Thermo Fisher Scientific PrioCHECK Porcine HEV Ab Strip Kit Instrucciones de operación

Marca
Thermo Fisher Scientific
Modelo
PrioCHECK Porcine HEV Ab Strip Kit
Tipo
Instrucciones de operación
Sólo para uso veterinario. Sólo para uso In Vitro.
INSTRUCCIONES DE USO
PrioCHECK™ Porcine HEV Ab Strip Kit
ELISA para detección
in vitro
de anticuerpos contra el virus de la hepatitis E en suero y jugo de carne porcina
Número de Catálogo 4600010
N.º de Pub. MAN0013801 Rev. A.0
¡ADVERTENCIA! Lea las hojas de datos de seguridad (SDS) y siga las instrucciones de manipulación. Lleve el equipo de protección individual
(EPI) adecuado (gafas, ropa, guantes). Las hojas de datos de seguridad (SDS) se encuentran disponibles en thermofisher.com/support.
¡ADVERTENCIA! POSIBLE RIESGO BIOLÓGICO. Lea la información sobre seguridad frente a los riesgos biológicos en la página de este
producto en thermofisher.com. Lleve el equipo de protección individual (EPI) adecuado (gafas, ropa, y guantes)
Introducción
El virus de la hepatitis E (VHE) es un patógeno emergente que aparece principalmente en países como India, Asia, África y América Central, provocando
hepatitis de transmisión entérica en humanos. El VHE pertenece a la familia Hepeviridae y es un virus sin envuelta, con cápsida icosaédrica con una
cadena simple de ARN de sentido positivo con una longitud aproximada de 7200 bases que codifican tres fases de lectura abiertas.
En humanos, la hepatitis E aguda es una enfermedad grave con una manifestación clínica comparable a la de la hepatitis A. Normalmente es
autolimitante. Durante el embarazo se desarrolla una enfermedad fulminante con mayor frecuencia, acompañada por una alta tasa de mortalidad, de
aproximadamente el 20%. En machos y hembras no embarazadas, la tasa de mortalidad es de 0.5% a 4.0%. No se ha descrito la incidencia de inflamación
crónica de la hepatitis E.
Durante mucho tiempo, en los países industrializados, se ha creído que las infecciones por VHE en humanos sólo afectaban a turistas que viajaban a
regiones endémicas. Sin embargo, en los últimos años, se ha descrito un número creciente de infecciones esporádicas por VHE en regiones no endémicas,
que no puede explicarse por viajes y cada vez hay una mayor evidencia de una transmisión de cerdos domésticos a humanos.
Applied Biosystems™ PrioCHECK™ Porcine HEV Ab Strip Kit es un ensayo de diagnóstico de confianza para la detección de anticuerpos contra virus de
la hepatitis E en muestras de suero y jugo de carne porcina y se puede usar en programas de monitorización y vigilancia.
Principio del ensayo
El ensayo PrioCHECK™ Porcine HEV Ab Strip
Kit para la detección de anticuerpos dirigidos
contra el virus de la hepatitis E en muestras de
suero y jugo de carne porcina se basa en la
tecnica ELISA.
PrioCHECK™ Porcine HEV Ab Strip Kit sigue
un protocolo de cuatro pasos, preparación de la
muestra, incubación de la muestra, incubación
del conjugado y detección.
La placa de ELISA está recubierta con un
antígeno de las fases de lectura abierta (ORF,
por sus siglas en inglés) ORF 2 y ORF 3 de los
genotipos 1 y 3 del virus de la hepatitis E (VHE)
humano. Las muestras de suero y jugo de carne
se incuban en la placa. Para la detección de
anticuerpos unidos a antígenos VHE
recombinantes se usa un anticuerpo anti cerdo
marcado con peroxidasa (POD). El desarrollo
de color tras la adición de sustrato TMB medido
ópticamente a una longitud de onda de 450 nm
muestra la presencia de anticuerpos dirigidos
contra el VHE.
Se puede analizar una placa con 90 muestras
preparadas en 150 minutos.
Componentes del kit
Kit de 5 tiras para 450 muestras. Guardar el kit a 5±3°C hasta su fecha de caducidad. Consulte la
etiqueta del kit para ver la fecha de caducidad real. La vida útil de los componentes diluidos, abiertos
o reconstituidos aparece a continuación, cuando corresponda.
Componente
Descripción
1: Placa del ensayo
Se suministran cinco placas de ensayo (placas en tiras) en bolsas al vacío con una
bolsa de desecante.
2: Tampón de dilución
Listo para usar. Tres frascos, cada uno con 60 mL de tampón de dilución. El tampón
de dilución se usa para diluir las muestras y el conjugado. Color de la solución: azul.
3: Solución de lavado (10x)
Concentrado 10x, diluir antes de usar. Cuatro frascos, cada uno con 60 mL de
solución de lavado (10x). Prepare la solución de trabajo mezclando 1 parte de
solución de lavado (10x) con 9 partes de agua desmineralizada o agua de igual
calidad. Mezcle hasta obtener una solución transparente. Véase Anexo A.
Estabilidad de la solución de trabajo de líquido de lavado:
• 4 semanas a 5±3°C.
• 1 semana a 22±3°C.
4: Conjugado (100x)
Concentrado 100x, diluir antes de usar. Un vial contiene 1.3 mL de conjugado (100x).
Prepare la solución de trabajo del conjugado mezclando 1 parte de conjugado (100x)
con 99 partes de tampón de dilución. Diluya la cantidad de conjugado necesaria para
realizar el ensayo, justo antes de su uso. Véase Anexo A.
5: Control positivo
Listo para usar. Un vial con 750 µL de control positivo. Tapa negra.
6: Control de punto de corte
Listo para usar. Un vial con 750 µL de control de punto de corte. Tapa gris.
7: Control negativo
Listo para usar. Un vial con 750 µL de control negativo. Tapa blanca.
8: Sustrato cromógeno
(TMB)
Listo para usar. Un frasco con 60 mL de sustrato cromógeno (TMB). El sustrato
cromógeno (TMB) es el sustrato para la reacción colorimétrica.
9: Solución de frenado
Listo para usar. Un frasco contiene 60 mL de tampón de solución de frenado. La
solución de frenado se usa para detener el desarrollo de color.
Contenido adicional del kit
• Instrucciones de uso
• Films selladores
Material necesario adicional
Uso
Descripción(1)
General
Equipo de laboratorio según las normas de seguridad nacionales.
• Se debe usar agua desmineralizada o de igual calidad para el ensayo
• Placa sin recubrir, usada para la dilución de la muestra (p. ej., placas de 96 pocillos de fondo
redondo incoloro y transparente) o equivalentes, sin tapizar
• Pipetas monocanal y multicanal adecuadas para pipetear los volúmenes necesarios
• Puntas de pipeta (las recomendadas por el fabricante de la pipeta)
• Reservorios para la solución
•
Agitador vórtex
Preparación de
muestras
• Tubos especiales para sangre
• Tubos especiales para jugo de carne
Análisis de los
resultados
Lector de placas, p. ej., Tecan Sunrise o equivalente. El lector tiene que tener un filtro apropiado
para leer placas a 450 nm. (Referencia 620 nm).
Opcional
Lavador de placas.
(1) A menos que se indique lo contrario, todos los materiales están disponibles en thermofisher.com.
2 PrioCHECK™ Porcine HEV Ab Strip Kit Instrucciones de Uso
Procedimiento del ensayo
Precauciones
• Se deben seguir estrictamente las normas nacionales de seguridad.
• PrioCHECK™ Porcine HEV Ab Strip Kit debe usarse en laboratorios
adecuados para este propósito.
• Las muestras deben ser consideradas como potencialmente infecciosas
y todos los objetos que entren en contacto con las muestras como
potencialmente contaminados.
Notas
Para lograr unos resultados óptimos con el ensayo PrioCHECK™ Porcine
HEV Ab Strip Kit, debe tener en cuenta los siguientes aspectos:
• Hay que seguir estrictamente el protocolo del ensayo.
• Se deben cambiar las puntas de las pipetas tras cada pipeteo.
• Hay que usar recipientes independientes para cada reactivo.
• Los componentes del kit no deben ser utilizados tras la fecha de
caducidad o si se observan cambios en su aspecto.
• No deben utilizarse juntos componentes de kits con números de lote
diferentes.
• Se debe usar agua desmineralizada para el ensayo.
Preparación de muestras
• El suero se puede obtener mediante los métodos habituales.
• Si se analiza jugo de carne, p. ej., un trozo de tejido muscular de 10 g
que se debe congelar y descongelar en un dispositivo especial o que se
puede exprimir para obtener jugo de carne.
• Las muestras inactivadas por calor puede producir problemas de e
fondo y por lo tanto su uso no está recomendado.
Dilución de la muestra para muestras de suero
Las muestras de suero deben diluirse 1:100 y los controles 1:100.
1. Use una placa sin recubrir o equivalente para la dilución muestra.
2. Añada 10 µL de control positivo a los pocillos A1 y B1 de la placa sin
recubrir.
3. Añada 10 µL de control de punto de corte a los pocillos C1 y D1 de la
placa sin recubrir.
4. Añada 10 µL de control negativo a los pocillos E1 y F1 de la placa sin
recubrir.
5. Añada 10 µL de las muestras de suero al resto de pocillos de la placa
sin recubrir.
6. Añada 90 µL de tampón de dilución a cada pocillo de la placa sin
recubrir y mezcle tomando y soltando la muestra 5 veces con una
pipeta.
7. Añada 90 µL de tampón de dilución a cada pocillo de la placa de
ensayo.
8. Transfiera 10 µL de las muestras diluidas y de sus controles de la placa
sin recubrir a la placa de ensayo y mezcle tomando y soltando la
muestra 5 veces con una pipeta.
Dilución de la muestra para muestras de jugo de carne
Las muestras de juego de carne deben diluirse 1:10 y los controles 1:100.
1. Use una placa sin recubrir o equivalente para la dilución muestra.
2. Añada 10 µL de control positivo a los pocillos A1 y B1 de la placa sin
recubrir.
3. Añada 10 µL de control de punto de corte a los pocillos C1 y D1 de la
placa sin recubrir.
4. Añada 10 µL de control negativo a los pocillos E1 y F1 de la placa sin
recubrir.
5. Añada 90 µL de tampón de dilución a todos los pocillos que contengan
controles A1 a F1 de la placa sin recubrir.
6. Añada 100 µL de las muestras de jugo de carne al resto de pocillos de
la placa sin recubrir.
7. Añada 90 µL de tampón de dilución a todos los pocillos de la placa del
ensayo.
8. Transfiera 10 µL de las muestras de jugo de carne y de los controles
diluidos de la placa sin recubrir a la placa de ensayo y mezcle
tomando y soltando la muestra 5 veces con una pipeta.
Incubación de la muestra
1. Coloque con cuidado un film sellador sin usar en la placa de ensayo.
2. Incube las muestras de la placa de ensayo durante 60±1 minutos a
37±3°C.
3. Lave la placa de ensayo cuatro veces con 300 µL de solución de lavado
1x (véase Anexo A).
4. Dé unos golpecitos a la placa sobre una toallita de papel para eliminar
cualquier resto de líquido que quede en los pocillos.
Incubación del conjugado
Pasos previos
Diluya la cantidad necesaria de conjugado (100x) 100 veces en tampón de
dilución (p. ej., Añada 100 µL de conjugado a 9.9 mL de tampón de
dilución para una placa completa, véase Anexo A).
Incubación del conjugado
1. Añada 100 µL de conjugado diluido a cada pocillo de la placa de
ensayo.
2. Coloque con cuidado un film sellador sin usar en la placa de ensayo.
3. Incube la placa de ensayo durante 30±1 minutos a 37±3°C.
4. Lave la placa de ensayo cuatro veces con 300 µL de solución de
lavado 1x (véase Anexo A).
5. Dé unos golpecitos a la placa sobre una toallita de papel para eliminar
cualquier resto de líquido que quede en los pocillos.
Detección
Reacción del sustrato
1. Añada 100 µL sustrato cromógeno (TMB) a cada pocillo de la placa de
ensayo.
2. Incube la placa de ensayo durante 30±10 minutos a 22±3°C.
3. Añada 100 µL de solución de frenado a cada pocillo de la placa de
ensayo.
Nota: Añada solución de frenado en el mismo orden en que se agregó la
solución de sustrato cromógeno (TMB).
Nota: El color de los controles positivos cambiará de azul a amarillo.
Detección
1. Agite brevemente la placa de ensayo (5–10 s) en un agitador orbital
(~300 rpm) o manualmente en la mesa de trabajo.
2. Lea la placa de ensayo en el lector de placas ELISA a 450 nm antes de
60 minutos.
Recomendación: Use un filtro de referencia a 620 nm.
Interpretación de los resultados
Criterios de validación
1. La DO450 media de los controles positivos menos la DO450 del control de
punto de corte debe ser ≥0.3.
2. La DO450 media de los controles de punto de corte menos la DO450 del
control negativo debe ser ≥0.05.
3. La DO450 media de los controles negativos debe ser <0.15.
Si no se cumplen estos criterios, los resultados no son válidos y deben
volver a realizar el ensayo.
Cálculo del punto de corte
El punto de corte se calcula multiplicando por 1.2 la DO450 media del
control de punto de corte.
media DO450 del control Cut-off × 1.2 = Punto de Corte
Interpretación de los resultados
• Los resultados iguales o superiores al punto de corte se consideran
positivos.
• Los resultados entre la DO450 del control de punto de corte y el punto
de corte del ensayo (consulte cómo calcularlo en un punto anterior)
son dudosos y se recomienda volver a analizar esas muestras. Si
continúan siendo dudosos, debe tomar y analizar una segunda
muestra recogida en un momento posterior.
• Los resultados obtenidos inferiores al punto de corte son negativos.
thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion
thermofisher.com
27 noviembre 2017
Anexo A - Preparación de la solución de trabajo de líquido de
lavado y de la solución de conjugado
Solución de trabajo de líquido de lavado
Mezcle correctamente los volúmenes indicados de agua desmineralizada y
de líquido de lavado (10x) para obtener el volumen deseado de solución
de trabajo de líquido de lavado.
• Transfiera 100 mL de líquido de lavado (10x) a un frasco de 1 L.
• Añada 900 mL de agua desmineralizada y mezcle.
Volumen de solución de
trabajo de líquido de lavado
=
+ Cantidad de agua desmin.
0.3 L
=
+
270 mL
0.5 L
=
+
450 mL
1.0 L
=
+
900 mL
2.0 L
=
+
1800 mL
Solución de trabajo de conjugado
Mezcle los volúmenes indicados de conjugado (100x) con la cantidad
adecuada de tampón de dilución (suministrado con el kit) para obtener la
cantidad deseada de conjugado.
Nro. de Placas
mL de conjugado
necesarios
=
mL de Conjugado
(100x)
+
ml de tampón de
dilución
1
12 mL
=
0.12 mL
+
11.88 mL
2
24 mL
=
0.24 mL
+
24.78 mL
3
36 mL
=
0.36 mL
+
35.64 mL
4
48 mL
=
0.48 mL
+
47.52 mL
5
60 mL
=
0.60 mL
+
59.40 mL
Anexo B - Esquemas de pipeteo
Esquema de pipeteo recomendado para una placa sin recubrir y
una placa de ensayo.
Asistencia al cliente y soporte técnico
Asistencia técnica: visite thermofisher.com/askaquestion
Visite thermofisher.com/support para conocer lo último en servicios y
asistencia, incluyendo lo siguiente:
• Números de teléfono de contacto de todo el mundo
• Pedidos y soporte web
• Guías de usuario, manuales y protocolos
• Certificados de análisis
• Fichas técnicas de seguridad (Safety Data Sheets, SDS; también
conocidas como MSDS)
NOTA: Para conocer las SDS de los reactivos y productos químicos de
otros fabricantes, póngase en contacto con el fabricante.
Garantía limitada del producto
Life Technologies Corporation y/o su(s) filiale(s) garantizan sus productos
tal y como se establece en los términos y condiciones generales de venta de
Life Technologies, que se pueden encontrar en el sitio web de
Life Technologies www.thermofisher.com/us/en/home/global/
terms-and-conditions. Si tiene alguna duda, póngase en contacto con
Life Technologies en thermofisher.com/support.
Prionics Lelystad B.V. | Platinastraat 33 | 8211 AR Lelystad | The Netherlands
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INCIDENTALES, INDIRECTOS, PUNITIVOS, MÚLTIPLES O CONSIGUIENTES EN RELACIÓN CON O
DERIVADOS DE ESTE DOCUMENTO, INCLUYENDO EL USO DEL MISMO.
Historial de revisiones: N.º de Pub. MAN0013801 (Español)
Rev.
Fecha
Descripción
A.0 27 noviembre
2017
Documento nuevo. Se ha convertido el documento anterior (MAN0013801
HEV_ELISA_PI_v1.0_es_111223.doc) a la plantilla del documento actual,
con actualizaciones asociadas a la información sobre la licencia limitada,
la garantía, las marcas comerciales y logotipos.
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condiciones de todas las licencias de etiquetado de uso limitado aplicables.
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propiedad de Thermo Fisher Scientific y sus subsidiarias a menos que se especifique lo contrario.
12345678910 11 12
A
Positive
Control
Sample
3
Sample
11
Sample
19
Sample
27
Sample
35
Sample
43
Sample
51
Sample
59
Sample
67
Sample
75
Sample
83
B
Positive
Control
Sample
4
Sample
12
Sample
20
Sample
28
Sample
36
Sample
44
Sample
52
Sample
60
Sample
68
Sample
76
Sample
84
C
Cut-Off
Control
Sample
5
Sample
13
Sample
21
Sample
29
Sample
37
Sample
45
Sample
53
Sample
61
Sample
69
Sample
77
Sample
85
D
Cut-Off
Control
Sample
6
Sample
14
Sample
22
Sample
30
Sample
38
Sample
46
Sample
54
Sample
62
Sample
70
Sample
78
Sample
86
E
Negative
Control
Sample
7
Sample
15
Sample
23
Sample
31
Sample
39
Sample
47
Sample
55
Sample
63
Sample
71
Sample
79
Sample
87
F
Negative
Control
Sample
8
Sample
16
Sample
24
Sample
32
Sample
40
Sample
48
Sample
56
Sample
64
Sample
72
Sample
80
Sample
88
G
Sample
1Sample
9
Sample
17
Sample
25
Sample
33
Sample
41
Sample
49
Sample
57
Sample
65
Sample
73
Sample
81
Sample
89
H
Sample
2
Sample
10
Sample
18
Sample
26
Sample
34
Sample
42
Sample
50
Sample
58
Sample
66
Sample
74
Sample
82
Sample
90
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