Thermo Fisher Scientific PrioCHECK Brucella Ab serum milk cattle sheep goat 7610400 ES Guía del usuario

Marca
Thermo Fisher Scientific
Modelo
PrioCHECK Brucella Ab serum milk cattle sheep goat 7610400 ES
Tipo
Guía del usuario
PrioCHECK® Brucella Ab
ELISA para la detección in vitro de anticuerpos contra Brucella abortus y Brucella melitensis en suero y leche
de bovinos, ovinos y caprinos
5 placas para 440 muestras
©Prionics AG
Versión 1.0_es
Sólo para diagnóstico in vitro en uso veterinario
Guardar de 5±3°C
Nº de producto 7610400
Introducción
La brucelosis es una enfermedad provocada por una
bacteria del género Brucella (un cocobacilo gram-
negativo) que se presenta en todo el mundo y afecta
tanto a humanos como a animales. Dicho género
comprende 6 especies: B. abortus (7 biovares), B.
melitensis (3 biovares), B. suis (5 biovares), B. ovis, B.
canis, B. neotomae y B. maris. B. abortus manifiesta
principalmente en el ganado bovino, mientras que B.
melitensis se observan en el ganado ovino y caprino.
Se han desarrollado muchos ensayos serológicos
para el diagnóstico rutinario de la brucelosis. Cual-
quiera sea el ensayo utilizado, hay que tener en
cuenta que pueden ocurrir reacciones cruzadas con
otras bacterias gram-negativas como Francisella
tularensis, Campylobacter, Salmonella, Pasteurella,
Yersinia enterocolitica 0:9 y Escherichia coli O:117 y
0:156
La infección con B. abortus o B. melitensis, induce la
aparición de anticuerpos específicos del tipo IgM
seguidos de anticuerpos del tipo IgG (IgG1 e IgG2).
PrioCHECK® Brucella Ab detecta anticuerpos del tipo
IgG1 en suero y leche y es una modificación del
ensayo descrito por Bercovich y col. (1990). El ensayo
cumple con los requisitos 64/432 de la Unión Europea
(UE). PrioCHECK® Brucella Ab se puede usado en
programas de vigilancia y monitoreo; y para el dia-
gnóstico individual o poblacional.
Principio del ensayo
La placa de microtitulación se encuentra recubierta
con antígenos inactivados y sonicados de Brucella
abortus. Las muestras de suero o leche se agregan en
los pocillos recubiertos de la placa de microtitulación.
Los anticuerpos dirigidos contra Brucella Ab abortus y
Brucella melitensis que estén presentes en la muestra
del ensayo, se unen al antígeno durante la incubación.
Los anticuerpos unidos se detectan utilizando un
anticuerpo monoclonal anti-IgG, conjugado con
peroxidasa. Después, el conjugado unido se visualiza
añadiendo la solución de sustrato cromógeno (TMB).
La presencia de anticuerpos específicos en la muestra
se determina midiendo ópticamente el desarrollo del
color a una longitud de onda de 450 nm.
Componentes del kit
Conserve el kit a 5±3°C hasta su fecha de vencimie n-
to. Consulte la etiqueta del kit para ver la fecha de
vencimiento real. La vida útil de los componentes
diluidos, abiertos o reconstituidos se detalla a conti-
nuación, cuando corresponda. Tiene a su disposición
los datos relativos a los riesgos químicos en la sección
"Normas de seguridad y declaraciones de I+S” (Apén-
dice II).
Componente 1
Placa del ensayo
Cinco placas de ensayo.
Componente 2
Conjugado (30x)
(Concentrado 30X, diluir antes de usar)
Un vial con 2,5 ml de conjugado.
El conjugado diluido no es estable, por lo que debe
prepararse antes de ser utilizado.
Componente 3
Tampón de dilución (5x)
(Concentrado 5X, diluir antes de usar)
Un vial con 60 ml de tampón de dilución.
Vida media del tampón de dilución: 5 horas a 22±3°C.
Componente 4
Líquido de lavado (200X)
(Concentrado 200X, diluir antes de usar)
Un vial con 60 ml de líquido de lavado.
Vida media de la solución de lavado: 1 semana a
22±3°C.
Componente 5
Suero de referencia 1 (listo para usar)
Un vial con 0,5 ml de suero de referencia 1 (control
positivo).
Componente 6
Suero de referencia 2 (listo para usar)
Un vial con 0,5 ml de suero de referencia 2 (control
negativo).
Componente 7
Suero de referencia 3 (listo para usar)
Un vial con 0,5 ml de suero de referencia 3 (control
positivo débil).
Componente 8
Sustrato Cromógeno (TMB) (listo para usar)
Un vial con 60 ml de sustrato cromógeno (TMB).
Componente 9
Solución de frenado (listo para usar)
Un vial contiene 60 ml de tampón de solución de
frenado.
Contenido adicional del kit:
- 10 selladores de placas
- Instrucciones de uso
- Certificado de análisis
Material necesario adicional
General:
Equipo de laboratorio según las normas de seguridad
nacionales.
Análisis de los resultados:
Lector de placas, p. ej., Multiscan EX o equivalente.
El lector tiene que tener un filtro apropiado para leer
placas a 450 nm.
Incubación:
Incubador de micro-placas (que llegue al menos a
50°C).
Opcional:
Lavador de placas p. ej., Tecan EIA Tray
Washer o equivalente.
Placas sin recubrir. Aconsejamos placas con
fondo en forma de U (Greiner, nº de catálogo
650101). Sin embargo, se pueden otras
placas o tubos individuales.
Procedimiento del ensayo
Precauciones
Debe seguir estrictamente las normas nacionales para
el trabajo con muestras animales. PrioCHECK®
Brucella Ab debe usarse en laboratorios adecuados
para este propósito.
Las muestras deben ser consideradas como poten-
cialmente infecciosas y todos los objetos que entren
en contacto con las muestras, como potencialmente
contaminados.
Tiene a su disposición los datos relativos a los riesgos
químicos en la sección "Normas de seguridad y
declaraciones " (Apéndice II).
Notas
Para lograr resultados óptimos con el PrioCHECK®
Brucella Ab, debe tener en cuenta los siguientes
aspectos:
Hay que seguir estrictamente el protocolo del
ensayo.
Todos los reactivos del kit deben equilibrarse a
temperatura ambiente (22±3°C) antes de usar-
se.
Se deben cambiar las puntas de las pipetas
después de cada pipeteo.
Hay que usar recipientes independientes para
cada reactivo.
Los componentes del kit no deben ser utilizados
tras la fecha de caducidad o si se observan
cambios en su aspecto.
No deben utilizar componentes con números de
lote diferentes en un mismo ensayo
Se debe usar agua destilada.
SOLUCIONES QUE DEBE TENER PREPARADAS
Solución de trabajo del tampón de dilución
El tampón de dilución (Componente 3) concentrado se
debe diluir 5 veces (1 parte de tampón concentrado +
4 partes de agua desmineralizada). El volumen total
de solución de trabajo del tampón de dilución que se
puede preparar es 300 ml.
Estabilidad de la solución de trabajo del tampón de
dilución: 5 horas a 22±3°C.
Dilución de conjugado
Prepare la dilución de trabajo (30x) (Componente 2)
del conjugado en solución de trabajo del tampón de
dilución.
Para realizar un ensayo con una placa, prepare 12 ml
(agregue 0,4 ml de conjugado a 11,6 ml de solución
de trabajo del tampón de dilución).
Nota: Debe preparar la dilución de trabajo justo
antes de usarla.
Solución de lavado
El líquido de lavado (200x) (Componente 4) debe
diluirse 1/200 en agua desmineralizada y es suficiente
para un volumen final de 12 litros solución de lavado.
Estabilidad de la solución de lavado: 1 semana a
22±3°C.
Nota: consulte el Apéndice IV para ver el procedi-
miento de preparación de muestras y su almace-
namiento
DILUCIÓN PREVIA DE LAS MUESTRAS DE REFE-
RENCIA
1.1 Prepare una dilución 1:10 de los sueros de
referencia del kit 1, 2 y 3 (Componente 5, 6 y 7)
en una placa sin recubrir (placa de dilución)
agregando 90 µl de solución de trabajo del tam-
pón de dilución a los pocillos C1 a H1. Agregue
10 µl de suero de referencia 1 a los pocillos C1
Y D1, 10 µl de suero de referencia 2 a los poci-
llos E1 y F1 y 10 µl de suero de referencia 3 a
los pocillos G1 y H1.
Instrucciones de uso
PrioCHECK
®
Brucella Ab
DILUCIÓN PREVIA E INCUBACIÓN DE LAS MUES-
TRAS INDIVIDUALES
Predilución en una placa sin recubrir (placa de
dilución)
2.1 Muestras bovinas pre-diluidas 1:10
Agregue 90 µl de solución de trabajo del tampón
de dilución a los pocillos y añada 10 µl de suero
bovino.
Muestras ovinas pre-diluidas 1:5
Agregue 80 µl de solución de trabajo del tampón
de dilución a los pocillos y añada 20 µl de suero
ovino.
Muestras caprinas pre-diluidas 1:2,5
Agregue 60 µl de solución de trabajo del tampón
de dilución y 40 µl de suero caprino a los poci-
llos.
2.2 Agite con suavidad las placas de dilución.
Incubación en la placa de ensayo
3.1 Agregue 100 µl de solución de trabajo del
tampón de dilución a los pocillos A1 y B1 de la
placa de ensayo (Componente 1).
3.2 Agregue 90 µl de solución de trabajo del tampón
de dilución a los pocillos C1 y H1 de la placa de
ensayo.
3.3 Agregue 10 µl de los sueros de referencia 1, 2 y
3 pre-diluidos a los pocillos C1 a H1 de la placa
de ensayo.
3.4 Muestras de suero
Agregue 90 µl de solución de trabajo del tampón
de dilución al resto de pocillos y 10 µl de los
sueros pre-diluidos a cada uno de los pocillos
correspondientes de la placa de ensayo.
Muestras de leche
Agregue 100 µl de muestras de leche sin diluir a
los pocillos de la placa de ensayo.
3.5 Tape las placas y agítelas con cuidado.
3.6 Incube la placa de ensayo durante 60±5 minutos
a 37±1°C.
DILUCIÓN PREVIA E INCUBACIÓN DE LAS MUES-
TRAS COMBINADAS
Pre-dilución en una placa sin recubrir
2.1 Prepare una mezcla de 10 muestras de suero
(bovino, ovino o caprino) mezclando 10 µl de
cada suero individual en la placa sin recubrir. No
mezcle muestras de especies diferentes
2.2 Agite con suavidad las placas sin recubrir.
Incubación en la placa de ensayo
3.1 Agregue 100 µl de solución de trabajo del
tampón de dilución a los pocillos A1 y B1 de la
placa de ensayo (Componente 1).
3.2 Agregue 90 µl de solución de trabajo del tampón
de dilución a los pocillos C1 y H1 de la placa de
ensayo.
3.3 Agregue 10 µl de los sueros de referencia 1, 2 y
3 pre-diluidos a los pocillos C1 a H1 de la placa
de ensayo.
3.4 Muestras de suero bovino combinadas
Agregue 90 µl de solución de trabajo del tampón
de dilución al resto de pocillos y añada 10 µl de
muestras de suero combinadas.
Muestras de suero ovino combinadas
Agregue 80 µl de solución de trabajo del tampón
de dilución al resto de pocillos y añada 20 µl de
muestras de suero combinadas.
Muestras de suero caprino combinadas
Agregue 60 µl de solución de trabajo del tampón
de dilución al resto de pocillos y añada 40 µl de
muestras de suero combinadas.
3.5 Agregue 100 µl de muestras de leche sin diluir a
los pocillos de la placa de ensayo.
3.6 Tape las placas y agítelas con cuidado.
3.7 Incube la placa de ensayo durante 60±5 minutos
a 37±1°C.
Continúe con el siguiente procedimiento tanto con
las muestras individuales como con las combina-
das.
INCUBACIÓN CON EL CONJUGADO
4.1 Vacíe la placa de ensayo y lávela 6 veces con
200-300 µl de solución de lavado. Golpee bien
las placas (invertidas sobre papel absorbente)
después del último ciclo de lavado.
4.2 Agregue 100 µl de dilución de trabajo del conju-
gado a cada pocillo.
4.3 Tape e incube la placa de ensayo durante 60±5
minutos a 37±1°C.
INCUBACIÓN CON LA SOLUCIÓN DE SUSTRATO
CROMÓGENO (TMB)
5.1 Vacíe la placa de ensayo y lávela 6 veces con
200-300 µl solución de lavado. Golpee bien
las placas después del último ciclo de lavado.
5.2 Agregue 100 µl de la solución de sustrato cro-
mógeno (TMB) (Componente 8) a cada pocillo.
5.3 Incube la placa del ensayo 15 minutos a 22±3°C.
5.4 Agregue 100 µl de la solución de frenado
(Componente 9) a cada pocillo.
5.5 Mezcle suavemente el contenido de los pocillos
de las placas.
Nota: Inicie la adición de solución de frenado 15
minutos después de haber llenado el primer pocillo
con la solución de sustrato cromógeno (TMB). Agre-
gue la solución de frenado en el mismo orden y al
mismo ritmo que la solución de sustrato cromógeno
(TMB).
LECTURA DEL ENSAYO Y CÁLCULO DE LOS
RESULTADOS
6.1 Mida la densidad óptica (DO) de los pocillos a
450 nm, antes de que pasen 15 minutos desde
la finalización del desarrollo de color.
6.2 Calcule el promedio de DO450 del blanco (poci-
llos A1 y B1).
6.3 Calcule la DO450 corregida de los sueros de
referencia y de las muestras del ensayo restan-
do la DO450 promedio del blanco.
6.4 Calcule el porcentaje de positividad (PP) de los
sueros de referencia 2 y 3 y de las muestras del
ensayo según la siguiente fórmula.
La DO450 corregida de todas las muestras se expresa
como el porcentaje de positividad (PP) sobre la DO450
media corregida del suero de referencia 1 (pocillos C1
y D1).
DO
450
corregida de la muestra del ensayo
PP = ----------------------------------------------------------- x 100
DO
450
corregida de la referencia 1
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Criterios de validación
7.1 La DO450 media del blanco debe ser <0,150.
7.2 La DO450 media corregida del suero de referen-
cia 1 debe ser >1,000.
7.3 El porcentaje de positividad (PP) del suero de
referencia 2 debe ser <45.
7.4 El porcentaje de positividad (PP) del suero de
referencia 3 debe ser >45.
Nota: el incumplimiento de estos criterios es motivo
suficiente para descartar los resultados del ensayo.
Nota: Si la DO450 media corregida del suero de refe-
Rencia 1 es inferior a 1,000, es posible que la solu-
ción de sustrato cromógeno (TMB) se encuentre
demasiado fría. En ese caso, caliente la solución
hasta 22±3°C o incube durante 30 minutos.
Si la DO450 media corregida de la referencia 1 es
superior a 2,000, se recomienda un periodo de incu-
bación más corto con la solución de sustrato cromó-
geno (TMB).
Interpretación del porcentaje de positividad
Muestras de suero bovino (individuales o combinadas)
PP <45% (negativo)
La muestra no contiene anticuerpos contra Brucella.
PP >45% (positivo)
La muestra contiene anticuerpos contra Brucella.
Muestras de leche bovina (individuales o combinadas)
PP <20% (negativo)
La muestra no contiene anticuerpos contra Brucella.
PP >20% (positivo)
La muestra contiene anticuerpos contra Brucella.
Muestras de suero ovino (individuales o combinadas)
PP <30% (negativo)
La muestra no contiene anticuerpos contra Brucella.
PP >30% (positivo)
La muestra contiene anticuerpos contra Brucella.
Muestras de suero caprino (individuales o combina-
das)
PP <40% (negativo)
La muestra no contiene anticuerpos contra Brucella.
PP >40% (positivo)
La muestra contiene anticuerpos contra Brucella.
Las muestras de suero en una mezcla positiva deben
volver a ser analizadas individualmente.
Anexo I
Nota informativa
Este manual se considera completo y correcto en el
momento de su publicación. Prionics AG no asume
ninguna responsabilidad por incidencias o daños
relacionados por el uso de este manual
Responsabilidad
Prionics AG garantiza que sus productos cumplen las
correspondientes especificaciones publicadas, siem-
pre que se usen de acuerdo con las instrucciones
correspondientes que sean del caso y dentro de la
fecha de caducidad de los productos. Prionics AG no
da ninguna otra garantía, explícita o implícita. No hay
ninguna garantía de comercialidad o idoneidad para
un uso particular. La garantía aquí ofrecida y los
datos, especificaciones y descripciones de los produc-
tos Prionics AG que aparecen en catálogos de Prio-
nics AG impresos y en la bibliografía sobre los produc-
tos no pueden ser modificados salvo tras acuerdo
escrito explícito firmado por un representante autori-
zado de Prionics AG. Cualquier reproducción oral o
escrita en contradicción con esta garantía o con
dichas publicaciones no está autorizada y Prionics no
se hace responsable.
En caso de incumplimiento de la garantía susodicha,
la única obligación de Prionics AG consistirá, a su
elección, en reparar o remplazar el producto en
cuestión o parte del mismo, siempre que el cliente
notifique el incumplimiento a Prionics AG sin demora.
Si, tras esfuerzos razonables, Prionics AG resulta
incapaz de reparar o restituir el producto o parte del
mismo, entonces Prionics AG restituirá al cliente todos
los efectivos pagados por el producto o la parte en
cuestión.
Prionics AG no asume ninguna responsabilidad por
daños indirectos fortuitos, consiguientes, especiales o
de cualquier otro tipo que resulten de pérdidas eco-
nómicas o daños a la propiedad sufridos por cualquier
cliente como consecuencia del uso de sus productos.
Prionics AG y Prionics Lelystad B.V. son empresas
certificadas ISO 9001:2000.
PrioCHECK
®
Brucella Ab
Anexo II
Normas y declaraciones de seguridad
Se deben seguir estrictamente las normas nacio-
nales de seguridad.
Declaraciones de seguridad
Componente 1
Placa del ensayo
Código de riesgo: este producto no está clasificado
según las normas de la UE.
Componente 2
Conjugado (30x)
Código de riesgo: este producto no está clasificado
según las normas de la UE.
Componente 3
Tampón de muestra (listo para usar)
Código de riesgo: este producto no está clasificado
según las normas de la UE.
Componente 4
Líquido de lavado (200X)
Código de riesgo: este producto no está clasificado
según las normas de la UE.
Componente 5
Referencia 1 (listo para usar)
Código de riesgo: estos productos no están clasifica-
dos según las normas de la UE.
Componente 6
Referencia 2 (listo para usar)
Código de riesgo: estos productos no están clasifica-
dos según las normas de la UE.
Componente 7
Referencia 3 (listo para usar)
Código de riesgo: estos productos no están clasifica-
dos según las normas de la UE.
Componente 8
Sustrato Cromógeno (TMB) (listo para usar)
Código de riesgo: estos productos no están clasifica-
dos según las normas de la UE.
Componente 9
Solución de frenado
Código de riesgo: R35: provoca quemaduras graves.
S26: en caso de contacto con los ojos, lávense inme-
diata y abundantemente con agua y acúdase a un
médico.
S36/37/39: úsese indumentaria y guantes adecuados
y protección para los ojos/la cara.
S45: en caso de accidente o malestar, acúdase
inmediatamente al médico (si es posible, muéstrele la
etiqueta).
Anexo III
Bibliografía
1) Bercovich, Z. and Taaijke, R. (1990). J. Vet. Med. B
37, 735-759.
2) OIE Manual of standards for Diagnostics Test and
Vaccines, Fourth Edition, 2000.
Anexo IV
Procedimiento de preparación y
almacenamiento de las muestras
Suero
−
Las muestras se pueden guardar a -20°C antes de
analizarlas.
−
Las muestras se pueden analizar individualmente o
en una combinación de 10 muestras.
−
Las muestras de suero bovino, ovino y caprino se
analizan a concentraciones finales diferentes en la
placa de ensayo ELISA. La dilución final para suero
bovino es 1:100, ovino 1:50 y caprino 1:25.
−
No mezcle muestras de especies diferentes.
−
Las muestras de suero deben diluirse previamente
en una placa aparte.
−
Cuando se titulen muestras de suero, se deben
preparar diluciones seriadas al medio en solución
de trabajo del tampón de dilución.
Leche
- Las muestras de leche se pueden guardar a 5±3°C
antes ser analizadas. Si no se analizarán las mues-
tras de dentro de los 3 días posteriores a su reco-
lección, se recomienda agregar azida sódica
(0,02%) como conservante.
- La muestra de leche que se va a analizar debe
recogerse del líquido que se forma debajo de la
capa cremosa.
- Las muestras de leche individuales y poblacionales
se analizan sin diluir.
Tabla 1: Dilución de la muestra
*TD significa solución de trabajo del tampón de dilución.
Contacto
Prionics Lelystad B.V.
Platinastraat 33
P.O. Box 2271
NL-8203 AG, Lelystad
Países Bajos
Tel. +31 320 714000
Fax +31 320 714029
Prionics AG
Wagistrasse 27a
CH-8952 Schlieren-Zurich
Suiza
Tel. +41 44 200 2000
Fax +41 44 200 2010
www.prionics.com
[email protected]
Para ver nuestra red de distribuidores, por favor, visite
www.prionics.com
Animal
Tipo de
muestra
Pre-dilución en
placa sin recubrir*
En placa de
ensayo*
Bovino
Individual
10 µl de suero +
90 µl de TD
(1:10)
10 µl de suero +
90 µl de TD
(1:100)
Ovino
Individual
20 µl de suero +
80 µl de TD (1:5)
10 µl de suero +
90 µl de TD
(01:50:00)
Caprino
Individual
40 µl de suero +
60 µl de TD (1:2,5)
10 µl de suero +
90 µl de TD
(01:25:00)
Bovino
Mezcla de 10
sueros
Mezcle 10 µl de
cada suero (1:10)
10 µl de suero +
90 µl de TD
(1:100)
Ovino
Mezcla de 10
sueros
Mezcle 10 µl de
cada suero (1:10)
20 µl de suero +
80 µl de TD
(01:50:00)
Caprino
Mezcla de 10
sueros
Mezcle 10 µl de
cada suero (1:10)
40 µl de suero +
60 µl de TD
(01:25:00)
Bovino
Leche
(individual)
- 100 µl de muestra
de leche
Bovino
Leche
(población)
- 100 µl de muestra
de leche
Sueros de referencia
10 µl de suero +
90 µl de TD
(01:10)
10 µl de suero +
90 µl de TD
(1:100)
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