente contaminados.
Notas
Para lograr unos resultados óptimos con PrioCHECK™ Bovine BVDV PI
focus Ag Strip Kit, debe tener en cuenta los siguientes aspectos:
• Hay que seguir estrictamente el protocolo del ensayo.
• Todos los reactivos del kit deben equilibrarse a temperatura ambiente
(22±3°C) antes de usarse.
• Se deben cambiar las puntas de las pipetas después de cada pipeteo.
• Hay que usar recipientes independientes para cada reactivo.
• Los componentes del kit no deben ser utilizados luego la fecha de
caducidad o si se observan cambios en su aspecto.
• No deben utilizarse juntos componentes de kits con números de lote
diferentes.
• Se debe usar agua desmineralizada o de igual calidad para el ensayo.
• Sólo se deben analizar muestras de cortes de tejido de bien conservadas
por desecación. No se deben usar tejidos macerados.
Soluciones a preparar previamente para la extracción de las
muestras a analizar
Solución Tampón de Extracción
Equilibre los viales a 22±3°C y reconstituya el Aditivo del Tampón de
Extracción (Componente 3) con Tampón de Extracción (Componente 2).
Agregar el contenido entero de un vial del aditivo del tampón de extracción
a un vial del Tampón de Extracción.
La estabilidad de la Solución Tampón de Extracción es de 1 (un) mes a 5±3°C.
Pasos previos
1. Transfiera la muestra de corte de oreja desde el recipiente para
muestras a una placa de pocillos profundos.
2. Agregue 200 µL de tampón de extracción (componente 2) a la placa de
pocillos profundos.
3. Incube durante toda la noche (12 a 18 horas) a 22±3°C.
Soluciones que debe preparar
Dilución de conjugado
Diluya el conjugado (30x) (componente 4) 1:30 en tampón de conjugado
(componente 5), p. ej., para 2 tiras, prepare 12 mL (agregue 400 µL de
conjugado (30x) a 11.6 mL de tampón de conjugado).
Nota: Debe preparar el conjugado diluido justo antes de usarlo.
Solución de lavado
Diluya el líquido de lavado (200x) (componente 7) 1:200 en agua
desmineralizada. La cantidad de líquido de lavado es suficiente para
preparar un volumen final de 12 litros de solución de lavado.
Estabilidad de la solución de lavado: 1 semana guardada a 22±3°C.
Nota: Se pueden usar lavadores ELISA comerciales. Si no tiene uno a su
disposición, puede lavar las placas de ensayo agregando al menos 200 µL de
líquido de lavado a todos los pocillos de la placa. Después, vacíe la placa de
ensayo y repita el proceso las veces necesarias. No es preciso remojar la placa
de ensayo después de cada lavado. Después del último lavado seque bien los
pocillos golpeando la placa de ensayo invertida sobre papel absorbente.
Referencia 1–3
Equilibre los viales a 22±3°C y reconstituya la referencia 1–3
(componente 8–10) con 2.0 mL de tampón de dilución (componente 6). Las
referencias reconstituidas se pueden guardar en alícuotas de 150 µL a −20°C
hasta su fecha de caducidad.
La reconstitución del material liofilizado debe hacerse del siguiente modo:
1. Equilibre el vial a 22±3°C.
2. Con el vial en posición vertical, dé suavemente unos golpecitos contra
la mesa para asegurarse de que el contenido esté en el fondo del vial.
3. Abra con cuidado el vial.
4. Agregue la cantidad especificada de tampón de dilución (componente 7).
5. Tape el vial y deje que el material liofilizado se disuelva.
6. Agite suavemente de modo que el material que siga seco se disuelva.
7. Deje en reposo el material al menos durante 15 minutos a 22±3°C antes
de usar.
8. Invierta con cuidado el vial de modo intermitente (debe evitar la
formación de espuma).
Incubación de las muestras de la prueba
Detección del antígeno:
1. Rotule cada tira de la placa de ensayo (componente 1) con un bolígrafo
marcador.
2. Agregue 50 µL de tampón de dilución (componente 6) a todos los pocillos.
3. Agregue 50 µL de tampón de referencia 1 a los pocillos A1 y B1 (= DO máx).
4. Agregue 50 µL de tampón de referencia 2 a los pocillos C1 y D1.
5. Agregue 50 µL de tampón de referencia 3 a los pocillos E1 y F1
(= DO blanco).
6. Agregue 50 µL de las muestras de ensayo al resto de pocillos.
7. Selle la placa de ensayo y agítela con cuidado.
8. Incube durante 60±10 minutos a 22±3°C.
Incubación con el conjugado
1. Vacíe la placa de ensayo y lávela 6 veces con solución de lavado. Seque
bien las placas después del último ciclo de lavado.
2. Agregue 100 µL de conjugado diluido a todos los pocillos.
3. Selle la placa de ensayo.
4. Incube la placa de ensayo durante 60±10 minutos a 22±3°C.
Incubación con sustrato cromógeno (TMB)
1. Vacíe la placa de ensayo y lávela 6 veces con solución de lavado. Al
terminar el último lavado seque bien los pocillos golpeando la placa
invertida sobre papel absorbente.
2. Agregue 100 µL de sustrato cromógeno (TMB) (componente 11) a cada
pocillo.
3. Incube la placa de ensayo de 15 a 25 minutos a 22±3°C.
4. Agregue 100 µL de la solución de frenado (componente 12) a cada pocillo.
5. Mezcle el contenido de los pocillos de la placa de ensayo.
Nota: Inicie la adición de solución de frenado de 15 a 25 minutos después
de haber llenado el primer pocillo con sustrato cromógeno (TMB). Agregue
la solución de frenado en el mismo orden y al mismo ritmo que el sustrato
cromógeno.
Lectura del ensayo y cálculo de los resultados
1. Mida la densidad óptica (DO) de los pocillos a 450 nm, antes de que
pasen 20 minutos desde que se pare el desarrollo de color.
2. Calcule la DO450 media de los pocillos E1 y F1 (= DO blanco).
3. Calcule la DO450 corregida de todas las muestras restando la DO blanco.
4. Calcule la media de la DO450 corregida de los pocillos A1 y B1
(= DO máx corregida).
5. Calcule el positividad porcentual (PP) de la referencia 2 y de las
muestras del ensayo según la siguiente fórmula.
Nota: La DO450 corregida de todas las muestras se expresa como la
positividad porcentual (PP) relativa a la DO450 media corregida de los
pocillos A1 y B1 y (= DO máx corregida).
PP = (DO450 corregida de la muestra del ensayo / DOmáx corregida) × 100%
Interpretación del resultado
Criterios de validación de la prueba BVDV-Ag
1. La DO450 media de la referencia 3 (= DO blanco) debe ser ≤0.300.
2. La DO450 corregida de la referencia 1 debe ser ≥0.800.
3. El porcentaje de positividad de la referencia 2 debe estar entre el <30%.
El no cumplimiento de estos criterios es motivo suficiente para descartar los
resultados de un ensayo específico.
Nota: Si la DO450 corregida es inferior a 0.800, posiblemente el sustrato
cromógeno (TMB) esté demasiado frío. En ese caso, caliente previamente la
solución hasta 22±3°C o incube durante 30 minutos.
Interpretación de la prueba BVDV-Ag
PP = ≥20% Positivo
Hay antígeno de BVDV presente en la muestra del
ensayo.
PP = <20% Negativo
No hay ningún antígeno detectable presente en la
muestra del ensayo.
Nota: PrioCHECK™ Bovine BVDV PI focus Ag Strip Kit es una prueba muy
específica para la detección de animales con infección persistente. Sin
embargo, si existen dudas sobre el estado de un animal vivo positivo
valioso, repita la prueba con otra muestra tomada 2–3 semanas (ELISA) o 6
semanas (PCR/NASBA) después de haber cogido la muestra inicial para
confirmar la infección persistente.
thermofisher.com/support
thermofisher.com/askaquestion
thermofisher.com
01 octubre 2019
Asistencia al cliente y soporte técnico
Asistencia técnica: visite thermofisher.com/askaquestion
Visite thermofisher.com/support para conocer lo último en servicios y
asistencia, incluyendo lo siguiente:
• Números de teléfono de contacto de todo el mundo
• Pedidos y soporte web
• Guías de usuario, manuales y protocolos
• Certificados de análisis
• Fichas técnicas de seguridad (Safety Data Sheets, SDS; también
conocidas como MSDS)
NOTA: Para conocer las SDS de los reactivos y productos químicos de
otros fabricantes, póngase en contacto con el fabricante.
Garantía limitada del producto
Life Technologies Corporation y/o su(s) filiale(s) garantizan sus productos
tal y como se establece en los términos y condiciones generales de venta de
Life Technologies, que se pueden encontrar en el sitio web de
Life Technologies www.thermofisher.com/us/en/home/global/
terms-and-conditions. Si tiene alguna duda, póngase en contacto con
Life Technologies en thermofisher.com/support.
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