Thermo Fisher Scientific PrioCHECK FMDV NS serum cattle sheep goat pig 7610770 ES Guía del usuario

Marca: Thermo Fisher Scientific

Modelo: PrioCHECK FMDV NS serum cattle sheep goat pig 7610770 ES

Tipo: Guía del usuario

PrioCHECK® FMDV NS

ELISA para detección in vitro de anticuerpos contra las proteínas no estructurales del virus de la

fiebre aftosa en suero de bovinos, ovinos, caprinos y porcinos

5 placas para 450 muestras

(Numero máximo: 30 series independientes de testes)

©Prionics AG

Versión 1.0_es

Sólo para diagnóstico in vitro en uso veterinario

Conservar a 5±3°C

Nº de producto 7610770

Introducción

La fiebre aftosa es la amenaza más importante a nivel

económico para la industria ganadera. Esta enferme-

dad altamente contagiosa afecta a todos los animales

biungulados y está muy extendida por todo el mundo.

Los virus FMD se clasifican en 7 serotipos diferentes

que sirven de diagnóstico con el uso de complejo

métodos serológicos convencionales. Para controlar

los brotes en el futuro se llevarán a cabo vacunacio-

nes de emergencia. Las vacunas están constituidas

por proteínas estructurales (parcialmente) purificadas

del virus FMD y por lo tanto, los animales vacunados

sólo desarrollan anticuerpos dirigidos contra las

proteínas estructurales del virus. Sin embargo, des-

pués de una infección con el FMDV, se producen

anticuerpos dirigidos contra las proteínas estructurales

y las no estructurales. Por lo tanto, un ensayo ELISA

que detecte anticuerpos contra proteínas no estructu-

rales del FMDV no sólo detecta animales infectados

sino que también discrimina entre animales infectados

y vacunados.

PrioCHECK® FMDV NS detecta anticuerpos dirigidos

contra la proteína no estructural 3ABC de FMDV. El

ensayo ELISA detecta animales infectados con FMDV

independientemente del serotipo que causa la infec-

ción e independientemente del hecho de que el animal

esté vacunado o no. El ensayo ELISA se puede usar

para analizar muestras de suero de ganado bovino,

ovino, caprino y porcino.

Principio del ensayo

PrioCHECK® FMDV NS es un ensayo ELISA blo-

queante. Las placas del ensayo ELISA están recubier-

tas con anticuerpos monoclonales específicos contra

3ABC seguidos de una incubación con la proteína

3ABC recombinante. Consecuentemente, las placas

de ensayo del kit contienen el antígeno NS del FMDV

capturado por el AcM recubierto.

La prueba se realiza agregando las muestras de suero

a los pocillos de una placa de ensayo. Después de la

incubación, se lava la placa y se agrega el conjugado.

Los anticuerpos específicos, dirigidos contra las

proteínas no estructurales (NS) que puedan estar

presentes en la muestra del ensayo se unirán a la

proteína 3ABC y bloquearán la unión del AcM-HRPO.

Después de la incubación, se lava la placa y se

agrega el sustrato cromógeno (TMB) listo para usar.

Después de incubar a temperatura ambiente

(22±3°C), se detiene el desarrollo de color. Se deter-

mina la presencia de anticuerpos dirigidos contra el

virus de la fiebre aftosa midiendo desarrollo de color a

una longitud de onda de 450 nm.

PrioCHECK® FMDV NS es un ensayo con una sola

dilución. Las muestras de suero se analizan en una

dilución 1:5.

Componentes del kit

El kit PrioCHECK® FMDV NS se debe conservar a

5±3°C hasta la fecha de caducidad. Consulte la

etiqueta del kit para ver la fecha de vencimiento real.

La vida útil de los componentes diluidos, abiertos o

reconstituidos aparece a continuación, cuando corres-

ponda. Tiene a su disposición los datos relativos a los

riesgos químicos en la sección "Normas de seguridad

y declaraciones de I+S" (Apéndice II).

Componente 1

Placa del ensayo

Se suministran cinco placas de ensayo en bolsas

selladas, con desecante.

Componente 2

Conjugado (30x)

(Concentrado 30x, diluir antes de usar)

Un vial con 2.2 ml de conjugado.

El conjugado diluido es inestable, prepárelo inmedia-

tamente antes de usar.

Componente 3

Tampón de dilución (2x)

(Concentrado 2x, diluir antes de usar)

Un vial que contiene 60 ml de tampón de dilución.

Vida útil de la solución de trabajo de buffer diluyente:

24 horas a 5±3°C.

Componente 4

Aditivo (liofilizado)

(Reconstituir y diluir antes de usar).

Cinco viales con 2.5 ml de aditivo liofilizado.

Vida útil del aditivo reconstituido: hasta la fecha

indicada de vencimiento si se conserva congelado

(-20°C).

Componente 5

Agua desmineralizada

Dos viales con 10 ml de agua desmineralizada.

Componente 6

Solución de lavado (200x)

(Concentrado 200x, diluir antes de usar). Un vial con

60 ml de solución de lavado.

Vida útil de la solución de lavado: 1 semana a tempe-

ratura ambiente (22±3°C).

Componente 7

Control positivo (listo para usar)

Un vial con 1.4 ml de control positivo.

Componente 8

Control positivo diluido (listo para usar)

Un vial con 1.4 ml de control positivo diluido.

Componente 9

Control negativo (listo para usar)

Un vial con 1.4 ml de control negativo.

Componente 10

Sustrato cromógeno (TMB) (listo para usar)

Un vial con 60 ml de sustrato cromógeno (TMB).

Componente 11

Solución de frenado (listo para usar)

Un vial contiene 60 ml de tampón de solución de

frenado.

Contenido adicional del kit:

- Instrucciones de uso

- 1 Tapa para cubrir las tiras durante la incubación

- 1 Bolsa de aluminio

- Certificado de análisis

Material necesario adicional

General:

Equipo de laboratorio según las normas de seguridad

nacionales.

Análisis de los resultados:

Lector de placas, p. ej., Multiscan EX o equivalente.

El lector tiene que tener un filtro apropiado para leer

placas a 450 nm.

Opcional:

Lavador de placas p. ej., Tecan EIA Tray

Washer o equivalente.

Procedimiento del ensayo

Precauciones

Debe ceñirse estrictamente a las directrices naciona-

les para el trabajo con muestras animales. Prio-

CHECK® FMDV NS debe usarse en laboratorios

adecuados para este propósito.

Las muestras deben ser consideradas como poten-

cialmente infeccionas y todos los objetos que entren

en contacto con las muestras como potencialmente

contaminados.

Tiene a su disposición los datos relativos a los riesgos

químicos en la sección "Normas de seguridad y

declaraciones de I+S" (Apéndice II).

Notas

Para lograr unos resultados óptimos con el Prio-

CHECK® FMDV NS, debe tener en cuenta los siguien-

tes aspectos:

 Hay que seguir estrictamente el protocolo del

ensayo.

 Todos los reactivos del kit deben equilibrarse a

temperatura ambiente (22±3°C) antes de usar-

se.

 Se deben cambiar las puntas de las pipetas tras

cada pipeteo.

 Hay que usar recipientes independientes para

cada reactivo.

 Los componentes del kit no deben ser utilizados

tras la fecha de caducidad o si se observan

cambios en su aspecto.

 No deben utilizarse juntos componentes de kits

con números de lote diferentes.

 Se debe usar agua desmineralizada para el

ensayo.

SOLUCIONES QUE DEBE TENER PREFRENADOS

Tampón de dilución: solución de trabajo

Diluya el tampón de dilución (Componente 3) concen-

trado en proporción 1:1 con agua desmineralizada.

Prepare 4 ml por cada 2 tiras (2.0 ml de tampón

concentrado y 2.0 ml de agua desmineralizada).

Puede conservarse refrigerado (5±3°C) hasta 24hs.

Aditivo

Equilibre el vial con aditivo liofilizado (Componente 4)

a 22±3°C y reconstituya 1 el vial con 2.5 ml el agua

desmineralizada (Componente 5) que se suministra

con el kit. El aditivo reconstituido puede mantenerse a

-20°C hasta su fecha de vencimiento.

Tampón de ELISA

Agregue aditivo reconstituido al tampón de dilución

hasta una concentración final del 10% (v/v). Prepare

4.0 ml por cada dos tiras (0.4 ml de aditivo y 3.6 ml de

tampón de dilución). Guarde el tampón de ELISA que

no use a 5±3°C hasta 24 horas.

1 La reconstitución de aditivo liofilizado debe hacerse del siguiente modo:

- Equilibre el vial a 22±3°C.

- Con el vial en posición vertical, dé suavemente unos golpecitos contra

la mesa para asegurarse de que el contenido esté en el fondo del vial.

- Abra con cuidado el vial.

- Agregue la cantidad específica de agua desmineralizada (Componen-

te 5).

- Cambie el tapón del vial y deje que el material liofilizado se disuelva.

- Agite suavemente de modo que el material que siga seco se disuelva.

- Deje en reposo el material al menos durante 15 minutos a 22±3°C

antes de usar.

- Invierta con cuidado el vial de modo intermitente (debe evitar la

formación de espuma).

Instrucciones de uso

PrioCHECK

FMDV NS

Dilución del conjugado

Prepare nueva la dilución de trabajo del conjugado

(Componente 2) en tampón de ELISA. Prepare 2.1 ml

para 2 tiras (2.03 ml de tampón de ELISA +70 µl de

conjugado 30X).

Nota: La dilución del conjugado debe hacerse

inmediatamente antes de usar.

Solución de lavado

Diluya la solución de lavado (Componente 6) concen-

trado (200X) en agua desmineralizada. La cantidad de

solución de lavado concentrado es suficiente para

preparar un volumen final de 12 litros.

Estabilidad de la solución de lavado a la dilución de

trabajo: 1 semana a 22±3°C.

Nota: Se pueden usar lavadores ELISA comerciales. Si no

tiene uno a su disposición, puede lavar las placas agregando

200 µl de solución de lavado a todos los pocillos de las placas.

Después, vacíe las placas y repita el proceso las veces nece-

sarias. No es necesario sumergir las placas entre cada lavado.

Tape bien las placas después del último lavado.

DÍA 1

INCUBACIÓN CON EL SUERO DEL ENSAYO

1.1 Agregue 80 µl de tampón de ELISA a todos los

pocillos (Componente 1).

1.2 Agregue 20 µl de control negativo (Componen-

te 9) a los pocillos A1 y B1.

1.3 Agregue 20 µl de control negativo diluido

(Componente 8) a los pocillos C1 y D1.

1.4 Agregue 20 µl de control positivo (Componente

7) a los pocillos E1 y F1.

1.5 Agregue 20 µl de las muestras del ensayo al

resto de pocillos.

1.6 Selle las placas usando el sellador de placas

incluido.

1.7 Agite con suavidad las placas del ensayo.

1.8 Incube toda la noche (16-18 horas) a 22±3°C.

DÍA 2 INCUBACIÓN CON EL CONJUGADO

2.1 Vacíe las placas del ensayo después del

periodo de incubación y lávelas 6 veces con

200-300 µl de solución de lavado por pocillo.

Seque bien las placas después del último lava-

do (invertidas sobre papel absorbente).

2.2 Agregue 100 µl de dilución de trabajo del

conjugado a cada pocillo.

2.3 Tape las placas usando los selladores inclui-

dos.

2.4 Incube 60±5 minutos a 22±3°C.

INCUBACIÓN CON LA SOLUCIÓN DE SUSTRATO

CROMÓGENO (TMB)

3.1 Vacíe las placas del ensayo después del

periodo de incubación y lávelas 6 veces con

200-300 µl de solución de lavado por pocillo.

Seque bien las placas después del último lava-

do.

3.2 Agregue 100 µl de la solución de sustrato

cromógeno (TMB) (Componente 10) a cada

pocillo.

3.3 Incube 20 minutos a 22±3°C.

3.4 Agregue 100 µl de la solución de frenado

(Componente 11) a cada pocillo.

3.5 Mezcle el contenido de los pocillos de las

placas del ensayo antes de leer.

Nota: Inicie la adición de solución de frenado 20

minutos después de haber llenado el primer pocillo

con la solución de sustrato cromógeno (TMB). Agre-

gue la solución de frenado en el mismo orden y al

mismo ritmo que la solución de sustrato cromógeno

(TMB).

LECTURA DEL ENSAYO Y CÁLCULO DE LOS

RESULTADOS

4.1 Mida la densidad óptica (DO) de los pocillos a

450 nm, preferiblemente antes de que pasen 15

minutos desde que se pare el desarrollo de co-

lor.

4.2 Calcule la DO450 media de los pocillos A1 y B1

(control negativo = DO450 máx.).

4.3 La inhibición porcentual (IP) de los controles y

de los sueros del ensayo se calcula según la

siguiente fórmula.

Los valores DO450 de las muestras se expresan como

la inhibición porcentual relativa a la DO450 media máx.

DO450 de la muestra

IP = 100 – -------------------------------- x 100

DO450 máx.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Criterios de validación

5.1 La DO450 media máx. (DO450 del control negati-

vo) debe ser > 1.000.

5.2 La inhibición porcentual media del control

positivo diluido debe ser >50%.

5.3 La inhibición porcentual media del control

positivo debe ser >70%.

5.4 El no cumplimiento de estos criterios es motivo

suficiente para descartar los resultados de una

placa específica.

Nota: Si la DO450 de una muestra es superior a la

DO450, máx., la inhibición porcentual puede interpre-

tarse como 0%. Si la DO450 media del control negativo

es inferior a 1.000, posiblemente la solución de sustra-

to cromógeno (TMB) esté demasiado fría. En ese

caso, caliente la solución hasta que alcance 22±3°C o

incube durante 30 minutos. Si la DO450 media del

control negativo es superior a 2.000, se recomienda

un periodo de incubación más corto con la solución de

sustrato cromógeno (TMB).

Interpretación de la inhibición porcentual

IP = < 50% (negativo)

No hay anticuerpos contra la proteína NS del FMDV

en la muestras del ensayo.

IP = >50% (positivo)

Hay anticuerpos contra la proteína NS del FMDV en la

muestra del ensayo.

Apéndice I

Nota informativa

Este manual se considera completo y correcto en el momento

de su publicación. Prionics AG no asume ninguna responsabili-

dad por daños fortuitos o consiguientes en relación con o tras

el uso de este manual.

Responsabilidad

Prionics AG garantiza que sus productos cumplen las corres-

pondientes especificaciones publicadas, siempre que se usen

de acuerdo con las instrucciones correspondientes que sean

del caso y dentro de la fecha de caducidad de los productos.

Prionics AG no da ninguna otra garantía, explícita o implícita.

No hay ninguna garantía de comercialidad o idoneidad para un

uso particular. La garantía aquí ofrecida y los datos, especifica-

ciones y descripciones de los productos Prionics AG que

aparecen en catálogos de Prionics AG impresos y en la

bibliografía sobre los productos no pueden ser modificados

salvo tras acuerdo escrito explícito firmado por un representan-

te autorizado de Prionics AG. Cualquier representación oral o

escrita en contradicción con esta garantía o con dichas publi-

caciones no está autorizada y, si ha sido dada no es de fiar.

En caso de incumplimiento de la garantía susodicha, la única

obligación de Prionics AG consistirá, a su elección, en reparar

o remplazar el producto en cuestión o parte del mismo, siempre

que el cliente notifique el incumplimiento a Prionics AG sin

demora. Si, tras esfuerzos razonables, Prionics AG resulta

incapaz de reparar o restituir el producto o parte del mismo,

entonces Prionics AG restituirá al cliente todos los efectivos

pagados por el producto o la parte en cuestión.

Prionics AG no asume ninguna responsabilidad por daños

indirectos fortuitos, consiguientes, especiales o de cualquier

otro tipo que resulten de pérdidas económicas o daños a la

propiedad sufridos por cualquier cliente como consecuencia del

uso de sus productos.

Prionics AG y Prionics Lelystad B.V. son empresas certificadas

ISO 9001:2000.

Apéndice II

Normas de seguridad y declaraciones de I+S

Se deben seguir estrictamente las normas nacionales de

seguridad.

Componente 1

Placa del ensayo