Thermo Fisher Scientific Applied Biosystems StepOne™ and StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems El manual del propietario

Marca: Thermo Fisher Scientific

Modelo: Applied Biosystems StepOne™ and StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems

Tipo: El manual del propietario

Applied Biosystems StepOne™

Real-Time PCR System

Experimentos de cuantificación relativa

y CTcomparativos

Guía de introducción

Applied Biosystems StepOne™

Real-Time PCR System

Experimentos de cuantificación relativa

Introducción

Diseño del

experimento de

curva

estándar relativa

Preparación de las

reacciones de la

curva

estándar relativa

Realización del

experimento de

curva estándar

relativa

Análisis del

experimento de

curva

estándar relativa

Diseño del

experimento de CT

comparativos

Preparación de las

reacciones de CT

comparativos

Realización del

experimento de CT

comparativos

Análisis del

experimento de CT

comparativos

Guía de introducción

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Número de referencia 4377742 Rev. B

06/2010

Contenido

iii

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Prólogo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii

Cómo utilizar esta guía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii

Cómo obtener más información . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . viii

Cómo obtener asistencia técnica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x

Convenciones de seguridad utilizadas en este documento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xi

Símbolos en los instrumentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xiii

Etiquetas de seguridad en los instrumentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xiv

Seguridad general del instrumento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xvi

Seguridad química . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xvii

Seguridad de residuos químicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xix

Seguridad eléctrica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xx

Seguridad de los LED . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxi

Seguridad biológica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxi

Seguridad de la estación de trabajo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxii

Estándares de seguridad y compatibilidad electromagnética (EMC) . . . . . . . . . . . xxiii

Capítulo 1 Introducción. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

Acerca del sistema StepOne™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

Acerca de los experimentos de cuantificación relativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

Cómo utilizar esta guía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

Acerca del experimento de ejemplo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

Flujo de trabajo del experimento de ejemplo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa . 15

Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

Creación de un nuevo experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

Definición de las propiedades del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

Definición de los métodos y materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

Configuración de los genes diana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

Configuración de los estándares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

Configuración de las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

Configuración de las opciones de cuantificación relativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

Configuración del protocolo de termociclado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

Revisión de la configuración de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

Solicitud de materiales para el experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva

estándar relativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

Preparación del molde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

Preparación de las diluciones de las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

Preparación de la dilución seriada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

Preparación de la mezcla de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

Preparación de la placa de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar

relativa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

Preparación de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

(Opcional) Activación de las notificaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

Inicio de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

Monitorización de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

Descarga de la placa de reacción y transferencia de datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar

relativa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

Sección 5.1: Revisión de los resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93

Análisis del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

Visualización de la curva estándar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100

Revisión de la gráfica de amplificación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103

Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos . . . . . . . . . . . . . . . 108

Presentación de los datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111

Sección 5.2: Solución de problemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113

Revisión de las opciones de análisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114

Revisión del resumen QC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116

Omisión de pocillos para el análisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118

Revisión de la gráfica multicomponente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120

Revisión de la gráfica de datos brutos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos . . . . . 125

Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126

Creación de un nuevo experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127

Definición de las propiedades del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129

Definición de los métodos y materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131

Configuración de los genes diana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135

Configuración de las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137

Configuración de las opciones de cuantificación relativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140

Configuración del protocolo de termociclado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141

Revisión de la configuración de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142

Solicitud de materiales para el experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148

Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152

Capítulo 7 Preparación de las reacciones

de CT comparativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155

Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156

Preparación del molde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157

Preparación de las diluciones de las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158

Preparación de la mezcla de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 160

Preparación de la placa de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163

Capítulo 8 Realización del experimento de CT comparativos. . 167

Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168

Preparación de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169

Realización del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos . . . . . 173

Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174

Sección 9.1: Revisión de los resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175

Análisis del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176

Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos . . . . . . . . . . . . . . . 182

Revisión de la gráfica de amplificación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185

Presentación de los datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191

Sección 9.2: Solución de problemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193

Revisión de las opciones de análisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194

Revisión del resumen QC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196

Omisión de pocillos para el análisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197

Revisión de la gráfica multicomponente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200

Revisión de la gráfica de datos brutos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Apéndice A Flujos de trabajo alternativos para el experimento . . . . 205

Flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 206

Flujo de trabajo QuickStart (Inicio rápido) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207

Flujo de trabajo de molde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 208

Flujo de trabajo de exportación/importación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209

Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211

Glosario. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213

Índice. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 227

vii

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Prólogo

Cómo utilizar esta guía

Finalidad de esta

guía

En esta guía, se explica cómo realizar experimentos de curva estándar relativa y CT

(∆∆CT) en Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System (sistema StepOne™).

Esta guía sirve de:

• Tutorial, utilizando los datos de los experimentos de ejemplo que se incluyen en

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Software (software

StepOne™).

• Guía para realizar sus propios experimentos.

Público Esta guía está destinada al personal de laboratorio y a los investigadores que realizan

experimentos de cuantificación relativa con el sistema StepOne.

Suposiciones En esta guía, se asume que el usuario:

• Está familiarizado con el sistema operativo Microsoft Windows® XP.

• Está familiarizado con Internet y los navegadores de Internet.

• Sabe cómo manejar muestras de DNA y/o RNA y prepararlas para la PCR.

• Sabe almacenar datos, transferir archivos y copiar y pegar.

• Tiene experiencia con redes si tiene pensado integrar el sistema StepOne en el flujo

de datos existente de su laboratorio.

Convenciones del

texto

En esta guía, se utilizan las siguientes convenciones:

•El texto en negrita indica una acción del usuario. Por ejemplo:

Escriba 0 y, a continuación, pulse Intro en cada uno de los campos restantes.

•El texto en cursiva señala palabras nuevas o importantes y también se utiliza para

enfatizar algo. Por ejemplo:

Antes de realizar el análisis, prepare siempre una matriz fresca.

• El símbolo de la flecha que apunta a la derecha () separa los comandos sucesivos

que se seleccionan en un menú desplegable o un menú de acceso directo. Por

ejemplo:

Seleccione File (Archivo)Open (Abrir).

Prólogo

Cómo obtener más información

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

viii

Palabras de aviso

para el usuario

En la documentación de Applied Biosystems, aparecen dos palabras de aviso para el

usuario. Cada palabra implica un nivel concreto de observación o acción, tal y como se

describe a continuación:

Nota: Proporciona información que puede ser interesante o útil, pero no es esencial para

el uso del producto.

¡IMPORTANTE! Proporciona información que es necesaria para poder utilizar el

instrumento correctamente, para poder utilizar un kit de reactivos con precisión o para

poder utilizar un producto químico de manera segura.

A continuación, se muestran algunos ejemplos de palabras de aviso para el usuario:

Nota: La función de calibración también está disponible en la consola de control.

¡IMPORTANTE! Para comprobar la conexión del cliente, necesita un identificador de

usuario válido.

Palabras de aviso

de seguridad

En la documentación del usuario, también aparecen palabras de aviso de seguridad. Para

obtener más información, consulte “Palabras de aviso de seguridad” en la página xi.

Cómo obtener más información

Documentación

relacionada

El sistema StepOne incluye la siguiente documentación:

Documento Núm. ref.

inglés

Núm. ref.

español

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting

Started Guide for Genotyping Experiments

4376786

4377729

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting

Started Guide for Presence/Absence Experiments 4376787

—

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting

Started Guide for Relative Standard Curve and Comparative CT

Experiments

4376785

4377742

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting

Started Guide for Standard Curve Experiments

4376784

4377736

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Installation,

Maintenance, and Networking Guide

4376782

4377798

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Installation

Quick Reference Card

4376783

4377792

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Site

Preparation Guide

4376768

4378359

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Software

Help

—

Prólogo

Cómo obtener más información

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Applied Biosystems puede proporcionarle la siguiente documentación auxiliar:

Nota: Para obtener más documentación, consulte “Cómo obtener asistencia técnica” en

la página x.

Obtención de

información de la

ayuda del

software

La ayuda del software StepOne describe cómo se utiliza cada función de la interfaz de

usuario. Para acceder a la ayuda desde el software StepOne, realice una de las siguientes

acciones:

•Pulse F1.

• Haga clic en en la barra de herramientas.

• Seleccione Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne).

Para buscar temas de interés en la ayuda:

• Consulte el índice de contenido.

• Busque un tema específico.

• Busque en un índice alfabético.

Envíenos sus

comentarios

Applied Biosystems agradece sus comentarios y sugerencias para mejorar sus

documentos de usuario. Puede enviar sus comentarios a la dirección de correo

electrónico:

[email protected]

¡IMPORTANTE! Esta dirección sólo sirve para enviar comentarios y sugerencias en

relación con la documentación. Para solicitar documentos, descargar archivos PDF u

obtener ayuda sobre una cuestión técnica, vaya a www.appliedbiosystems.com y, a

continuación, haga clic en el vínculo Support (Asistencia técnica). (Consulte “Cómo

obtener asistencia técnica” más adelante).

Documento

Número

referencia

Amplification Efficiency of TaqMan® Gene Expression Assays Application Note 127AP05

Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol 4375575

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Installation Performance

Verification Protocol

4376791

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Installation Qualification-

Operation Qualification Protocol

4376790

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Planned Maintenance

Protocol

4376788

Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol 4334429

Primer Express® Software Version 3.0 Getting Started Guide 4362460

TaqMan® Gene Expression Assays Protocol 4333458

User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression 4303859

Prólogo

Cómo obtener asistencia técnica

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Cómo obtener asistencia técnica

Para acceder a los servicios más recientes y obtener información acerca de la asistencia

técnica, vaya a www.appliedbiosystems.com y, a continuación, haga clic en el vínculo

Support (Asistencia técnica).

En la página Support (Asistencia técnica), puede:

• Buscar las preguntas más frecuentes (FAQ)

• Enviar una pregunta directamente al Servicio de asistencia técnica

• Solicitar a Applied Biosystems documentos de usuario, fichas técnicas de solicitud

de materiales (MSDS), certificados de análisis y otros documentos relacionados

• Descargar documentos PDF

• Obtener información acerca de la formación del cliente

• Descargar actualizaciones y parches de software

Asimismo, en la página Support (Asistencia técnica) podrá acceder a los números de

teléfono y fax para ponerse en contacto con el Servicio de asistencia técnica y las

instalaciones de venta de Applied Biosystems en todo el mundo.

¡IMPORTANTE! Cuando se le solicite que lo haga en esta guía o cuando tenga que

programar el mantenimiento del instrumento StepOne™ (por ejemplo, el mantenimiento

anual planificado o la verificación/calibración de la temperatura), póngase en contacto

con el Centro de atención al cliente de Applied Biosystems. Para obtener un número de

teléfono o enviar un mensaje de correo electrónico al centro, visite

http://www.appliedbiosystems.com/support/contact.

Prólogo

Convenciones de seguridad utilizadas en este documento

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Convenciones de seguridad utilizadas en este documento

Palabras de aviso

de seguridad

En la documentación del usuario de Applied Biosystems, aparecen cuatro palabras de

aviso de seguridad en los puntos del documento en los que debe conocer la existencia de

peligros importantes. Cada palabra de aviso (IMPORTANTE, PRECAUCIÓN,

ADVERTENCIA, PELIGRO) implica un nivel de observación o acción particular, tal y

como se explica a continuación.

Definiciones

¡IMPORTANTE! Proporciona información que es necesaria para poder utilizar el

instrumento correctamente, para poder utilizar un kit de reactivos con precisión o para

poder utilizar un producto químico de manera segura.

Indica una situación potencialmente peligrosa que, de no evitarse,

podría causar lesiones leves o moderadas. También puede utilizarse para alertar de

prácticas no seguras.

Indica una situación potencialmente peligrosa que, de no evitarse,

podría causar lesiones graves o mortales.

Indica una situación inminentemente peligrosa que, de no evitarse,

tendrá como resultado lesiones graves o mortales. Esta palabra de aviso se limita a las

situaciones más extremas.

A excepción de los avisos IMPORTANTE, todas las palabras de aviso de seguridad de un

documento de Applied Biosystems aparecen con la figura de un triángulo abierto que

contiene un símbolo de peligro. Estos símbolos de peligro son idénticos a los que se

incorporan en los instrumentos de Applied Biosystems (consulte “Símbolos de

seguridad” en la página xiii).

Prólogo

Convenciones de seguridad utilizadas en este documento

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

xii

Ejemplos

¡IMPORTANTE! Debe crear una hoja de cálculo de entradas de las muestras diferente

para cada placa de 96 pocillos.

PELIGRO QUÍMICO. TaqMan® Universal PCR Master Mix

puede causar irritaciones en la piel y los ojos. Puede provocar molestias si se ingiere o se

inhala. Consulte la ficha técnica de seguridad (MSDS) y siga las instrucciones de

manipulación indicadas. Use protectores oculares, vestimenta protectora y guantes

apropiados.

PELIGRO DE LESIONES FÍSICAS. Durante el uso de los

instrumentos, la cubierta caliente y el bloque, se pueden alcanzar temperaturas

superiores a 100 °C.

PELIGRO ELÉCTRICO. La continuidad del circuito de toma a

tierra es vital para la seguridad. Jamás utilice el sistema con el conductor de toma de

tierra desconectado.

Prólogo

Símbolos en los instrumentos

xiii

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Símbolos en los instrumentos

Electricidad

Símbolos en los

instrumentos

En la siguiente tabla, se describen los símbolos eléctricos que pueden aparecer en los

instrumentos de Applied Biosystems.

Símbolos de

seguridad

En la siguiente tabla, se describen los símbolos de seguridad que pueden aparecer en los

instrumentos de Applied Biosystems. Estos símbolos pueden aparecer en solitario o con

un texto que explique el peligro correspondiente (consulte “Etiquetas de seguridad en los

instrumentos” en la página xiv). Estos símbolos de seguridad también pueden aparecer

junto a PELIGROS, ADVERTENCIAS y PRECAUCIONES que se incluyen en el texto

de este o de otros documentos de ayuda de productos.

Símbolo Descripción Símbolo Descripción

Indica la posición On (Encendido)

del interruptor de encendido

principal.

Indica un terminal que puede

estar conectado a la referencia

del retorno de tierra del circuito

de señal de otro instrumento.

No es un terminal de tierra

protegido.

Indica la posición Off (Apagado)

del interruptor de encendido

principal. Este símbolo indica que se

debe conectar a tierra un

terminal de toma a tierra de

protección antes de realizar

ninguna otra conexión eléctrica

en el instrumento.

Indica un interruptor de espera

por medio del cual se activa la

posición Standby (Espera) en el

instrumento. Si este interruptor

está en la posición de espera,

puede haber peligro de tensión. Indica que un terminal puede

recibir o suministrar tensión o

corriente alterna.

Indica la posición On/Off

(Encendido/Apagado) de un

interruptor de encendido principal

de contrafase.

Indica que un terminal puede

recibir o suministrar tensión o

corriente alterna o continua.

Símbolo Descripción Símbolo Descripción

Indica que debería consultar el

manual para obtener más

información y proceder con el

cuidado correspondiente.

Indica la presencia de piezas

móviles y recomienda

proceder con el cuidado

correspondiente.

Indica la presencia de un

peligro de descarga eléctrica

y recomienda proceder con el

cuidado correspondiente.

Indica la presencia de una

superficie caliente u otro peligro

debido a altas temperaturas y

recomienda proceder con el

cuidado correspondiente. Indica la presencia de un láser

en el interior del instrumento y

recomienda proceder con el

cuidado correspondiente.

Prólogo

Etiquetas de seguridad en los instrumentos

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

xiv

Medio ambiente

Símbolos en los

instrumentos

El siguiente símbolo se aplica a todos los productos eléctricos y electrónicos de

Applied Biosystems que salieron al mercado europeo después del 13 de agosto de 2005.

Etiquetas de seguridad en los instrumentos

Los siguientes símbolos de PRECAUCIÓN, ADVERTENCIA y PELIGRO pueden

aparecer en los instrumentos de Applied Biosystems en combinación con los símbolos

de seguridad que se han descrito en la sección anterior.

Símbolo Descripción

No tire este producto a la basura municipal normal. Cumpla las ordenanzas

municipales sobre residuos correspondientes para reducir el impacto

medioambiental de los residuos de equipos eléctricos y electrónicos (WEEE).

Clientes de la Unión Europea:

Llame a la oficina de atención al cliente local de Applied Biosystems para

informarse sobre la recogida de equipos y el reciclaje. Consulte en

http://www.appliedbiosystems.com un listado de oficinas de atención al cliente

de la Unión Europea.

Inglés Francés

CAUTION Hazardous chemicals. Read the

Material Safety Data Sheets (MSDSs) before

handling.

ATTENTION Produits chimiques dangeureux.

Lire les fiches techniques de sûreté de

matériels avant la manipulation des produits.

CAUTION Hazardous waste. Refer to

MSDS(s) and local regulations for handling

and disposal.

ATTENTION Déchets dangereux. Lire les

fiches techniques de sûreté de matériels et la

régulation locale associées à la manipulation

et l'élimination des déchets.

CAUTION Hot surface. ATTENTION Surface brûlante.

DANGER High voltage. DANGER Haute tension.

WARNING To reduce the chance of electrical

shock, do not remove covers that require tool

access. No user-serviceable parts are inside.

Refer servicing to Applied Biosystems

qualified service personnel.

AVERTISSEMENT Pour éviter les risques

d'électrocution, ne pas retirer les capots dont

l'ouverture nécessite l'utilisation d'outils.

L’instrument ne contient aucune pièce

réparable par l’utilisateur. Toute intervention

doit être effectuée par le personnel de service

qualifié de Applied Biosystems.

CAUTION Moving parts. ATTENTION Parties mobiles.

DANGER Class 3B (III) visible and/or invisible

LED radiation present when open and

interlocks defeated. Avoid exposure to beam.

DANGER Rayonnement visible ou invisible

d’un faisceau LED de Classe 3B (III) en cas

d’ouverture et de neutralisation des

dispositifs de sécurité. Evitez toute

exposition au faisceau.

Prólogo

Etiquetas de seguridad en los instrumentos

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Ubicaciones de

los símbolos de

advertencia

El sistema StepOne contiene una advertencia en el lugar que se indica a continuación:

Prólogo

Seguridad general del instrumento

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

xvi

Seguridad general del instrumento

PELIGRO DE LESIONES FÍSICAS. Si el instrumento se utiliza

de alguna forma que no especifica Applied Biosystems, se pueden producir lesiones

personales o daños en el instrumento.

Movimiento y

levantamiento del

instrumento

PELIGRO DE LESIONES FÍSICAS. El instrumento sólo puede

moverlo y colocarlo el personal o el distribuidor que se especifique en la guía de

preparación del emplazamiento correspondiente. Si decide levantar o mover el

instrumento después de instalarlo, no intente hacerlo sin la ayuda de otras personas, el

equipo de traslado adecuado y las técnicas de elevación correctas. El levantamiento

inapropiado puede causar dolorosas lesiones dorsales, que pueden resultar permanentes.

Dependiendo del peso, se podrían necesitar dos personas para mover o levantar un

instrumento.

Movimiento y

levantamiento de

ordenadores y

monitores

autónomos

No intente levantar o mover el ordenador ni el monitor sin la ayuda

de otras personas. Dependiendo del peso del ordenador y/o el monitor, se podrían

necesitar dos o más personas para moverlos.

Aspectos a tener en cuenta antes de levantar el ordenador y/o el monitor:

• Asegúrese de sujetar el ordenador o el monitor de un lugar seguro y cómodo para

levantarlos.

• Asegúrese de que no hay ningún obstáculo entre el lugar en el que se encuentra el

objeto y su lugar de destino.

• No levante un objeto a la vez que gira el torso.

• Mantenga la columna espinal en una posición neutral mientras levanta el objeto con

las piernas.

• Los participantes deben coordinar las labores de levantamiento y movimiento antes

de realizarlas.

• En lugar de levantar el objeto desde la caja del embalaje, incline cuidadosamente la

caja hacia un lado y manténgala fija mientras alguien desliza su contenido hacia

fuera.

Uso del

instrumento

Asegúrese de que todas las personas que utilicen el instrumento:

• Han recibido instrucciones sobre prácticas de seguridad generales para laboratorios

y prácticas de seguridad generales para el instrumento.

• Lea y comprenda todas las fichas técnicas de seguridad de los materiales (MSDS)

aplicables. Consulte “Acerca de las fichas técnicas de seguridad de los materiales

(MSDS)” en la página xvii.

Limpieza o

descontamina-

ción del

instrumento

Antes de utilizar un método de limpieza o descontaminación que no

sea el que recomienda el fabricante, consulte al fabricante para comprobar que el método

propuesto no va a dañar el equipo.

Prólogo

Seguridad química

xvii

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Seguridad química

Advertencia de

peligro químico

PELIGRO QUÍMICO. Antes de manejar algún producto químico,

consulte la ficha técnica de seguridad de los materiales (MSDS) que suministra el

fabricante y observe todas las precauciones relevantes.

PELIGRO DE ALMACENAMIENTO QUÍMICO. No recoja ni

almacene nunca los residuos en un envase de cristal, pues corre el riesgo de que se rompa

o se resquebraje. Las botellas de reactivos y de residuos pueden agrietarse y presentar

fugas. Cada botella de residuos deberá asegurarse en un recipiente de seguridad de

polietileno de baja densidad con la tapa fija y las asas bloqueadas en posición vertical.

Utilice la protección ocular, la vestimenta y los guantes adecuados cuando manipule

botellas de reactivos o de residuos.

Directrices de

seguridad

química

Para reducir al mínimo el peligro de los productos químicos:

• Lea y comprenda las fichas técnicas de seguridad de los materiales (MSDS) que

proporciona el fabricante de los productos químicos antes de almacenar, manipular

o trabajar con cualquier producto químico o material peligroso. (Consulte “Acerca

de las fichas técnicas de seguridad de los materiales (MSDS)” en la página xvii.)

• Minimice el contacto con productos químicos. Utilice un equipo adecuado de

protección personal durante la manipulación de productos químicos (por ejemplo,

protectores oculares, guantes o vestimenta protectora). Puede encontrar más normas

de seguridad en las MSDS.

• Minimice la inhalación de productos químicos. No deje abiertos los recipientes de

productos químicos. Utilícelos únicamente con la ventilación adecuada (por

ejemplo, una campana extractora). Puede encontrar más normas de seguridad en las

MSDS.

• Compruebe periódicamente la ausencia de fugas o salpicaduras. Si se produce una

fuga o un derrame, siga los procedimientos de limpieza del fabricante, tal y como se

recomienda en la MSDS.

• Cumpla todas las leyes y normativas locales, estatales/provinciales o nacionales en

materia de almacenamiento, manipulación y eliminación de productos químicos.

Acerca de las

fichas técnicas de

seguridad de los

materiales

(MSDS)

Los fabricantes de productos químicos incluyen fichas técnicas de seguridad de los

materiales (MSDS) con los productos químicos peligrosos que envían a sus clientes

nuevos. También incluyen MSDS con el primer envío de un producto químico peligroso

a un cliente después de que esa MSDS se haya actualizado. En las MSDS, encontrará la

información de seguridad necesaria para almacenar, manipular, transportar y desechar

los productos químicos de forma segura.

Cada vez que reciba una MSDS nueva con un producto químico peligroso, no se olvide

de reemplazar la MSDS correspondiente en sus archivos.

Prólogo

Seguridad química

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

xviii

Obtención

de MSDS

Las MSDS de cualquier producto químico de Applied Biosystems están a su disposición

de manera gratuita las 24 horas del día. Para obtener MSDS:

1. Vaya a https://docs.appliedbiosystems.com/msdssearch.html

2. En el campo de búsqueda de la página de búsqueda de MSDS:

a. Escriba el nombre del producto químico, el número de serie u otra información

de interés que espere que aparezca en la MSDS.

b. Seleccione el idioma que desee.

c. Haga clic en Search (Buscar).

3. Para ver, descargar o imprimir el documento que le interesa:

a. Haga clic con el botón derecho en el título del documento.

b. Seleccione:

•Open (Abrir): para ver el documento.

•Save Target As (Guardar destino como): para descargar una versión PDF

del documento en el destino que seleccione.

•Print Target (Imprimir destino): para imprimir el documento.

4. Para enviar una copia de una MSDS por fax o correo electrónico, en la página de

resultados de la búsqueda:

a. Seleccione Fax o Email bajo el título del documento.

b. Haga clic en RETRIEVE DOCUMENTS (Recuperar documentos) al final de

la lista de documentos.

c. Introduzca la información requerida.

d. Haga clic en View/Deliver Selected Documents Now (Ver/enviar ahora los

documentos seleccionados).

Nota: Para obtener las MSDS de productos químicos que no distribuye

Applied Biosystems, póngase en contacto con el fabricante del producto químico.

Prólogo

Seguridad de residuos químicos

xix

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Seguridad de residuos químicos

Peligro de

residuos químicos

RESIDUOS PELIGROSOS. Para obtener información acerca de su

manipulación y eliminación, consulte las fichas técnicas de seguridad de los materiales y

las normativas locales.

PELIGRO DE RESIDUOS QUÍMICOS. Los residuos producidos

por los instrumentos de Applied Biosystems son potencialmente peligrosos y pueden

causar lesiones, enfermedades o la muerte.

PELIGRO DE ALMACENAMIENTO QUÍMICO. No recoja ni

almacene nunca los residuos en un envase de cristal, pues corre el riesgo de que se rompa

o se resquebraje. Las botellas de reactivos y de residuos pueden agrietarse y presentar

fugas. Cada botella de residuos deberá asegurarse en un recipiente de seguridad de

polietileno de baja densidad con la tapa fija y las asas bloqueadas en posición vertical.

Utilice la protección ocular, la vestimenta y los guantes adecuados cuando manipule

botellas de reactivos o de residuos.

Directrices de

seguridad de

residuos químicos

Para reducir al mínimo el peligro de los residuos químicos:

• Lea y comprenda las fichas técnicas de seguridad de los materiales (MSDS)

proporcionadas por los fabricantes de los productos químicos en el recipiente de

residuos antes de almacenar, manipular o eliminar los residuos químicos.

• Disponga de contenedores de residuos principales y secundarios. (Los contenedores

principales contienen los residuos inmediatos. Los contenedores secundarios

contienen cualquier derrame o fuga del contenedor principal. Ambos contenedores

deben ser compatibles con el material de residuo y deben cumplir los requisitos

federales, estatales y locales sobre el almacenamiento en contenedores).

• Minimice el contacto con productos químicos. Utilice un equipo adecuado de

protección personal durante la manipulación de productos químicos (por ejemplo,

protectores oculares, guantes o vestimenta protectora). Puede encontrar más normas

de seguridad en las MSDS.

• Minimice la inhalación de productos químicos. No deje abiertos los recipientes de

productos químicos. Utilícelos únicamente con la ventilación adecuada (por

ejemplo, una campana extractora). Puede encontrar más normas de seguridad en las

MSDS.

• Manipule los residuos químicos bajo una campana extractora.

• Después de vaciar el recipiente de residuos, ciérrelo bien con la tapa suministrada.

• Elimine el contenido de la bandeja de residuos y de la botella de residuos conforme

a las buenas prácticas de laboratorio y a la normativa local, estatal/provincial o

nacional en materia de medio ambiente y salud.

Prólogo

Seguridad eléctrica

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Eliminación de

residuos

Si se generan residuos potencialmente peligrosos al utilizar el instrumento, debe:

• Identificar (mediante análisis, si es necesario) los residuos generados por las

aplicaciones, los reactivos y los sustratos utilizados en su laboratorio.

• Garantizar la salud y la seguridad de todo el personal de su laboratorio.

• Garantizar que los residuos producidos por el instrumento se almacenan,

transfieren, transportan y eliminan de acuerdo con todas las normativas locales,

estatales/provinciales y/o nacionales.

¡IMPORTANTE! Los materiales radiactivos o que impliquen un peligro biológico pueden

requerir una manipulación especial, pudiéndose aplicar limitaciones en materia de

eliminación.

Seguridad eléctrica

PELIGRO DE DESCARGA ELÉCTRICA. Se puede producir una

descarga eléctrica grave si se utiliza el sistema StepOne sin haber colocado los paneles

del instrumento. No quite los paneles del instrumentos. Los contactos de alta tensión

quedan expuestos al quitar estos paneles del instrumento.

Fusibles PELIGRO DE INCENDIO. El uso de fusibles o de una fuente de

alimentación de alta tensión incorrectos puede dañar el sistema de cableado del

instrumento y provocar un incendio. Antes de encender el instrumento, compruebe que

los fusibles están bien instalados y que la tensión del instrumento se corresponde con la

fuente de alimentación del laboratorio.

PELIGRO DE INCENDIO. Para protegerse contra el riesgo de

incendio, sólo cambie los fusibles por otros que sean del tipo y la potencia que se

especifica para el instrumento.

Alimentación

eléctrica

PELIGRO ELÉCTRICO. La continuidad del circuito de toma de

tierra es vital para la seguridad del equipo. Jamás utilice el equipo con el conductor de

toma de tierra desconectado.

PELIGRO ELÉCTRICO. Utilice cordones eléctricos certificados y

bien configurados para el suministro eléctrico de la instalación.

PELIGRO ELÉCTRICO. Enchufe el sistema a una toma eléctrica

que tenga una toma de tierra adecuada y la capacidad de corriente apropiada.

Potencia de

sobretensión

El sistema StepOne se incluye en la categoría II (de sobretensión) de las instalaciones y

está clasificado como un equipo portátil.

Prólogo

Seguridad de los LED

xxi

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Seguridad de los LED

Para garantizar un funcionamiento seguro de los LED:

• Un representante de Applied Biosystems debe realizar el mantenimiento del

sistema.

• Todos los paneles del instrumentos deben estar colocados en el instrumento

mientras éste está en funcionamiento. Cuando todos los paneles están instalados, no

se detecta ninguna radiación. Si se quita algún panel cuando el LED está en

funcionamiento (durante una reparación con los interbloqueos de seguridad

desactivados), podría exponerse a emisiones LED superiores a la potencia de la

clase 3B.

• No quite las etiquetas de seguridad ni desactive los interbloqueos de seguridad.

Seguridad biológica

Peligro biológico

general

PELIGRO BIOLÓGICO. Las muestras biológicas como, por

ejemplo, de tejidos, fluidos corporales, agentes infecciosos y sangre humana o de otros

animales, pueden transmitir enfermedades infecciosas. Siga todas las normativas locales,

estatales/provinciales y/o nacionales aplicables. Lleve el equipo de protección adecuado,

lo que incluye, entre otras cosas: protección ocular, protección facial, vestimenta/bata de

laboratorio y guantes. Todo el trabajo se debe realizar en instalaciones que dispongan del

equipamiento adecuado y con el equipo de seguridad apropiado (por ejemplo,

dispositivos de contención física). Los trabajadores deberían recibir formación de

acuerdo con los requisitos de la institución o empresa y los requisitos legales aplicables

antes de trabajar con materiales potencialmente infecciosos. Lea y siga las directrices y/o

los requisitos legales aplicables en:

• Las directrices del Departamento de Salud y Servicios Humanos (Department of

Health and Human Services) de EE.UU. publicadas en Biosafety in Microbiological

and Biomedical Laboratories (nº 017-040-00547-4; http://bmbl.od.nih.gov)

• Occupational Safety and Health Standards, Bloodborne Pathogens (29

CFR§1910.1030; http://www.access.gpo.gov/ nara/cfr/waisidx_01/

29cfr1910a_01.html).

• Los protocolos del programa de seguridad biológica de su empresa o institución

para trabajar o manipular materiales potencialmente infecciosos.

Puede encontrar más información acerca de las directrices sobre peligros biológicos en:

http://www.cdc.gov

Prólogo

Seguridad de la estación de trabajo

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

xxii

Seguridad de la estación de trabajo

Si configura correctamente la ergonomía de su estación de trabajo, puede reducir o evitar

problemas de fatiga, dolor y tensión. Para minimizar o eliminar estos problemas,

configure la estación de trabajo para adoptar posiciones neutrales o relajadas cuando esté

trabajando.

PELIGRO MUSCULOESQUELÉTICO Y POR

MOVIMIENTOS REPETITIVOS. Estos peligros están causados por posibles factores

de riesgo, incluidos, entre otros, movimientos repetitivos, posturas incómodas, esfuerzos,

mantenimiento de posturas estáticas poco saludables, presión por contacto y otros

factores medioambientales de la estación de trabajo.

Para minimizar los riesgos musculoesqueléticos y por movimientos repetitivos:

• Utilice equipos en los que pueda colocarse cómodamente en posiciones neutrales y

que permitan acceder de manera adecuada al teclado, el monitor y el ratón.

• Coloque el teclado, el ratón y el monitor de forma que pueda adoptar una postura

relajada de la cabeza y el cuerpo.

Prólogo

Estándares de seguridad y compatibilidad electromagnética (EMC)

xxiii

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Estándares de seguridad y compatibilidad electromagnética

(EMC)

Estándares de

seguridad de

EE.UU.

y Canadá

El sistema StepOne ha sido probado y cumple el estándar:

UL 61010A-1/CAN/CSA C22.2 No. 1010.1-92, “Requisitos de seguridad de equipos

eléctricos para la medición, el control y el uso en laboratorios, Primera parte: Requisitos

Generales”.

UL 61010A-2-010/CAN/CSA 1010.2.010, “Requisitos particulares de equipos de

laboratorio para el calentamiento de materiales”.

“Estándar de rendimiento 21 CFR 1040.10 y 1040.11 de la Ley de control de radiaciones

para la salud y la seguridad de 1968” de la FDA, de la forma que sea aplicable.

Estándar EMC

canadiense

Este instrumento ha sido probado y cumple la edición 3 del estándar ICES-001:

“Generadores de frecuencias de radio industriales, científicas y médicas”.

Estándares de

seguridad y EMC

europeos

Seguridad

Este instrumento cumple los requisitos de seguridad europeos (Directiva de baja tensión

73/23/EEC). Este instrumento ha sido probado y cumple los estándares EN 61010-

1:2001, “Requisitos de seguridad de equipos eléctricos para la medición, el control y el

uso en laboratorios, Primera parte: Requisitos Generales”.

EN 61010-2-010, “Requisitos particulares de equipos de laboratorio para el

calentamiento de materiales”.

EN 61010-2-081, “Requisitos particulares para equipos de laboratorio automáticos y

semiautomáticos para análisis y otras finalidades”.

EN 60825-1, “Seguridad frente a las radiaciones de los productos láser, clasificación de

los equipos, requisitos y guía del usuario”.

EMC

Este instrumento cumple los requisitos de emisiones e inmunidad europeos (Directiva

EMC 89/336/EEC). Este instrumento ha sido probado y cumple los estándares

EN 61326 (Grupo 1, Clase B) “Equipos eléctricos para la medición, el control y el uso

en laboratorios: requisitos EMC”.

Estándares EMC

australianos

Este instrumento ha sido probado y cumple el estándar AS/NZS 2064, “Medición de

límites y métodos de características de perturbaciones electromagnéticas de equipos de

radiofrecuencia industriales, científicos y médicos (ISM)”.

Prólogo

Estándares de seguridad y compatibilidad electromagnética (EMC)

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

xxiv

Capítulo 1

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Introducción

Este capítulo cubre los siguientes temas:

■Acerca del sistema StepOne™. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

■Acerca de los experimentos de cuantificación relativa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

■Cómo utilizar esta guía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

■Acerca del experimento de ejemplo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

■Flujo de trabajo del experimento de ejemplo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

Nota: Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en

esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR

System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o

seleccionando Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne).

Capítulo 1 Introducción

Acerca del sistema StepOne™

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Acerca del sistema StepOne™

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System (sistema StepOne™) utiliza

reactivos de reacción en cadena de polimerasa (PCR) basados en fluorescencias para

proporcionar:

• Detección cuantitativa de las secuencias de ácidos nucléicos de interés (dianas)

mediante análisis a tiempo real.

• Detección cualitativa de secuencias de ácidos nucléicos de interés (dianas) mediante

análisis de punto final y curva de disociación.

Acerca de la

recogida de

datos

El sistema StepOne recoge datos de fluorescencia brutos en diferentes puntos de una

PCR, dependiendo del tipo de reacción que realice:

Con independencia del tipo de reacción que se realice, un punto de recogida de datos o

una lectura consta de tres fases:

1. Excitación: el instrumento StepOne™ ilumina todos los pocillos de la placa de

reacción para excitar los fluorocromos correspondientes.

2. Emisión: la óptica del instrumento StepOne recoge la fluorescencia residual emitida

en todos los pocillos de la placa de reacción. La imagen resultante captada por el

dispositivo sólo consta de la luz emitida en un estrecho rango de longitudes de onda.

3. Recogida: el instrumento StepOne crea una representación digital de la

fluorescencia residual recogida en un intervalo fijo de tiempo. El software StepOne

almacena el dato bruto de la imagen fluorescente para analizarlo. Si fuera necesario,

el software realizaría lecturas adicionales si lo requirieran los reactivos fluorescentes

utilizados en el experimento.

Después de una reacción, el software StepOne utiliza datos de calibración (espacial,

espectral y de ruido de fondo) para determinar la ubicación y la intensidad de las señales

fluorescentes en cada lectura, el fluorocromo asociado a cada señal fluorescente y el

significado de la señal.

Tipo de proceso Punto de recogida de datos

Procesos a

tiempo real Curva estándar El instrumento recoge datos después de cada paso

de extensión de la PCR.

Curva estándar

relativa

CT comparativos

(∆∆CT)

Procesos a

punto final Genotipado El instrumento recoge datos antes y después de la

PCR. En los experimentos de genotipado, el software

StepOne™ también puede recoger datos durante la

reacción (tiempo real), que pueden resultar de ayuda

para solucionar problemas.

Presencia/ausencia El instrumento recoge datos antes y después de la

PCR.

Capítulo 1 Introducción

Acerca del sistema StepOne™

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Consumibles

admitidos

El sistema StepOne admite los consumibles que se enumeran a continuación. Estos

consumibles se utilizan tanto para reacciones en modo estándar como en modo rápido.

Consumible Número de

referencia

•MicroAmp

™ Fast Optical 48-Well Reaction Plates

•MicroAmp

™ Optical 48-Well Adhesive Film

• 4375816

• 4375323

•MicroAmp

™ Fast 8-Tube Strips

•MicroAmp

™ Optical 8-Cap Strips

• 4358293

• 4323032

•MicroAmp

® Fast Reaction Tubes with Caps • 4358297

•MicroAmp

™ Fast 48-Well Trays

•MicroAmp

™ 48-Well Base Adaptor

•MicroAmp

™ Splash Free 96-Well Base

• 4375282

• 4375284

• 4312063

# Consumible

AMicroAmp

™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate

BMicroAmp

™ Fast 48-Well Tray

CMicroAmp

™ Splash Free 96-Well Base

DMicroAmp

™ Optical 8-Cap Strip

EMicroAmp

™ Fast 8-Tube Strip

FMicroAmp

® Fast Reaction Tubes with Caps

G MicroAmp Optical 48-Well Adhesive Film

Capítulo 1 Introducción

Acerca de los experimentos de cuantificación relativa

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de:

• El sistema StepOne, consulte Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

Software Help.

Nota: Para acceder a la ayuda, seleccione Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de

StepOne) desde el software StepOne.

• Experimentos de cuantificación absoluta, consulte Guía de introducción a Applied

Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de curva estándar.

• Experimentos de genotipado, consulte Guía de introducción a Applied Biosystems

StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de genotipado.

• Experimentos de presencia/ausencia, consulte Applied Biosystems StepOne™ Real-

Time PCR System Getting Started Guide for Presence/Absence Experiments.

Acerca de los experimentos de cuantificación relativa

Experimentos de

PCR a tiempo

real

Los experimentos de cuantificación relativa son experimentos de PCR a tiempo real. En

los experimentos de PCR a tiempo real:

• El instrumento monitoriza el progreso de la PCR mientras se produce (Kwok y

Higuchi, 1989).

• Se recogen datos durante la reacción de PCR.

• Las reacciones se caracterizan por el ciclo en el que se detecta por primera vez la

amplificación de un gen diana (Saiki et al., 1985).

Nota: En esta guía, el término experimento se refiere a todo el proceso del experimento,

desde su diseño hasta el análisis de los datos.

Acerca de los

experimentos de

curva estándar

relativa

Los experimentos de curva estándar relativa determinan el cambio de expresión de un

gen diana en una muestra en relación con el mismo gen en una muestra de referencia.

Para conseguir los resultados, se utiliza una curva estándar construida a partir de una

dilución seriada de una muestra de concentración conocida.

Los experimentos de curva estándar relativa se suelen utilizar para:

• Comparar niveles de expresión de un gen en diferentes tejidos.

• Comparar los niveles de expresión de un gen en una muestra tratada y en una

muestra no tratada.

• Comparar los niveles de expresión de alelos de tipo salvaje y alelos mutados.

Componentes

Estos son los componentes que se necesitan para preparar las reacciones de PCR para los

experimentos de curva estándar relativa:

•Muestra: la muestra en la que la cantidad del gen diana es desconocida.

Capítulo 1 Introducción

Acerca de los experimentos de cuantificación relativa

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

•Muestra de referencia: la muestra utilizada como referencia para los resultados de

la comparación. Por ejemplo, en un estudio sobre los efectos de las drogas en la

expresión génica, un control no tratado sería una muestra de referencia apropiada.

•Estándar: una muestra de concentración conocida.

•Dilución seriada: un conjunto de diluciones del estándar (por ejemplo, 1:2, 1:4, 1:8,

1:16, 1:32) que se utilizan para construir una curva estándar. En todas las muestras,

la cantidad del gen diana se determina realizando una interpolación a partir de la

curva estándar y luego dividiendo por la cantidad del gen diana de la muestra de

referencia. Dado que la muestra de referencia es la muestra 1✕, todas las demás

cantidades se expresan como una diferencia multiplicada por n relativa a ella.

Asimismo, la unidad de la curva estándar se cancela porque la cantidad de muestra

se divide por la cantidad de muestra de referencia. Por consiguiente, lo único que se

necesita de los estándares es conocer sus diluciones relativas. Por lo tanto, se puede

utilizar cualquier cDNA, RNA o DNA de la solución de partida que contenga el gen

diana apropiado para preparar los estándares.

•Control endógeno: un gen presente en un nivel de expresión uniforme en todas las

muestras. El control endógeno sirve para normalizar posibles variaciones de la

cantidad de cDNA que se añade a cada reacción que se producen a consecuencia de

imprecisiones en el pipeteo.

•Réplicas: reacciones idénticas que contienen componentes y volúmenes idénticos.

•Controles negativos: muestras que contienen agua o tampón en lugar de un molde.

En los controles negativos no debería haber amplificación.

Acerca de los

experimentos de

CT comparativos

Los experimentos de CT comparativos (∆∆CT) determinan el cambio de expresión de un

gen diana en una muestra en relación con el mismo gen en una muestra de referencia.

Para obtener los resultados, se utilizan fórmulas aritméticas.

Los experimentos de CT comparativos se suelen utilizar para:

• Comparar niveles de expresión de un gen en diferentes tejidos.

• Comparar los niveles de expresión de un gen en una muestra tratada y en una

muestra no tratada.

• Comparar los niveles de expresión de alelos de tipo salvaje y alelos mutados.

Componentes

Estos son los componentes que se necesitan para preparar las reacciones de PCR para los

experimentos de CT comparativos:

•Muestra: la muestra en la que la cantidad del gen diana es desconocida.

•Muestra de referencia: la muestra utilizada como referencia para los resultados de

la comparación. Por ejemplo, en un estudio sobre los efectos de las drogas en la

expresión de los genes, un control no tratado sería una muestra de referencia

apropiada.

•Control endógeno: un gen presente en un nivel de expresión uniforme en todas las

muestras. El control endógeno sirve para normalizar posibles variaciones de la

cantidad de cDNA que se añade a cada reacción que se producen a consecuencia de

imprecisiones en el pipeteo.

Capítulo 1 Introducción

Acerca de los experimentos de cuantificación relativa

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

•Réplicas: reacciones idénticas que contienen componentes y volúmenes idénticos.

•Controles negativos: muestras que contienen agua o tampón en lugar de un molde.

En los controles negativos no debería haber amplificación.

Experimentos de

curva estándar

relativa y

experimentos de

CT comparativos

Tenga en cuenta lo siguiente a la hora de elegir entre experimentos de curva estándar

relativa y experimentos de CT comparativos:

Opciones de la

PCR

Al realizar una PCR a tiempo real, puede elegir entre:

• PCR en singleplex y en multiplex (más abajo)

• RT-PCR de 1 y 2 pasos (página 7)

Tipo de

experimento Descripción Ventaja Limitación

Curva estándar

relativa Se utiliza una curva estándar

para determinar el cambio de

expresión de un gen diana en

una muestra en relación con el

mismo gen diana en una

muestra de referencia. Es ideal

para los ensayos que tienen una

eficiencia de PCR por debajo de

la óptima.

Es el experimento que requiere

menos validación, porque las

eficiencias de PCR del gen diana

y el control endógeno no tienen

que ser equivalentes.

Se debe crear una curva

estándar para cada gen diana, lo

que exige más reactivos y más

espacio en la placa de reacción.

comparativos

(∆∆CT)

Se utilizan fórmulas aritméticas

para determinar el cambio de

expresión de un gen diana en

una muestra en relación con el

mismo gen diana en una

muestra de referencia. Es ideal

para analizar la expresión

relativa de muchos genes de

interés en un gran número de

muestras.

• Los niveles relativos de

expresión de un gen diana en

las muestras se pueden

determinar sin utilizar una

curva estándar, siempre que

las eficiencias de PCR del

gen diana y el control

endógeno sean relativamente

equivalentes.

• Menor uso de reactivos.

• Más espacio disponible en la

placa de reacción.

• Los ensayos que no son

óptimos (con una eficiencia

de PCR baja) pueden

producir resultados

imprecisos.

• Antes de utilizar el método de

CT comparativos, Applied

Biosystems recomienda

determinar si las eficiencias

de PCR del ensayo diana y el

ensayo de control endógeno

son aproximadamente

iguales.

Capítulo 1 Introducción

Acerca de los experimentos de cuantificación relativa

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

PCR en singleplex y PCR en multiplex

Se puede realizar una reacción de PCR como una:

• Reacción en singleplex, donde sólo hay un ensayo en el tubo de reacción o pocillo.

Sólo se puede amplificar un gen diana o un control endógeno por reacción.

• Reacción en multiplex, donde hay dos o más ensayos en el tubo de reacción o

pocillo. Cada conjunto amplifica un gen diana o un control endógeno específicos.

¡IMPORTANTE! No se pueden utilizar reactivos SYBR® Green para las reacciones

en multiplex.

RT-PCR de 1 y de 2 pasos

Se puede realizar una retrotranscripción (RT) y una PCR en una sola reacción (1 paso) o

en reacciones distintas (2 pasos). Los reactivos que se utilicen dependerán de si va a

realizar una RT-PCR de 1 o de 2 pasos:

• En las RT-PCR de 1 paso, la RT y la PCR se producen en un sistema de tampón, que

permite disponer de un solo tubo para la amplificación de la RT y la PCR. Sin

embargo, no se puede utilizar una mezcla maestra de PCR rápida ni la enzima de

prevención de contaminación cruzada, AmpErase® UNG (uracil-N-glucosilasa),

para realizar la RT-PCR de 1 paso.

• La RT-PCR de 2 pasos se realiza en dos reacciones distintas: En primer lugar, el

RNA total se retrotranscribe a cDNA y, a continuación, el cDNA se amplifica por

medio de la PCR. Este método es útil para generar un pool de cDNAs o para

almacenar alícuotas de cDNA y utilizarlas posteriormente. La enzima AmpErase®

UNG se puede utilizar para evitar la contaminación cruzada.

Nota: Para obtener más información acerca de AmpErase® UNG, consulte la Guía de

reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System.

GR2331

Conjunto de cebadores de gen diana

Conjunto de cebadores

de control endógeno

cDNA

PCR en singleplex PCR en multiplex

Capítulo 1 Introducción

Acerca de los experimentos de cuantificación relativa

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Reactivos Reactivos TaqMan® y SYBR® Green

Applied Biosystems ofrece reactivos TaqMan® y SYBR® Green para utilizarlos en el

sistema StepOne. Ambos tipos de reactivos se describen brevemente en la siguiente tabla.

¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso de fluorocromo TAMRA™

como notificador o apantallador en el sistema StepOne™.

Tipo de reactivo Proceso

Reactivos o kits TaqMan®

Descripción

Los reactivos TaqMan utilizan una sonda

fluorogénica para permitir la detección de un

producto de PCR específico cuando se

acumula durante los ciclos de PCR.

Ventajas

• Aumenta la especificidad con una sonda. La

hibridación específica entre la sonda y el

gen diana genera una señal de

fluorescencia.

• Permite el trabajo en multiplex.

• Hay disponibles ensayos optimizados.

• Permite realizar ensayos de 5′ nucleasas

durante la PCR.

• Se puede utilizar para la RT-PCR de 1 o 2

pasos.

Reactivos SYBR® Green

Descripción

Los reactivos SYBR Green utilizan el

fluorocromo SYBR® Green I, que se une a DNA

de doble cadena y permite detectar productos

de PCR cuando se acumulan durante los ciclos

de la reacción.

Ventajas

• Económico (no se necesita una sonda).

• Permite que los análisis de curvas de fusión

midan la Tm de todos los productos de

PCR.

• Se puede utilizar para la RT-PCR de 1 o 2

pasos.

Limitaciones

Se une de manera no específica a todas las

secuencias de DNA de doble cadena. Para

evitar señales positivas falsas, compruebe la

formación de un producto no específico

utilizando un gel de agarosa o las curvas de

fusión.

b. Molde desnaturalizado e hibridación de los componentes del ensayo

Cebador directo

Cebador reverso

MGB

Leyenda

Cebador aleatorio

Fluorocromo

FAM™

Apantallador

Ligando de unión

al surco menor

AmpliTaq Gold®

DNA Polymerase

Sonda

Cebador

Molde

Cebador extendido

5' 3'

a. Componentes del ensayo

Molde de cDNA

Cebador directo

Cebador reverso

Sonda

MGB

Sonda

MGB

5' 3'

PCR y detección de cDNA

cDNA

5' 3'

c. Generación de señal

Cebador reverso

Cebador directo

5' 3'

3' 5'

5' 3'

MGB

CEBADOR

DIRECTO

CEBADOR

REVERSO

Paso 1: Configuración de la reacción

El fluorocromo SYBR Green I emite

una fluorescencia cuando se une

a DNA de doble cadena.

Paso 2: Desnaturalización

Cuando el DNA se desnaturaliza,

se libera el fluorocromo SYBR Green

I y la fluorescencia disminuye

considerablemente.

Paso 3: Polimerización

Durante la extensión, los cebadores

se hibridan y se genera el producto

de PCR.

Paso 4: Polimerización completada

El fluorocromo SYBR Green I se une

al producto bicatenario, lo que

produce un aumento neto de

la fluorescencia que detecta

el instrumento.

Capítulo 1 Introducción

Cómo utilizar esta guía

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Otros reactivos

Se pueden utilizar otros reactivos basados en fluorescencia en el sistema StepOne, pero

se debe tener en cuenta lo siguiente:

• El software StepOne calcula automáticamente los volúmenes de reacción de los

reactivos TaqMan y SYBR Green, pero no lo hace con otros reactivos.

• Se debe diseñar el experimento con el flujo de trabajo Advanced Setup

(Configuración avanzada), en lugar de con el asistente de diseño. (Consulte “Flujo

de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada)” en la página 206.)

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de los experimentos de PCR a tiempo real, las

opciones de PCR y los reactivos, consulte la Guía de reactivos de Applied Biosystems

StepOne™ Real-Time PCR System.

Cómo utilizar esta guía

Esta guía sirve a la vez de tutorial y de guía para realizar sus propios experimentos.

Uso de esta guía

como tutorial

Si emplea los datos de los experimentos de ejemplo que se incluyen con el software

StepOne, esta guía le puede servir de tutorial para realizar un experimento de curva

estándar relativa o CT comparativos en el sistema StepOne. Siga los procedimientos que

se indican en los capítulos correspondientes:

Para obtener más información, consulte “Acerca del experimento de ejemplo” en la

página 10.

Uso de esta guía

con sus propios

experimentos

Después de realizar los ejercicios del tutorial de los capítulos 2 a 9, esta guía le puede

servir para guiarle por el flujo de trabajo del asistente de diseño para realizar sus propios

experimentos de curva estándar relativa o CT comparativos. Cada uno de los

procedimientos de los capítulos 2 - 9 contiene un conjunto de directrices que ofrecen

información acerca de cómo realizar sus propios experimentos.

Capítulo

Procedimiento

Curva estándar

relativa

comparativos

2 6 Diseñe el experimento con el asistente de diseño del

software StepOne.

3 7 Prepare el experimento con los reactivos y los

volúmenes que ha calculado el asistente de diseño en

el capítulo 2 (experimento de curva estándar relativa) o

en el capítulo 6 (experimento de CT comparativos).

4 8 Realice el experimento en el instrumento StepOne

(disposición autónoma o conectada).

5 9 Analice los resultados.

Capítulo 1 Introducción

Acerca del experimento de ejemplo

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Asimismo, puede utilizar cualquiera de los otros flujos de trabajo que se incluyen en el

software StepOne para realizar sus experimentos. En la siguiente tabla, se ofrece un

resumen de todos los flujos de trabajo disponibles en el software StepOne.

Acerca del experimento de ejemplo

Para ilustrar cómo se realizan los experimentos de curva estándar relativa y CT

comparativos, esta guía le conduce a través del proceso de diseño, preparación,

procesamiento y análisis de un experimento de ejemplo. El experimento de ejemplo

representa una configuración típica que puede utilizar para familiarizarse rápidamente

con el sistema StepOne.

Descripción del

experimento de

curva estándar

relativa de

ejemplo

El objetivo del experimento de curva estándar relativa de ejemplo es comparar la

expresión del factor de transcripción c-myc (una oncoproteína que activa la transcripción

de los genes asociados al crecimiento) en los tejidos de hígado y riñón.

En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo:

• Las muestras son cDNA preparados a partir de RNA total aislado de hígado y riñón.

• El gen diana es el gen c-myc humano.

• El control endógeno es la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH)

humano.

• La muestra de referencia es RNA aislado de riñón.

• Se configura una curva estándar para el gen c-myc (diana). El estándar que se utiliza

para la dilución seriada es una muestra de cDNA de una muestra de concentración

conocida preparada a partir de RNA aislado de pulmón.

• Se configura una curva estándar para el GAPDH (control endógeno). El estándar

que se utiliza para la dilución seriada es una muestra de cDNA de una muestra de

concentración conocida preparada a partir de RNA aislado de pulmón.

Flujo de

trabajo Descripción Véase...

Design Wizard

(Asistente de

diseño)

Escriba los parámetros del experimento mientras el

asistente le guía por los procedimientos óptimos. Capítulo 2 o

Capítulo 6

Advanced

Setup

(Configuración

avanzada)

Configure un experimento nuevo basándose en su propio

criterio. Da flexibilidad de diseño a los usuarios

experimentados.

página 206

QuickStart

(Inicio rápido) Realice un experimento nuevo sin introducir información

de la configuración de la placa. página 207

Molde Configure un experimento nuevo utilizando la información

de configuración de un molde anterior. página 208

Exportación/

importación Importe diseños de experimentos desde archivos de texto

ASCII que contienen información de configuración de los

experimentos.

página 209

Capítulo 1 Introducción

Acerca del experimento de ejemplo

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

• El experimento está diseñado para una PCR en singleplex, donde los ensayos de gen

diana (c-myc) y control endógeno (GAPDH) se amplifican en diferentes pocillos.

• Las reacciones están preparadas para una RT-PCR de 2 pasos. Se utiliza High-

Capacity cDNA Reverse Transcription Kit para la retrotranscripción y TaqMan®

Fast Universal PCR Master Mix para la PCR.

• Se seleccionan ensayos de la línea de productos Applied Biosystems TaqMan® Gene

Expression Assays:

– Para el ensayo diana (c-myc), el identificador del ensayo es Hs00153408_m1

(RefSeq NM_002467.3).

– Para el ensayo de control endógeno (GAPDH), el identificador del ensayo es

Hs99999905_m1 (RefSeq NM_002046.2).

Disposición de la placa de reacción

A continuación, se muestra la disposición de la placa de reacción del experimento de

curva estándar relativa de ejemplo.

Descripción del

experimento de

CT comparativos

de ejemplo

El objetivo del experimento de CT comparativos de ejemplo es comparar la expresión de

TP53 (un factor de transcripción que regula otros genes) en tejidos de hígado, riñón y

cerebro.

En el experimento de CT comparativos de ejemplo:

• Las muestras son cDNA preparados a partir de RNA total aislado de hígado, riñón y

cerebro.

• El gen diana es TP53.

• La muestra de referencia es del cerebro.

• El control endógeno es GAPDH humano.

• El experimento está diseñado para una PCR en singleplex, donde los ensayos de gen

diana (c-myc) y control endógeno (GAPDH) se amplifican en diferentes pocillos.

Capítulo 1 Introducción

Flujo de trabajo del experimento de ejemplo

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

• Las reacciones están preparadas para una RT-PCR de 2 pasos. Se utiliza High-

Capacity cDNA Reverse Transcription Kit para la retrotranscripción y TaqMan®

Fast Universal PCR Master Mix para la PCR.

• Se seleccionan ensayos de la línea de productos Applied Biosystems TaqMan® Gene

Expression Assays:

– Para el ensayo diana (TP53), el identificador del ensayo es Hs00153340_m1

(RefSeq NM_000546.2).

– Para el ensayo de control endógeno (GAPDH), se utiliza el kit de control

endógeno GAPD (GAPDH) humano (PN 4333764T).

Disposición de la placa de reacción

A continuación, se muestra la disposición de la placa de reacción del experimento de CT

comparativos de ejemplo.

Acerca de los

datos del

experimento de

ejemplo

Los archivos de datos de los experimentos de ejemplo se instalan con el software

StepOne. Encontrará los archivos de los experimentos de ejemplo en su ordenador:

<unidad>:\Applied Biosystems\StepOne System\experiments\examples

donde <unidad> es la unidad del disco duro del ordenador en la que está instalado el

software StepOne. La unidad de instalación predeterminada del software es la unidad C.

Flujo de trabajo del experimento de ejemplo

La figura de la página 13 muestra el flujo de trabajo de los experimentos de curva

estándar relativa y CT comparativos.

Capítulo 1 Introducción

Flujo de trabajo del experimento de ejemplo

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Diseño del experimento (Capítulo 2)

1. Cree un nuevo experimento.

2. Defina las propiedades del experimento.

3. Defina los métodos y los materiales.

4. Configure los genes diana.

5. Configure los estándares.

6. Configure las muestras.

7. Configure la cuantificación relativa.

8. Configure el protocolo de termociclado.

9. Revise la configuración de la reacción.

10.Solicite materiales para el experimento.

11.Finalice el flujo de trabajo del asistente de diseño.



Preparación de las reacciones (Capítulo 3)

1. Prepare el molde.

2. Prepare las diluciones de las muestras.

3. Prepare la dilución seriada.

4. Prepare la mezcla de reacción para cada ensayo diana.

5. Prepare la placa de reacción.



Realización del experimento (Capítulo 4)

1. Prepare la reacción.

2. Active las opciones de notificación.

3. Inicie la reacción.

4. Monitorice la reacción.

5. Descargue el instrumento y transfiera los datos.

Experimento de curva estándar relativa

Inicio del experimento



Diseño del experimento (Capítulo 6)

1. Cree un nuevo experimento.

2. Defina las propiedades del experimento.

3. Defina los métodos y los materiales.

4. Configure los genes diana.

5. Configure las muestras.

6. Configure la cuantificación relativa.

7. Configure el protocolo de termociclado.

8. Revise la configuración de la reacción.

9. Solicite materiales para el experimento.

10.Finalice el flujo de trabajo del asistente de

diseño.



Fin del experimento 

Fin del experimento

Análisis del experimento (Capítulo 5)

Sección 1. Revisión de los resultados:

1. Analice.

2. Revise la pantalla Standard Curve (Curva estándar).

3. Revise la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación).

4. Revise la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión

génica) o la tabla de pocillos.

5. Presente los datos.

Sección 2. Solución de problemas:

1. Revise las opciones de análisis; ajuste la línea basal y el

umbral.

2. Revise la pantalla QC Summary (Resumen QC).

3. Omita pocillos.

4. Revise la pantalla Multicomponent Plot (Gráfica

multicomponente).

5. Revise la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos).



Experimento de CT comparativos (∆∆CT)

Inicio del experimento

Preparación de las reacciones (Capítulo 7)

1. Prepare el molde.

2. Prepare las diluciones de las muestras.

3. Prepare la mezcla de reacción para cada ensayo

diana.

4. Prepare la placa de reacción.

Realización del experimento (Capítulo 8)

1. Prepare la reacción.

2. Active las opciones de notificación.

3. Inicie la reacción.

4. Monitorice la reacción.

5. Descargue el instrumento y transfiera los datos.

Análisis del experimento (Capítulo 9)

Sección 1. Revisión de los resultados:

1. Analice.

2. Revise la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica

de expresión génica) o la tabla de pocillos.

3. Revise la pantalla Amplification Plot (Gráfica de

amplificación).

4. Presente los datos.

Sección 2. Solución de problemas:

1. Revise las opciones de análisis; ajuste la línea

basal y el umbral.

2. Revise la pantalla QC Summary (Resumen QC).

3. Omita pocillos.

4. Revise la pantalla Multicomponent Plot (Gráfica

multicomponente).

5. Revise la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de

datos brutos).



Capítulo 1 Introducción

Flujo de trabajo del experimento de ejemplo

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Capítulo 2

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Diseño del experimento de curva

estándar relativa

Este capítulo cubre los siguientes temas:

■Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

■Creación de un nuevo experimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

■Definición de las propiedades del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

■Definición de los métodos y materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

■Configuración de los genes diana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

■Configuración de los estándares. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

■Configuración de las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

■Configuración de las opciones de cuantificación relativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

■Configuración del protocolo de termociclado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

■Revisión de la configuración de la reacción. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

■Solicitud de materiales para el experimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

■Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

Nota: Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en

esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR

System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o

seleccionando Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne).

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Resumen del capítulo

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Resumen del capítulo

En este capítulo, se explica cómo utilizar el asistente de diseño en el software StepOne™

para configurar el experimento de curva estándar relativa de ejemplo. El asistente de

diseño le guiará por los procedimientos óptimos recomendados por Applied Biosystems

a medida que vaya introduciendo los parámetros de diseño del experimento de ejemplo.

Flujo de trabajo

del experimento

de ejemplo

A continuación, se muestra el flujo de trabajo para diseñar el experimento de ejemplo que

se incluye en esta guía de introducción.

Nota: Diseñe el experimento de ejemplo con el flujo de trabajo del asistente de diseño

del software StepOne. Cuando diseñe sus propios experimentos, puede seleccionar flujos

de trabajo alternativos (consulte “Uso de esta guía con sus propios experimentos” en la

página 9).

Diseño del experimento (Capítulo 2)

1. Cree un nuevo experimento.

2. Defina las propiedades del experimento.

3. Defina los métodos y los materiales.

4. Configure los genes diana.

5. Configure los estándares.

6. Configure las muestras.

7. Configure la cuantificación relativa.

8. Configure el protocolo de termociclado.

9. Revise la configuración de la reacción.

10. Solicite materiales para el experimento.

11. Finalice el flujo de trabajo del asistente de diseño.

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men

e curva es

tá

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Inicio del experimento



Análisis del experimento (Capítulo 5)



Preparación de las reacciones (Capítulo 3)

Realización del experimento (Capítulo 4)



Fin del experimento

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Creación de un nuevo experimento

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Creación de un nuevo experimento

Cree un experimento nuevo con el asistente de diseño del software StepOne.

Creación de un

experimento

1. Haga doble clic en (acceso directo al software StepOne) o seleccione Start

(Inicio)All Programs (Todos los programas)Applied

BiosystemsStepOneStepOne v2.0.

2. En la pantalla Home (Inicio), haga clic en Design Wizard (Asistente de

diseño) para abrir el asistente de diseño.

3. Consulte “Elementos del software” más adelante para obtener información acerca

de la navegación por el asistente de diseño.

Elementos del

software

A continuación, se ilustran los elementos del software StepOne para el asistente de

diseño.

1. Barra de menús: muestra los menús disponibles en el software:

• File (Archivo)

• Edit (Edición)

• Instrument (Instrumento)

• Analysis (Análisis)

• Tools (Herramientas)

• Help (Ayuda)

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Creación de un nuevo experimento

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

2. Barra de herramientas: muestra las herramientas disponibles en el software:

• New Experiment (Experimento nuevo)

• Open (Abrir)

• Close (Cerrar)

• Send Experiment to Instrument (Enviar experimento al instrumento)

• Download Experiment from Instrument (Descargar experimento del

instrumento)

3. Cabecera del experimento: indica el nombre del experimento, el tipo de experimento

y los reactivos del experimento abierto.

4. Panel de navegación: ofrece enlaces a todas las pantallas del asistente de diseño:

• Experiment Properties (Propiedades del experimento)

• Methods & Materials (Métodos y materiales)

• Targets (Dianas)

• Opciones de cuantificación relativa

• Standards (Estándares)

• Samples (Muestras)

• Run Method (Protocolo de termociclado)

• Reaction Setup (Configuración de la reacción)

• Materials List (Lista de materiales)

Nota: Inicialmente, el asistente de diseño muestra el tipo de experimento

Quantitation - Standard Curve (Cuantificación: curva estándar). Las pantallas

disponibles de este asistente pueden cambiar si se selecciona otro tipo de

experimento. Por ejemplo, la pantalla Relative Quantitation Settings (Opciones de

cuantificación relativa) no aparece hasta que se selecciona el tipo de experimento de

curva estándar o CT comparativos (∆∆CT).

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Creación de un nuevo experimento

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

5. Fichas del experimento: muestra una ficha por cada experimento abierto.

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Definición de las propiedades del experimento

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Definición de las propiedades del experimento

En la pantalla Experiment Properties (Propiedades de experimento), escriba la

información de identificación del experimento y, a continuación, seleccione el tipo de

experimento que desea diseñar.

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo:

• El experimento se identifica como un ejemplo.

• Se utiliza una MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate.

• El tipo de experimento es de cuantificación.

Pantalla

Experiment

Properties

(Propiedades de

experimento)

1. Haga clic en el campo Experiment Name (Nombre de experimento) y, a

continuación, escriba Relative Standard Curve Example (Ejemplo de curva

estándar relativa).

Nota: La cabecera del experimento se actualiza con el nombre del experimento que

acaba de escribir.

2. Haga clic en el campo Barcode (Código de barras) y, a continuación, escriba el

código de barras que aparece en la placa de reacción de PCR, si es que dispone de

uno.

3. Haga clic en el campo User Name (Nombre de usuario) y, a continuación, escriba

Example User (Usuario de ejemplo).

4. Haga clic en el campo Comments (Comentarios) y, a continuación, escriba Relative

Standard Curve Getting Started Guide Example (Ejemplo de la guía de

introducción de las curvas estándar relativas).

5. Seleccione Quantitation (Cuantificación) en el tipo de experimento.

6. Haga clic en Next (Siguiente) >.

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Definición de las propiedades del experimento

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Directrices de

diseño

Cuando diseñe su propio experimento de curva estándar relativa:

• Escriba un nombre para el experimento que sea descriptivo y fácil de recordar. El

nombre del experimento se utiliza como nombre de archivo predeterminado del

experimento. Puede introducir hasta 100 caracteres en el campo Experiment Name

(Nombre de experimento).

Nota: No se pueden utilizar los siguientes caracteres en en campo Experiment

Name (Nombre de experimento): barra inclinada hacia delante (/), barra inclinada

hacia atrás (\), signo mayor que (>), signo menor que (<), asterisco (*), signo de

interrogación (?), comillas ("), línea vertical (|), dos puntos (:) o punto y coma (;).

• Utilice MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plates, MicroAmp™ Fast 8-Tube

Strips o MicroAmp® Fast Reaction Tubes with Caps. Los consumibles tipo rápido se

pueden utilizar tanto con reactivos de modo rápido como de modo estándar.

•(Opcional) Introduzca el código de barras de la placa de reacción de PCR, si es que

lo tiene. Puede introducir hasta 100 caracteres en el campo Barcode (Código de

barras).

•(Opcional) Escriba un nombre de usuario para identificar al propietario del

experimento. Puede introducir hasta 100 caracteres en el campo User Name

(Nombre de usuario).

•(Opcional) Escriba comentarios para describir el experimento. Puede introducir

hasta 1000 caracteres en el campo Comments (Comentarios).

• Seleccione Quantitation (Cuantificación) en el tipo de experimento.

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Definición de los métodos y materiales

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de:

• La pantalla Experiment Properties (Propiedades de experimento), acceda a la ayuda

del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.

• Consumibles, consulte “Consumibles admitidos” en la página 3.

• Experimentos de cuantificación, consulte la Guía de reactivos de Applied

Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System.

Definición de los métodos y materiales

En la pantalla Methods & Materials (Métodos y materiales), seleccione el método de

cuantificación, los reactivos, la velocidad de rampa y el tipo de molde que se van a

utilizar en el experimento.

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo:

• Se utiliza el método de cuantificación de curva estándar relativa.

• Se utilizan reactivos TaqMan®.

• Se utiliza la velocidad de rampa rápida en el protocolo de termociclado.

• cDNA (preparado a partir de RNA total aislado de hígado y riñón) es el tipo de

molde. Para obtener el molde de cDNA, primero hay que realizar una

retrotranscripción de RNA para convertir el RNA en cDNA (consulte “Preparación

del molde” en la página 51).

Pantalla Methods

& Materials

(Métodos y

materiales)

1. Seleccione Relative Standard Curve (Curva estándar relativa) como método de

cuantificación.

2. Seleccione ensayos TaqMan® para los reactivos.

3. Seleccione Fast (~40 minutes to complete a run) (Rápido (40 minutos

aproximadamente para completar una reacción)) para la velocidad de la rampa.

4. Seleccione cDNA (complementary DNA) (cDNA (DNA complementario)) para el

tipo de molde.

5. Haga clic en Next (Siguiente) >.

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Definición de los métodos y materiales

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Directrices de

diseño

Cuando diseñe su propio experimento de curva estándar relativa:

• Seleccione Relative Standard Curve (Curva estándar relativa) como método de

cuantificación. Los experimentos de curva estándar relativa determinan el cambio

de expresión de un gen diana en una muestra en relación con el mismo gen diana de

una muestra de referencia. Para conseguir los resultados, se utiliza una curva

estándar construida a partir de una dilución seriada de cantidad conocida. Para

configurar la placa de reacción, el método de curva estándar relativa requiere dianas,

estándares, muestras, una muestra de referencia y un control endógeno.

• Seleccione los reactivos que desea utilizar:

– Seleccione Reagents TaqMan® (ensayos TaqMan®) si desea utilizar estos

reactivos para detectar la amplificación y cuantificar la cantidad de gen diana en

las muestras. Los reactivos TaqMan se componen de dos cebadores y una sonda

TaqMan®. Los cebadores están diseñados para amplificar el gen diana. La sonda

TaqMan está diseñada para hibridar en el gen diana y generar una señal de

fluorescencia cuando se amplifica el gen diana.

¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo

TAMRA™ como notificador o apantallador en el sistema StepOne™.

– Seleccione SYBR® Green Reagents (reactivos SYBR® Green) si desea utilizar

estos reactivos para detectar la amplificación y cuantificar la cantidad de gen

diana en las muestras. Los reactivos SYBR Green se componen de dos cebadores

y un fluorocromo SYBR Green. Los cebadores están diseñados para amplificar el

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Definición de los métodos y materiales

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

gen diana. El fluorocromo SYBR Green genera señal de fluorescencia cuando se

une a DNA de doble cadena. El fluorocromo SYBR Green suele formar parte de

la mezcla maestra SYBR Green que se añade a la reacción. Si utiliza el

fluorocromo SYBR Green:

Active la casilla de verificación Include Melt Curve (Incluir curva de

disociación) para realizar un análisis de curva de disociación del gen diana

amplificado.

Seleccione Standard (Estándar) para la velocidad de la rampa. Applied

Biosystems no dispone de una mezcla maestra que funcione en modo rápido para

reactivos SYBR Green.

Nota: Se pueden utilizar otros reactivos basados en fluorescencia en el sistema

StepOne; sin embargo, debe diseñar su experimento con el flujo de trabajo

Advanced Setup (Configuración avanzada) en lugar de con el asistente de diseño.

Consulte “Flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada)” en la

página 206.

• Seleccione la velocidad de rampa apropiada para el protocolo de termociclado:

– Seleccione Fast (~40 Minutes to Complete a Run) (Rápido (aproximadamente

40 minutos para completar una reacción)) si utiliza reactivos tipo rápido para las

reacciones de PCR.

– Seleccione Standard (~2 Hours to Complete a Run) (Estándar

(aproximadamente 2 horas para completar una reacción)) si utiliza reactivos

estándar para las reacciones de PCR (incluidos reactivos SYBR Green y reactivos

TaqMan estándar).

• Seleccione el molde para la PCR apropiado:

– Seleccione cDNA (complementary DNA) (cDNA (DNA complementario)) si va

a realizar una RT-PCR de 2 pasos y ya ha realizado la retrotranscripción para

convertir el RNA en cDNA. Se añade DNA complementario a las reacciones de

PCR.

– Seleccione RNA si va a realizar una RT-PCR de 1 paso. Se añade el RNA o

mRNA total a las reacciones de PCR.

– Seleccione gDNA (genomic DNA) (gDNA (DNA genómico)) si ya ha extraído el

gDNA de un tejido o una muestra. Se añade DNA genómico purificado a las

reacciones de PCR.

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de:

• La pantalla Methods & Materials (Métodos y materiales), acceda a la ayuda del

software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.

• El uso del método de cuantificación de CT comparativos, consulte los capítulos 6 -9

de esta guía.

• El uso del método de cuantificación de curva estándar, consulte la Guía de

introducción a StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de curva

estándar.

• Los reactivos TaqMan y SYBR Green, consulte la Guía de reactivos de Applied

Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System.

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Configuración de los genes diana

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

• La PCR, incluida la PCR en singleplex y en multiplex, y la RT - PCR de 1 y de 2

pasos, consulte la Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time

PCR System.

Configuración de los genes diana

En la pantalla Targets (Dianas), escriba el número de genes diana que desea cuantificar

en la placa de reacción de PCR y, a continuación, configure el ensayo para cada gen

diana.

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo:

• Se cuantifican dos dianas en la placa de reacción.

• Se activa la casilla de verificación Set Up Standards (Configurar estándares).

Cuando se activa esta casilla de verificación, el software muestra automáticamente

la pantalla Standards (Estándares) después de completar la pantalla Targets

(Dianas). En la pantalla Standards (Estándares), se puede configurar una curva

estándar para cada ensayo diana (consulte “Configuración de los estándares” en la

página 28).

• El ensayo Target 1 (Diana 1) está configurado para el gen diana que se está

estudiando. En el experimento de ejemplo, se trata del gen c-myc humano (una

oncoproteína que activa la transcripción de los genes asociados al crecimiento).

• El ensayo Target 2 (Diana 2) se configura para el control endógeno. Para el

experimento de ejemplo, se trata de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa

(GAPDH) humano. El GAPDH se utiliza como control endógeno, porque sus

niveles de expresión suelen ser relativamente estables.

Pantalla Targets

(Dianas)

1. Haga clic en el campo How many targets do you want to quantify in the reaction

plate? (¿Cuántas dianas desea cuantificar en la placa de reacción?) y, a

continuación, escriba 2.

Nota: El número de filas de la tabla de ensayos diana se actualiza con el número

que escriba.

2. Active la casilla de verificación Set Up Standards (Configurar estándares) para

configurar estándares para ambos ensayos diana.

Nota: La casilla de verificación Set Up Standards (Configurar estándares) está

activada de manera predeterminada.

3. Configure el ensayo Target 1 (Diana 1):

a. Haga clic en la celda Enter Target Name (Escriba nombre de gen diana) y, a

continuación, escriba c-myc.

b. En el menú desplegable Reporter (Notificador), seleccione FAM

(predeterminado).

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Configuración de los genes diana

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

c. En el menú desplegable Quencher (Apantallador), seleccione NFQ-MGB

(predeterminado).

d. Deje la opción predeterminada en el campo Color.

4. Configure el ensayo Target 2 (Diana 2):

a. Haga clic en la celda Enter Target Name (Escriba nombre de gen diana) y, a

continuación, escriba GAPDH.

b. En el menú desplegable Reporter (Notificador), seleccione FAM

(predeterminado).

c. En el menú desplegable Quencher (Apantallador), seleccione NFQ-MGB

(predeterminado).

d. Deje la opción predeterminada en el campo Color.

5. Haga clic en Next (Siguiente) >.

Nota: En todos los genes diana, deje en blanco el campo (Optional) Enter Gene Name

((Opcional) Escriba el nombre del gen). Puede buscar el identificador del gen/ensayo

para solicitar los materiales (consulte “Solicitud de materiales para el experimento” en la

página 43).

Directrices de

diseño

Cuando diseñe su propio experimento de CT comparativos:

• Active la casilla de verificación Set Up Standards (Configurar estándares).

Applied Biosystems recomienda configurar una curva estándar para cada ensayo

diana en la placa de reacción.

• Identifique cada ensayo diana con un nombre y un color únicos. Puede introducir

hasta 100 caracteres en el campo Target Name (Nombre de gen diana).

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Configuración de los genes diana

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

• Seleccione un control endógeno para cada muestra. El control endógeno es un gen

diana que está presente en todas las muestras que se están investigando. Se debería

expresar por igual en todos los tipos de muestras, con independencia del tratamiento

o el origen del tejido (ejemplos de controles endógenos: β-actina, GAPDH y RNA

ribosomal 18S [rRNA 18S]). El control endógeno se utiliza para normalizar los

resultados de la PCR, ya que corrige las variaciones en la cantidad de molde, la

eficiencia de extracción del ácido nucleico, la eficiencia de la retrotranscripción y

los errores de calibración de las pipetas. Tenga en cuenta que:

– Cada tipo de muestra (por ejemplo, cada tejido de un estudio en el que se

comparan múltiples tejidos) requiere un control endógeno.

– Si las muestras están distribuidas en múltiples placas, cada placa debe tener un

control endógeno. Asimismo, cada placa debe incluir un control endógeno para

cada tipo de muestra de la placa.

• Seleccione el fluorocromo del notificador utilizado en el ensayo diana:

– Seleccione FAM si el fluorocromo FAM™ está unido al extremo de 5′ de la sonda

TaqMan que se utiliza para detectar el gen diana.

– Seleccione JOE si el fluorocromo JOE™ está unido al extremo de 5′ de la sonda

TaqMan que se utiliza para detectar el gen diana.

– Seleccione VIC si el fluorocromo VIC® está unido al extremo de 5′ de la sonda

TaqMan que se utiliza para detectar el gen diana.

– Seleccione SYBR si utiliza fluorocromo SYBR® Green para detectar DNA de

doble cadena.

• Seleccione el apantallador utilizado en el ensayo diana:

– Seleccione NFQ-MGB si en el extremo 3′ de a sonda TaqMan que está utilizando

para detectar el gen diana hay unido un apantallador no fluorescente de unión al

surco menor de la doble cadena de DNA.

– Seleccione None (Ninguno) si se utiliza el fluorocromo SYBR Green.

¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso de fluorocromo

TAMRA™ como notificador o apantallador en el sistema StepOne™.

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de:

• La pantalla Targets (Dianas), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic

en o pulsando F1.

• La selección de un control endógeno, consulte la nota de aplicación Using TaqMan®

Endogenous Control Assays to Select an Endogenous Control for Experimental

Studies.

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Configuración de los estándares

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Configuración de los estándares

En la pantalla Standards (Estándares), escriba el número de puntos y réplicas de todas las

curvas estándar de la placa de reacción. Para cada curva estándar, escriba la cantidad

inicial y seleccione el factor de dilución.

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo:

• Se configura una curva estándar para el gen diana (c-myc). El estándar que se utiliza

para la dilución seriada es una muestra de cDNA de una muestra de concentración

conocida preparada a partir de RNA aislado de pulmón.

• Se configura una curva estándar para el control endógeno (GAPDH). El estándar

que se utiliza para la dilución seriada es una muestra de cDNA de una muestra de

concentración conocida preparada a partir de RNA aislado de pulmón.

• Para cada curva estándar:

– Se utilizan cinco puntos en la curva estándar.

– Se utilizan tres réplicas para cada punto. Las réplicas son reacciones idénticas

que contienen componentes y volúmenes idénticos.

– La cantidad inicial es 200 ng y el factor de dilución es 1:10.

Pantalla

Standards

(Estándares)

1. Haga clic en el campo How many points do you need for each standard curve?

(¿Cuántos puntos necesita por cada curva estándar?) y, a continuación, escriba 5.

2. Haga clic en el campo How many replicates do you need for each point?

(¿Cuántas réplicas necesita para cada punto?) y, a continuación, escriba 3.

3. Defina el rango de cantidades estándar para el ensayo de c-myc:

a. Haga clic en el campo Enter Starting Quantity (Escriba cantidad inicial) y, a

continuación, escriba 200.

b. En el menú desplegable Select Serial Factor (Seleccionar factor de dilución),

seleccione 1:10.

4. Defina el rango de cantidades estándar para el ensayo de GAPDH:

a. Haga clic en el campo Enter Starting Quantity (Escriba cantidad inicial) y, a

continuación, escriba 200.

b. En el menú desplegable Select Serial Factor (Seleccionar factor de dilución),

seleccione 1:10.

5. Revise el panel Standard Curve Preview (Vista previa de la curva estándar) para

cada ensayo. La curva estándar tiene los siguientes puntos: 200, 20, 2, 0,2 y 0,02.

6. Haga clic en Next (Siguiente) >.

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Configuración de los estándares

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Directrices de

diseño

Cuando diseñe su propio experimento de curva estándar relativa:

• Configure una curva estándar para cada gen diana de la placa de reacción. Los genes

diana se definen previamente en la pantalla Targets (Dianas) (“Configuración de los

genes diana” en la página 25).

• Escriba el número de puntos para cada curva estándar de la placa de reacción.

Applied Biosystems recomienda al menos cinco puntos de dilución por cada curva

estándar.

• Escriba el número de reacciones idénticas (réplicas) para cada punto de la curva

estándar. Applied Biosystems recomienda tres réplicas para cada punto.

• Dado que el rango de cantidades estándar afecta al cálculo de la eficiencia de la

amplificación, estudie cuidadosamente el rango de cantidades estándar apropiado

para su ensayo:

– Para obtener medidas más precisas de la eficiencia de la amplificación, utilice un

amplio rango de cantidades estándar, de entre 5 y 6 órdenes de magnitud. Si

especifica un amplio rango de cantidades para los estándares, debe utilizar un

producto de PCR o un molde muy concentrado como, por ejemplo, un cDNA

clonado.

– Si tiene una cantidad limitada de molde de cDNA y/o si el gen diana es un

tránscrito de bajo número de copias, o se sabe que está en un rango determinado,

puede que sea necesario un rango menor de cantidades estándar.

• El factor de dilución sirve para calcular las cantidades de todos los puntos de la

curva estándar. Si la cantidad inicial es la cantidad más alta, seleccione un factor de

dilución como, por ejemplo, 1:2, 1:3, etc. Si la cantidad inicial es la cantidad menor,

seleccione un factor de concentración como, por ejemplo, 2✕, 3✕, etc.

Si es necesario, utilice la barra de desplazamiento

para ver el GAPDH y, a continuación, realice los

pasos 4a y 4b.

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Configuración de las muestras

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de:

• La pantalla Standards (Estándares), acceda a la ayuda del software StepOne

haciendo clic en o pulsando F1.

• La eficiencia de la amplificación, consulte Amplification Efficiency of TaqMan®

Gene Expression Assays Application Note.

Configuración de las muestras

En la pantalla Samples (Muestras), escriba el número de muestras, réplicas y controles

negativos que va a incluir en la placa de reacción, escriba los nombres de las muestras y,

a continuación, seleccione las reacciones de muestra/diana que va a configurar.

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo:

• Se utilizan dos muestras: cDNA preparado a partir de RNA total aislado de hígado y

riñón. Las muestras contienen cantidades desconocidas del gen c-myc (diana) y del

gen GAPDH (control endógeno).

• Se utilizan tres réplicas. Las réplicas son reacciones idénticas que contienen

componentes y volúmenes idénticos.

• Se utilizan tres controles negativos. Las reacciones de control negativo contienen

agua en lugar de la muestra y no se deberían amplificar.

Pantalla Samples

(Muestras)

1. Haga clic en el campo How many samples do you want to test in the reaction

plate? (Cuántas muestras desea probar en la placa de reacción?) y, a continuación,

escriba 2.

Nota: El número de filas de la tabla de las muestras se actualiza con el número que

escriba.

2. Haga clic en el campo How many replicates do you need? (¿Cuántas réplicas

necesita?) y, a continuación, escriba 3.

3. Haga clic en el campo How many negative controls do you need for each target

assay? (¿Cuántos controles negativos necesita para cada ensayo diana?) y, a

continuación, escriba 3.

4. Configure la muestra 1:

a. Haga clic en el campo Enter Sample Name (Escriba nombre de muestra) y, a

continuación, escriba Liver (Hígado).

b. Deje la opción predeterminada en el campo Color.

5. Configure la muestra 2:

a. Haga clic en el campo Enter Sample Name (Escriba nombre de muestra) y, a

continuación, escriba Kidney (Riñón).

b. Deje la opción predeterminada en el campo Color.

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Configuración de las muestras

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

6. Seleccione All Sample/Target Reactions (Todas las reacciones de muestra/diana)

para configurar todos los genes diana de todas las muestras.

7. En el panel Well Count (Número de pocillos), confirme que hay:

• 12 pocillos desconocidos

• 30 pocillos estándar

• 6 pocillos de control negativo

• 0 pocillos vacíos

8. En la ficha View Plate Layout (Ver disposición de placa):

a. En el menú desplegable Arrange Plate by (Ordenar placa por), seleccione Rows

(Filas) (predeterminado).

b. En el menú desplegable Place Negative Controls (Colocar controles negativos),

seleccione Upper Left (Superior izquierda) (predeterminado).

9. Haga clic en Next (Siguiente) >.

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Configuración de las opciones de cuantificación relativa

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Directrices de

diseño

Cuando diseñe su propio experimento de curva estándar relativa:

• Identifique cada muestra con un nombre y un color únicos. Puede introducir hasta

100 caracteres en el campo Sample Name (Nombre de muestra).

• Escriba el número de reacciones idénticas (réplicas) que desea configurar. Applied

Biosystems recomienda tres réplicas para cada reacción de muestra.

• Escriba el número de reacciones de control negativo que desea configurar. Applied

Biosystems recomienda tres reacciones de control negativo por cada ensayo diana.

• Seleccione la combinación de reacciones de muestra/diana deseada:

– Seleccione All Sample/Target Reactions (Todas las reacciones de

muestra/diana) para configurar todos los genes diana de todas las muestras.

– Seleccione Specify Sample/Target Reactions (Especifique reacciones de

muestra/diana) para configurar de uno en uno los genes diana que se van a

amplificar en cada muestra.

Nota: En el asistente de diseño, cada reacción de PCR sólo puede contener una

muestra y un ensayo diana.

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de la pantalla Samples (Muestras) , acceda a la

ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.

Configuración de las opciones de cuantificación relativa

En la pantalla Relative Quantitation Settings (Opciones de cuantificación relativa),

seleccione la muestra de referencia y el control endógeno para realizar la cuantificación

relativa.

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo:

• El tejido del riñón se utiliza como muestra de referencia.

• GAPDH se utiliza como control endógeno.

Pantalla Relative

Quantitation

Settings

(Opciones de

cuantificación

relativa)

1. En el menú desplegable Which sample do you want to use as the reference sample?

(¿Qué muestra desea utilizar como muestra de referencia?), seleccione Kidney

(Riñón).

2. En el menú desplegable Which target do you want to use as the endogenous control?

(¿Qué diana desea utilizar como control endógeno?), seleccione GAPDH.

3. Haga clic en Next (Siguiente) >.

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Configuración del protocolo de termociclado

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Directrices de

diseño

Cuando diseñe su propio experimento de curva estándar relativa:

• Seleccione una muestra de referencia entre las muestras creadas anteriormente

(“Configuración de las muestras” en la página 30). Los resultados de la

amplificación de las muestras se comparan con los resultados de la amplificación de

la muestra de referencia para determinar la expresión relativa.

• Seleccione un control endógeno en los ensayos diana creados previamente

(“Configuración de los genes diana” en la página 25). Los resultados de la

amplificación del control endógeno se utilizan para normalizar los resultados de la

amplificación de el gen diana para corregir las diferencias en la cantidad de molde

añadida a cada reacción.

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de:

• La pantalla Relative Quantitation Settings (Opciones de cuantificación relativa),

acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.

• Muestras de referencia (también denominadas calibradores) y controles endógenos,

consulte User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression.

Configuración del protocolo de termociclado

En la pantalla Run Method (Protocolo de termociclado), revise el volumen de la reacción

y el perfil térmico del protocolo de termociclado predeterminado. Si es necesario, puede

editar el protocolo de termociclado predeterminado o sustituirlo por otro de la biblioteca

Run Method (Protocolo de termociclado).

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, se utiliza el protocolo de

termociclado predeterminado sin modificaciones.

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Configuración del protocolo de termociclado

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Revisión de la

pantalla Run

Method

(Protocolo de

termociclado)

1. Haga clic en la ficha Graphical View (Vista gráfica) (predeterminada) o Tabular

View (Vista tabular).

2. Asegúrese de que en el campo Reaction Volume Per Well (Volumen de reacción por

pocillo) aparece 20 µL.

3. Asegúrese de que en el perfil térmico aparecen las etapas y los ciclos que se indican

a continuación.

4. Haga clic en Next (Siguiente) >.

Directrices de

diseño

Cuando diseñe su propio experimento de curva estándar relativa:

• Escriba un número entre 10 y 30 para el volumen de reacción/pocillo. El sistema

StepOne admite volúmenes de reacción de entre 10 y 30 µL.

• Revise el perfil térmico:

– Asegúrese de que el perfil térmico es apropiado para los reactivos.

– Si va a realizar una RT-PCR de 1 paso, incluya un paso de retrotranscripción.

Si el experimento necesita un perfil térmico diferente, modifique el perfil térmico o

cambie el protocolo de termociclado por otro de la biblioteca Run Method

(Protocolo de termociclado). La biblioteca Run Method (Protocolo de termociclado)

está incluida en el software StepOne.

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de la biblioteca Run Method (Protocolo de

termociclado) o acerca de la pantalla Run Method (Protocolo de termociclado), acceda a

la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Revisión de la configuración de la reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Revisión de la configuración de la reacción

En la pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción), seleccione el tipo de ensayo

(si utiliza reactivos TaqMan) y, a continuación, revise los volúmenes calculados para

preparar las reacciones de PCR, las series de dilución estándar y las diluciones de las

muestras. Si es necesario, puede editar el volumen de reacción, el volumen de reacción

de exceso, las concentraciones de los reactivos, la concentración del estándar y/o la

concentración de la muestra diluida.

¡IMPORTANTE! Realice estos pasos para cada ensayo diana de la placa de reacción.

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo:

• Se utilizan Applied Biosystems TaqMan® Gene Expression Assays.

• El volumen de reacción por pocillo es 20 µL.

• El volumen de reacción de exceso es del 10%.

• Los componentes de la reacción son:

–TaqMan

® Fast Universal PCR Master Mix (2✕)

– Ensayo de c-myc (20✕)

– Ensayo de GAPDH (20✕)

– Muestra o estándar

– Agua

• La concentración del estándar en la solución de partida es de 200 ng/µL.

• La concentración de la muestra diluida es de 5,0 ng/µL.

• La concentración de la solución de partida de la muestra es de 100 ng/µL.

Pantalla Reaction

Setup

(Configuración de

reacción)

Complete la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción) para

el ensayo de c-myc

1. Seleccione la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción)

(predeterminada).

2. En el panel Select Target (Seleccionar diana), seleccione c-myc.

3. En el menú desplegable Assay Type (Tipo de ensayo), seleccione Inventoried/Made

to Order (En inventario/Fabricado bajo pedido).

4. Asegúrese de que en el campo Reaction Volume Per Well (Volumen de reacción por

pocillo) aparece 20 µL.

5. Asegúrese de que en el campo Excess Reaction Volume (Volumen de reacción en

exceso) muestra 10%.

6. En el panel Reactions for c-myc (Reacciones para c-myc):

a. Asegúrese de que en el campo Master Mix Concentration (Concentración de

mezcla maestra) aparece 2✕.

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Revisión de la configuración de la reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

b. Asegúrese de que en el campo Assay Mix Concentration (Concentración de

ensayo) aparece 20✕.

c. Revise los componentes y los volúmenes calculados para las reacciones de

PCR:

7. En el panel Standard Dilution Series for c-myc (Dilución seriada estándar para

c-myc):

a. Haga clic en el campo Standard Concentration in Stock (Concentración del

estándar en la solución de partida) y, a continuación, escriba 200.

b. En el campo de las unidades, seleccione ng per µL (ng por L) (predeterminado)

en el menú desplegable.

c. Revise los volúmenes calculados para preparar la dilución seriada:

Componente Volumen (µL) para 1 reacción

Mezcla maestra (2✕)10,0

Ensayo (20✕)1,0

Muestra (10✕) o estándar 2,0‡

‡ El volumen de la muestra o estándar se limita al 10% del volumen

total de la reacción.

H2O7,0

Volumen total 20,0

3 54

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Revisión de la configuración de la reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Complete la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción) para

el ensayo de GAPDH

1. Seleccione la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción)

(predeterminada).

2. En el panel Select Target (Seleccionar diana), seleccione GAPDH.

3. En el menú desplegable Assay Type (Tipo de ensayo), seleccione Inventoried/Made

to Order (En inventario/Fabricado bajo pedido).

4. Asegúrese de que en el campo Reaction Volume Per Well (Volumen de reacción por

pocillo) aparece 20 µL.

5. Asegúrese de que en el campo Excess Reaction Volume (Volumen de reacción en

exceso) muestra 10%.

Dilución Solución

origen

Volumen

solución

origen

(µL)

Volumen

disolvente

(µL)

Volumen

total

(µL)

Concentración

del estándar

(ng/µL)

1 [200] Solución

origen 5,0 5,0 10,0 100,0

2 [20] Dilución 1 1,0 9,0 10,0 10,0

3 [2] Dilución 2 1,0 9,0 10,0 1,0

4 [0,2] Dilución 3 1,0 9,0 10,0 0,1

5 [0,02] Dilución 4 1,0 9,0 10,0 0,01

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Revisión de la configuración de la reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

6. En el panel Reactions for GAPDH (Reacciones para GAPDH):

a. Asegúrese de que en el campo Master Mix Concentration (Concentración de

mezcla maestra) aparece 2✕.

b. Asegúrese de que en el campo Assay Mix Concentration (Concentración de

ensayo) aparece 20✕.

c. Revise los componentes y los volúmenes calculados para las reacciones de

PCR:

7. En el panel Standard Dilution Series for GAPDH (Dilución seriada estándar para

GAPDH):

a. Haga clic en el campo Standard Concentration in Stock (Concentración del

estándar en solución de partida) y, a continuación, escriba 200.

b. En el campo de las unidades, seleccione ng per µL (ng por L) (predeterminado)

en el menú desplegable.

Componente Volumen (µL) para 1 reacción

Mezcla maestra (2✕)10,0

Ensayo (20✕)1,0

Muestra (10✕) o estándar 2,0‡

‡ El volumen de la muestra o estándar se limita al 10% del volumen

total de la reacción.

H2O7,0

Volumen total 20,0

3 54

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Revisión de la configuración de la reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

c. Revise los volúmenes calculados para preparar la dilución seriada:

Complete la ficha Sample Dilution Calculations (Cálculos de la dilución de muestra)

1. Seleccione la ficha Sample Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de muestra).

2. Haga clic en el campo Diluted Sample Concentration (10✕ for Reaction Mix)

(Concentración de muestra diluida (10X por mezcla de reacción)) y, a continuación,

escriba 5,0.

3. En el menú desplegable de la unidad, seleccione ng/µL (predeterminado).

Dilución Solución

origen

Volumen

solución

origen

(µL)

Volumen

disolvente

(µL)

Volumen

total

(µL)

Concentración

del estándar

(ng/µL)

1 [200] Solución

origen 5,0 5,0 10,0 100,0

2 [20] Dilución 1 1,0 9,0 10,0 10,0

3 [2] Dilución 2 1,0 9,0 10,0 1,0

4 [0,2] Dilución 3 1,0 9,0 10,0 0,1

5 [0,02] Dilución 4 1,0 9,0 10,0 0,01

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Revisión de la configuración de la reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

4. Revise los volúmenes calculados para las diluciones de las muestras:

Imprima las instrucciones de la configuración de la reacción

Imprima las instrucciones detalladas de la configuración de la reacción y, a continuación,

guárdelas para el Capítulo 3, “Preparación de las reacciones de la curva

estándar relativa.”

1. Haga clic en Print Reaction Setup (Imprimir configuración de reacción).

2. En el cuadro de diálogo, seleccione:

• Detailed Reaction Setup Instructions (Instrucciones detalladas de la

configuración de la reacción)

• Include Plate Layout (Incluir disposición de la placa)

• Use sample color (Utilizar color de muestra)

Nombre de la

muestra

Concentración

de la solución

origen (ng/µL)

Volumen de

muestra

(µL)

Volumen de

disolvente

(µL)

Volumen total

de muestra

diluida (µL)

Hígado 100,0 1,0 19,0 20,0

Riñón 100,0 1,0 19,0 20,0

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Revisión de la configuración de la reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

3. Haga clic en Print (Imprimir).

4. En el cuadro de diálogo Print (Imprimir), seleccione la impresora y las opciones de

impresión y, a continuación, haga clic en OK (Aceptar).

5. Haga clic en Next (Siguiente) >.

Directrices de

diseño

Cuando diseñe su propio experimento de curva estándar relativa:

• Si utiliza reactivos TaqMan, seleccione el tipo de ensayo que va a utilizar:

– Seleccione Inventoried/Made to Order (En inventario/Fabricado bajo pedido) si

utiliza Applied Biosystems TaqMan® Gene Expression Assays (en inventario o

fabricados bajo pedido) o Applied Biosystems Custom TaqMan® Gene

Expression Assays.

– Seleccione Custom (Personalizado) si va a diseñar sus propios ensayos con el

software Primer Express®.

• Escriba un número entre 10 y 30 para el volumen de reacción/pocillo. El sistema

StepOne admite volúmenes de reacción de entre 10 y 30 µL.

• Incluya el volumen de reacción en exceso para contabilizar la pérdida que se

produce durante el pipeteo. Applied Biosystems recomienda un volumen de

reacción en exceso de al menos el 10%.

• Revise las concentraciones de la mezcla de reacción para cada gen diana. Si es

necesario:

– Para los reactivos TaqMan, modifique las concentraciones de la mezcla maestra y

del ensayo.

– Para los reactivos SYBR Green, modifique las concentraciones de la mezcla

maestra, el cebador directo y el cebador reverso.

– Para la RT-PCR de 1 paso, modifique la concentración de retrotranscripción.

• Revise los componentes de la mezcla de reacción para cada gen diana:

– Si va a trabajar de modo rápido, asegúrese de utilizar una mezcla maestra rápida

en las reacciones de PCR.

– Si va a realizar reacciones de PCR en modo estándar, asegúrese de utilizar una

mezcla maestra tipo estándar en las reacciones de PCR.

– En la RT-PCR de 1 paso, asegúrese de incluir retrotranscriptasa en las reacciones

de PCR y de utilizar un tampón específico.

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Revisión de la configuración de la reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

• Revise los cálculos de diluciones seriadas para cada gen diana. Si es necesario,

modifique la concentración del estándar en la solución de partida (incluidas las

unidades).

Nota: En el campo de las unidades de Standard Concentration in Stock

(Concentración del estándar de la solución de partida), puede seleccionar ng o µg en

el menú desplegable o introducir otra unidad en el campo (por ejemplo, copies

(copias), IU [unidades internacionales], nmol, pg, etc). La tabla se actualiza de la

manera correspondiente.

• Revise los cálculos de la dilución de las muestras para cada muestra. Si es necesario,

modifique la concentración de muestra diluida (incluidas las unidades) y la

concentración de la solución de partida.

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de:

• La pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción), acceda a la ayuda del

software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.

• Los ensayos de Applied Biosystems se refieren a:

–TaqMan® Gene Expression Assays Protocol

–Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Solicitud de materiales para el experimento

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Solicitud de materiales para el experimento

En la pantalla Materials List (Lista de materiales), revise la lista de materiales que se

recomiendan para preparar para la placa de reacción de PCR.

Opcionalmente, puede solicitar los materiales recomendados a la tienda en línea de

Applied Biosystems. Cree una cesta de la compra, añada productos a la cesta de compra

y, a continuación, inicie la sesión para enviar su pedido. Para acceder a la tienda en línea

de Applied Biosystems, debe tener una conexión a Internet ilimitada.

Nota: El software StepOne recomienda los materiales que debe solicitar de acuerdo con

el diseño del experimento. Se da por hecho que se va a diseñar el experimento, solicitar

los materiales y luego preparar (Capítulo 3) y procesar (Capítulo 4) la placa de reacción

cuando reciba los materiales.

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, los materiales recomendados

son:

•MicroAmp

™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate

•MicroAmp

™ Optical 48-Well Adhesive Film

•TaqMan

® Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase® UNG

• Ensayo de c-myc: Hs00153408_m1 (RefSeq NM_002467.3)

• Ensayo de GAPDH: Hs99999905_m1 (RefSeq NM_002046.2)

Pantalla Ordering

Materials

(Solicitud de

materiales)

1. Busque el ensayo diana en la tienda en línea de Applied Biosystems:

a. Asegúrese de que el ordenador está conectado a Internet.

b. Haga clic en el campo Enter Gene Name (Escriba el nombre del gen), escriba

c-myc y, a continuación, haga clic en Find Assay (Buscar ensayo).

c. En el cuadro de diálogo Find Assay Results (Buscar resultados de ensayo),

seleccione la fila Hs00153408_m1.

d. Haga clic en el campo Enter Gene Name (Escriba el nombre del gen), escriba

GAPDH y, a continuación, haga clic en Find Assay (Buscar ensayo).

e. En el cuadro de diálogo Find Assay Results (Buscar resultados de ensayo),

seleccione la fila Hs99999905_m1.

f. Haga clic en Apply Assay Selection (Aplicar selección de ensayo).

2. Complete el panel Experiment Materials List (Lista de materiales del experimento):

a. En el menú desplegable Display (Visualización), seleccione All Items (Todos

los elementos) (predeterminada) y, a continuación, revise los materiales

recomendados. Si es necesario, utilice la barra de desplazamiento situada a la

derecha para ver todos los elementos.

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Solicitud de materiales para el experimento

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

b. Active la casilla de verificación junto a cada uno de los siguientes elementos:

•MicroAmp

™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate

•MicroAmp

™ Optical 48-Well Adhesive Film

•TaqMan

® Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase® UNG

• Ensayo de c-myc: Hs00153408_m1 (RefSeq NM_002467.3)

• Ensayo de GAPDH: Hs99999905_m1 (RefSeq NM_002046.2)

Nota: Para obtener más información acerca de un elemento específico, haga

clic en el vínculo del número de referencia para conectarse a la tienda en línea

de Applied Biosystems. En la página de inicio, escriba el número de referencia

en el campo Search (Búsqueda) y, a continuación, haga clic en Go (Ir).

c. Haga clic en Add Selected Items to Shopping List (Añadir elementos

seleccionados a la cesta de compra).

3. Compruebe si la cesta de compra del experimento contiene los materiales deseados

y que las cantidades son correctas y, a continuación, haga clic en Order Materials

in List (Solicitar materiales de la lista).

4. En el cuadro de diálogo, Order Materials - Log In (Solicitar materiales – Inicio de

sesión), escriba el nombre de usuario y la contraseña de la tienda en línea de

Applied Biosystems y, a continuación, haga clic en Login and Submit (Iniciar la

sesión y enviar).

Nota: Si no tiene cuenta en la tienda en línea de Applied Biosystems, haga clic en

1b,1d

2c 2a

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Solicitud de materiales para el experimento

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

5. Después de realizar el pedido, haga clic en Finish Designing Experiment (Finalizar

el diseño del experimento).

Directrices de

diseño

Cuando diseñe su propio experimento de curva estándar relativa:

• Confirme que el ordenador tiene una conexión a Internet ilimitada.

• Applied Biosystems recomienda las siguientes versiones de navegadores y Adobe®

Acrobat® Reader para utilizar el sitio web de Applied Biosystems:

Nota: Asegúrese de que se han activado las cookies y Java Script para que el sitio

web funcione correctamente.

• Seleccione todos los materiales que necesite para el experimento y añádalos a la

cesta de compra.

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de la pantalla Materials List (Lista de materiales),

acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.

Sistema operativo

del escritorio

Netscape®

Navigator

Microsoft®

Internet Explorer

Adobe® Acrobat®

Reader

Windows®

98/NT/2000 v6.x o posterior v6.x o posterior v4.0 o posterior

Macintosh® OS 9 o

posterior v6.x o posterior v5.2 o posterior v4.0 o posterior

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño

Para finalizar el flujo de trabajo del asistente de diseño, revise la disposición de la placa

y, a continuación, seleccione una opción de salida.

Acerca del

experimento de

ejemplo

El software StepOne selecciona automáticamente ubicaciones para los pocillos en la

placa de reacción. En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo:

• Los pocillos se colocan tal y como se muestra a continuación.

• El experimento se guarda tal y como está y se cierra.

Nota: Para el experimento de ejemplo, no realice el proceso en este momento.

Finalización del

asistente de

diseño

1. En la ventana Review Plate for Experiment (Revisar placa para el experimento),

revise la disposición de la placa. Asegúrese de que hay:

• 12 pocillos desconocidos

• 30 pocillos estándar

• 6 pocillos de control negativo

• 0 pocillos vacíos

Nota: Si la disposición de la placa es incorrecta, haga clic en Return to the Wizard

(Volver al asistente) y compruebe los valores que ha introducido.

2. Haga clic en Save Experiment (Guardar experimento).

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

3. En el cuadro de diálogo Save Experiment (Guardar experimento), haga clic en Save

(Guardar) para aceptar la ubicación y el nombre de archivo predeterminados. El

experimento de ejemplo se guarda y se cierra, y regresa a la pantalla de inicio.

Nota: De manera predeterminada, el experimento de ejemplo se guarda en la

carpeta Applied Biosystems\StepOne System\experiments.

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa

Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Directrices de

diseño

Cuando diseñe su propio experimento de curva estándar relativa:

• En la ventana Review Plate for Experiment (Revisar placa para el experimento),

seleccione la opción de salida apropiada:

– Haga clic en Save Experiment (Guardar experimento) si desea guardar y cerrar

el experimento sin realizar ningún otro cambio ni iniciar el proceso.

– Haga clic en Start Run for This Experiment (Iniciar proceso para este

experimento) si desea guardar el experimento e iniciar el proceso. Asegúrese de

que la placa de reacción está cargada en el instrumento.

– Haga clic en Edit Plate Layout (Editar disposición de placa) si desea utilizar el

flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) para modificar la

disposición de la placa.

– Haga clic en Create Another Experiment Using the Design Wizard (Crear otro

experimento con el asistente de diseño) si desea guardar y cerrar el experimento

y, a continuación, crear otro experimento con el asistente de diseño.

– Haga clic en Return to the Wizard (Regresar al asistente) si desea regresar al

experimento para realizar cambios con el asistente de diseño.

• De manera predeterminada, los experimentos se guardan en la carpeta Applied

Biosystems\StepOne System\experiments. Para cambiar:

– La ubicación en la que se guarda un experimento específico, desplácese a la

ubicación deseada con el cuadro de diálogo Save Experiment (Guardar

experimento).

– La ubicación en la que se guardan los experimentos de manera predeterminada,

seleccione Tools (Herramientas)Preferences (Preferencias) y, a continuación,

seleccione la ficha General (predeterminada). En el campo Default Data Folder

(Carpeta de datos predeterminada), desplácese a la ubicación deseada.

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca del uso del flujo de trabajo Advanced Setup

(Configuración avanzada), consulte “Flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración

avanzada)” en la página 206.

Capítulo 3

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Preparación de las reacciones de la

curva estándar relativa

Este capítulo cubre los siguientes temas:

■Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

■Preparación del molde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

■Preparación de las diluciones de las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

■Preparación de la dilución seriada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

■Preparación de la mezcla de reacción. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

■Preparación de la placa de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

Nota: Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en

esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR

System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o

seleccionando Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne).

Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa

Resumen del capítulo

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Resumen del capítulo

En este capítulo, se explica cómo preparar las reacciones de PCR para el experimentode

curva estándar relativa de ejemplo y se ofrecen directrices para preparar las reacciones de

PCR para su propio experimento de curva estándar relativa.

Flujo de trabajo

del experimento

de ejemplo

A continuación, se muestra el flujo de trabajo para preparar las reacciones de PCR para el

experimento de ejemplo que se incluye en esta guía de introducción.

Diseño del experimento (Capítulo 2)



Experimento de curva estándar relativa

Inicio del experimento



Realización del experimento (Capítulo 4)

Análisis del experimento (Capítulo 5)



Fin del experimento

Preparación de las reacciones (Capítulo 3)

1. Prepare el molde.

2. Prepare las diluciones de las muestras.

3. Prepare la dilución seriada.

4. Prepare la mezcla de reacción para cada ensayo diana.

5. Prepare la placa de reacción.

Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa

Preparación del molde

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Preparación del molde

Prepare el molde para las reacciones de PCR (muestras y estándares) con el High-

Capacity cDNA Reverse Transcription Kit.

¡IMPORTANTE! Applied Biosystems recomienda utilizar High-Capacity cDNA Reverse

Transcription Kit para realizar una retrotranscripción del cDNA a partir de RNA total.

Los TaqMan® Gene Expression Assays se han diseñado utilizando el High-Capacity

cDNA Reverse Transcription Kit; no se han probado otros protocolos para los TaqMan

Gene Expression Assays.

Acerca del

experimento de

ejemplo

Para el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, el molde para las reacciones

de PCR es cDNA sintetizado a partir de las muestras de RNA total utilizando el High-

Capacity cDNA Reverse Transcription Kit.

Materiales

necesarios

• Para las muestras, RNA total aislado de hígado y riñón

• Para los estándares, RNA total aislado de pulmón

Nota: Procure preparar el molde para las muestras y los estándares.

• Uno de los Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits:

Nota: El High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit se llamaba antiguamente

High-Capacity cDNA Archive Kit.

Kit Número de

referencia

High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit

(200 reacciones) 4368814

High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit

(1000 reacciones) 4368813

High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit

with RNase Inhibitor (200 reacciones) 4374966

High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit

with RNase Inhibitor (1000 reacciones) 4374967

Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa

Preparación del molde

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Preparación del

molde

Utilice el High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit para sintetizar cDNA de

cadena sencilla a partir de las muestras de RNA total. Siga los procedimientos de Applied

Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol para:

1. Preparar la mezcla maestra de la reacción.

PELIGRO QUÍMICO. El tampón de reacción 10X puede

causar irritación de los ojos, la piel y las vías respiratorias. Consulte la ficha técnica

de seguridad (MSDS) y siga las instrucciones de manipulación indicadas. Use

protectores oculares, vestimenta protectora y guantes apropiados.

2. Prepare las reacciones de cDNA.

3. Realice la retrotranscripción en un termociclador.

Directrices de

preparación

Cuando prepare su propio experimento de curva estándar relativa:

• Applied Biosystems recomienda extraer primero el DNA o RNA del tejido o

muestra.

• Applied Biosystems recomienda los siguientes moldes:

–cDNA (cDNA) complementario: cDNA sintetizado a partir de las muestras de

RNA total utilizando un High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit.

–RNA: RNA o mRNA total purificado extraído de un tejido o una muestra.

–DNA (gDNA) genómico: gDNA purificado ya extraído de un tejido o una

muestra.

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de:

• La preparación de moldes de cDNA, consulte Applied Biosystems High-Capacity

cDNA Reverse Transcription Kits Protocol (PN 4375575). El protocolo no se

incluye en los High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits. Puede descargarlo

desde el sitio web Applied Biosystems Documents on Demand:

http://docs.appliedbiosystems.com/search.taf

• La preparación de moldes de RNA o gDNA, consulte el protocolo de los reactivos

de purificación que haya seleccionado. Para localizar los reactivos de purificación

de Applied Biosystems, visite el sitio web de Applied Biosystems:

http://www.appliedbiosystems.com/

Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa

Preparación de las diluciones de las muestras

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Preparación de las diluciones de las muestras

Realice diluciones de las muestras antes de añadir las muestras a la mezcla de reacción

final. Diluya las muestras con los volúmenes que ha calculado el software StepOne™

(“Complete la ficha Sample Dilution Calculations (Cálculos de la dilución de muestra)”

en la página 39).

Acerca del

experimento de

ejemplo

Para el experimento de curva estándar relativa de ejemplo:

• Las diluciones de las muestras son necesarias porque el volumen de las muestras se

limita al 10% del volumen total de la reacción en el software StepOne. El volumen

total de la reacción es de 20 µL/reacción, por lo que el volumen de las muestras es

de 2 µL/reacción.

• La concentración de la solución de partida es de 100 ng/µL. Después de diluir la

muestra de acuerdo con la tabla Sample Dilutions Calculations (Cálculos de

diluciones de las muestras), la muestra tendrá una concentración de 5,0 ng/µL. Esto

supone una concentración de 10✕ cuando se añaden 2 µL al volumen de mezcla de

reacción final de 20 µL. Hay una concentración de 1✕ en la reacción final.

• Los volúmenes calculados en el software son:

Materiales

necesarios

• Agua para diluir la muestra

• Tubos de microcentrífuga

•Pipetas

• Puntas de pipeta

• Solución origen de las muestras

•Agitador

• Centrífuga

Preparación de

las diluciones de

las muestras

1. Etiquete un tubo de microcentrífuga diferente para cada muestra diluida:

•Hígado

•Riñón

2. Añada el volumen de agua requerido (disolvente) a cada tubo vacío:

Nombre de la

muestra

Concentración

de la solución

origen (ng/µL)

Volumen de

muestra

(µL)

Volumen de

disolvente

(µL)

Volumen total

de muestra

diluida (µL)

Hígado 100,0 1,0 19,0 20,0

Riñón 100,0 1,0 19,0 20,0

Tubo Nombre de la muestra Volumen de

disolvente (µL)

1 Hígado 19,0

2Riñón 19,0

Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa

Preparación de las diluciones de las muestras

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

3. Añada el volumen de solución de partida de las muestras requerido (muestra) a cada

tubo vacío:

4. Agite cada muestra diluida entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifugue

brevemente los tubos.

5. Coloque las muestras diluidas en hielo hasta que prepare la placa de reacción.

Directrices de

preparación

Cuando prepare su propio experimento de curva estándar relativa:

• Podría necesitar diluciones de las muestras porque el volumen de las muestras se

limita al 10% del volumen total de la reacción en el software StepOne. Debe realizar

diluciones de las muestras antes de añadir las muestras a la mezcla de reacción final.

• Para conseguir un rendimiento óptimo de los TaqMan® Gene Expression Assays o

los Custom TaqMan® Gene Expression Assays, utilice entre 10 y 100 ng de molde

de cDNA por 20-µL de reacción. Para reactivos tipo rápido, Applied Biosystems

recomienda 10 ng.

• Utilice tampón TE o agua para diluir la muestra.

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de los ensayos de Applied Biosystems, consulte:

•TaqMan® Gene Expression Assays Protocol

•Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol

Tubo Nombre de la muestra Volumen de

muestra (µL)

1 Hígado 1,0

2Riñón 1,0

Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa

Preparación de la dilución seriada

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Preparación de la dilución seriada

Prepare la dilución seriada con los volúmenes que ha calculado el software StepOne

(“Complete la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción) para

el ensayo de c-myc” en la página 35 y “Complete la ficha Reaction Mix Calculations

(Cálculos de la mezcla de reacción) para el ensayo de GAPDH” en la página 37):

Acerca del

experimento de

ejemplo

Para el experimento de curva estándar relativa de ejemplo:

• La concentración del estándar en la solución de partida es de 200 ng/µL.

• Los volúmenes calculados en el software para los ensayos de c-myc y GAPDH son:

Materiales

necesarios

• Agua para diluir los estándares

• Tubos de microcentrífuga

•Pipetas

• Puntas de pipeta

• Solución de partida del estándar

•Agitador

• Centrífuga

Preparación de la

dilución seriada

para el

ensayo de c-myc

1. Etiquete un tubo de microcentrífuga diferente para cada estándar:

• c-myc Std. 1

• c-myc Std. 2

• c-myc Std. 3

• c-myc Std. 4

• c-myc Std. 5

Dilución Solución

origen

Volumen

solución

origen

(µL)

Volumen

disolvente

(µL)

Volumen

total

(µL)

Concentración

del estándar

(ng/µL)

1 [200] Solución

origen 5,0 5,0 10,0 100,0

2 [20] Dilución 1 1,0 9,0 10,0 10,0

3 [2] Dilución 2 1,0 9,0 10,0 1,0

4 [0.2] Dilución 3 1,0 9,0 10,0 0,1

5 [0.02] Dilución 4 1,0 9,0 10,0 0,01

Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa

Preparación de la dilución seriada

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

2. Añada el volumen de agua requerido (disolvente) a cada tubo vacío:

3. Prepare la dilución 1 en el tubo c-myc Std. 1:

a. Agite la solución de partida entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifugue

brevemente el tubo.

b. Con una punta de pipeta nueva, añada 5,0 µL de solución de partida al tubo

c-myc Std. 1.

c. Agite el tubo Std. 1 entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifúguelo

brevemente.

4. Prepare la dilución 2 en el tubo c-myc Std. 2:

a. Con una punta de pipeta nueva, añada 1,0 µL de dilución al tubo c-myc

Std. 2.

b. Agite el tubo Std. 2 entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifúguelo

brevemente.

5. Prepare la dilución 3 en el tubo c-myc Std. 3:

a. Con una punta de pipeta nueva, añada 1,0 µL de dilución al tubo c-myc Std. 3.

b. Agite el tubo Std. 3 entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifúguelo

brevemente.

6. Prepare la dilución 4 en el tubo c-myc Std. 4:

a. Con una punta de pipeta nueva, añada 1,0 µL de dilución al tubo c-myc Std. 4.

b. Agite el tubo Std. 4 entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifúguelo

brevemente.

7. Prepare la dilución 5 en el tubo c-myc Std. 5:

a. Con una punta de pipeta nueva, añada 1,0 µL de dilución al tubo c-myc Std. 5.

b. Agite el tubo Std. 5 entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifúguelo

brevemente.

8. Coloque los estándares en hielo hasta que prepare la placa de reacción.

Tubo Nombre de estándar

Volumen de

disolvente

que se debe

añadir (µL)

1 c-myc Std. 1 5,0

2 c-myc Std. 2 9,0

3 c-myc Std. 3 9,0

4 c-myc Std. 4 9,0

5 c-myc Std. 5 9,0

Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa

Preparación de la dilución seriada

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Preparación de la

dilución seriada

para el ensayo de

GAPDH

1. Etiquete un tubo de microcentrífuga diferente para cada estándar:

• GAPDH Std. 1

• GAPDH Std. 2

• GAPDH Std. 3

• GAPDH Std. 4

• GAPDH Std. 5

2. Añada el volumen de agua requerido (disolvente) a cada tubo vacío:

3. Prepare la dilución 1 en el tubo GAPDH Std. 1:

a. Agite la solución de partida entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifugue

brevemente el tubo.

b. Con una punta de pipeta nueva, añada 5,0 µL de solución de partida al tubo

GAPDH Std. 1.

c. Agite el tubo Std. 1 entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifúguelo

brevemente.

4. Prepare la dilución 2 en el tubo GAPDH Std. 2:

a. Con una punta de pipeta nueva, añada 1,0 µL de dilución al tubo GAPDH Std. 2.

b. Agite el tubo Std. 2 entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifúguelo

brevemente.

5. Prepare la dilución 3 en el tubo GAPDH Std. 3:

a. Con una punta de pipeta nueva, añada 1,0 µL de dilución 2 al tubo GAPDH

Std. 3.

b. Agite el tubo Std. 3 entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifúguelo

brevemente.

6. Prepare la dilución 4 en el tubo GAPDH Std. 4:

a. Con una punta de pipeta nueva, añada 1,0 µL de dilución 3 al tubo GAPDH

Std. 4.

Tubo Nombre de estándar

Volumen de

disolvente

que se debe

añadir (µL)

1 GAPDH Std. 1 5,0

2 GAPDH Std. 2 9,0

3 GAPDH Std. 3 9,0

4 GAPDH Std. 4 9,0

5 GAPDH Std. 5 9,0

Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa

Preparación de la mezcla de reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

b. Agite el tubo Std. 4 entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifúguelo

brevemente.

7. Prepare la dilución 5 en el tubo GAPDH Std. 5:

a. Con una punta de pipeta nueva, añada 1,0 µL de dilución 4 al tubo GAPDH

Std. 5.

b. Agite el tubo Std. 5 entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifúguelo

brevemente.

8. Coloque los estándares en hielo hasta que prepare la placa de reacción.

Directrices de

preparación

Cuando prepare su propio experimento de curva estándar relativa:

• Los estándares son esenciales para realizar un análisis preciso de los datos de la

reacción.

• Cualquier error o imprecisión a la hora de realizar las diluciones afecta directamente

a la calidad de los resultados.

• La calidad de pipetas y puntas, y el cuidado que se tenga a la hora de medir y

mezclar las diluciones, afecta a la precisión.

• Utilice tampón TE o agua para diluir el estándar.

Preparación de la mezcla de reacción

Prepare la mezcla de reacción con los componentes y volúmenes que ha calculado el

software StepOne (“Complete la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla

de reacción) para el ensayo de c-myc” en la página 35 y “Complete la ficha Reaction Mix

Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción) para el ensayo de GAPDH” en la

página 37).

Nota: El software calcula todos los componentes de las reacciones de PCR. Sin

embargo, para preparar la mezcla de reacción de esta sección, incluya únicamente la

mezcla maestra, el ensayo y agua. Añada la muestra o el estándar cuando prepare la placa

de la reacción (consulte “Preparación de la placa de reacción” en la página 61).

Acerca del

experimento de

ejemplo

Para el experimento de curva estándar relativa de ejemplo:

• Los componentes de la mezcla de reacción son:

–TaqMan

® Fast Universal PCR Master Mix (2✕)

– Ensayo de c-myc (20✕)

– Ensayo de GAPDH (20✕)

– Agua

Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa

Preparación de la mezcla de reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

• Los volúmenes calculados en el software para ambos ensayos diana son:

Nota: En este momento, no se añade la muestra ni el estándar.

Materiales

necesarios

• Tubos de microcentrífuga

•Pipetas

• Puntas de pipeta

• Componentes de la mezcla de reacción (enumerados arriba)

• Centrífuga

Preparación de la

mezcla de

reacción

¡IMPORTANTE! Prepare la mezcla de reacción para cada ensayo diana por separado.

1. Etiquete un tubo del tamaño apropiado para cada mezcla de reacción:

• Mezcla de reacción para c-myc

• Mezcla de reacción para GAPDH

2. Para el ensayo de c-myc, añada los volúmenes requeridos de cada componente al

tubo de la mezcla de reacción de c-myc:

Componente Volumen (µL) para

1 reacción

Mezcla maestra (2✕) 10,0

Ensayo (20✕)1,0

H2O7,0

Volumen total 18,0

Componente Volumen (µL) para

1 reacción

Volumen (µL) para

24 reacciones

(más un exceso del

10%)

TaqMan® Fast Universal PCR

Master Mix (2✕)10,0 264,0

Ensayo de c-myc (20✕) 1,0 26,4

Agua 7,0 184,8

Volumen total de la mezcla de

reacción

18,0 475,2

Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa

Preparación de la mezcla de reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

3. Para el ensayo de GAPDH, añada los volúmenes requeridos de cada componente al

tubo de la mezcla de reacción de GAPDH:

4. Para mezclar la mezcla de reacción de cada tubo, pipetee suavemente hacia arriba y

hacia abajo y, a continuación, tápelos.

5. Centrifugue brevemente los tubos para quitar las burbujas de aire.

6. Coloque las mezclas de las reacciones en hielo hasta que prepare la placa de

reacción.

Directrices de

preparación

Cuando prepare su propio experimento de curva estándar relativa:

• Si el experimento incluye más de un ensayo diana, prepare la mezcla de reacción

para cada ensayo diana de manera separada.

• Incluya un volumen de exceso en los cálculos para compensar la pérdida que se

produce durante las transferencias de reactivos. Applied Biosystems recomienda un

volumen de exceso de al menos el 10%.

• Incluya todos los componentes requeridos.

• Prepare los reactivos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

• Mantenga los ensayos protegidos de la luz, en el refrigerador, hasta que esté listo

para usarlos. Una exposición excesiva a la luz puede afectar a las sondas

fluorescentes.

• Antes de utilizarlo:

– Dé vueltas al bote para mezclar bien la mezcla maestra.

– Agite el ensayo para resuspenderlo y, a continuación, centrifugue brevemente el

tubo.

– Para descongelar las muestras congeladas, colóquelas en hielo. Una vez

descongeladas, agite las muestras para resuspenderlas y, a continuación,

centrifugue los tubos brevemente.

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de la preparación de la mezcla de reacción, consulte

el protocolo apropiado para los reactivos que está utilizando en las reacciones de PCR:

•TaqMan

® Gene Expression Assays Protocol

• Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol

Componente Volumen (µL) para

1 reacción

Volumen (µL) para

24 reacciones

(más un exceso del

10%)

TaqMan® Fast Universal PCR

Master Mix (2✕)10,0 264,0

Ensayo de GAPDH (20✕) 1,0 26,4

Agua 7,0 184,8

Volumen total de la mezcla de

reacción

18,0 475,2

Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa

Preparación de la placa de reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Preparación de la placa de reacción

Prepare las reacciones para cada grupo de réplicas y, a continuación, transfiéralas a la

placa de reacción. Utilice la disposición de la placa que se muestra en el software

StepOne.

Acerca del

experimento de

ejemplo

Para el experimento de curva estándar relativa de ejemplo:

• Se utiliza una MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate.

• El volumen de la reacción es de 20 µL/pocillo.

• La placa de reacción contiene:

– 12 pocillos desconocidos

– 30 pocillos estándar

– 6 pocillos de control negativo

– 0 pocillos vacíos

• Se utiliza la disposición de la placa que genera automáticamente el software

StepOne:

Materiales

necesarios

• Tubos de microcentrífuga

•Pipetas

• Puntas de pipeta

• Mezcla de reacción para c-myc (página 59)

• Mezcla de reacción para GAPDH (página 59)

•Agua

• Estándares de c-myc (página 55)

• Estándares de GAPDH (página 57)

• Muestras (página 53)

•MicroAmp

™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate

•MicroAmp

™ Optical 48-Well Adhesive Film

Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa

Preparación de la placa de reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

• Centrífuga

Preparación de la

placa de reacción

1. Para cada gen diana, prepare las reacciones de control negativo:

a. A un tubo del tamaño apropiado, añada los volúmenes de la mezcla de reacción

y de agua que se indican a continuación.

b. Para mezclar la reacción, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo y, a

continuación, tape el tubo.

c. Centrifugue brevemente el tubo para quitar las burbujas de aire.

d. Añada 20 µL de la reacción de control negativo a los pocillos apropiados de la

placa de reacción.

2. Por cada grupo de réplicas, prepare las reacciones estándar:

a. A tubos del tamaño adecuado, añada los volúmenes de la mezcla de reacción y

de estándar que se indican a continuación.

Tubo Mezcla de

reacción

Volumen de la

mezcla de

reacción (µL)

Volumen de

agua (µL)

1 Mezcla de reacción

para c-myc 59,4 6,6

2 Mezcla de reacción

para GAPDH 59,4 6,6

Tubo Reacción

estándar

Mezcla de

reacción

Volumen

de la

mezcla de

reacción

(µL)

Estándar

Volumen

estándar

(µL)

1 c-myc Std 1 Mezcla de

reacción

para c-myc

59,4 c-myc Std 1 6,6

2 c-myc Std 2 Mezcla de

reacción

para c-myc

59,4 c-myc Std 2 6,6

3 c-myc Std 3 Mezcla de

reacción

para c-myc

59,4 c-myc Std 3 6,6

4 c-myc Std 4 Mezcla de

reacción

para c-myc

59,4 c-myc Std 4 6,6

5 c-myc Std 5 Mezcla de

reacción

para c-myc

59,4 c-myc Std 5 6,6

Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa

Preparación de la placa de reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

b. Para mezclar las reacciones, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo y, a

continuación, tape los tubos.

c. Centrifugue brevemente los tubos para quitar las burbujas de aire.

d. Añada 20 µL de la reacción estándar a los pocillos apropiados de la placa de

reacción.

6 GAPDH

Std 1 Mezcla de

reacción

para

GAPDH

59,4 GAPDH

Std 1 6,6

7 GAPDH

Std 2 Mezcla de

reacción

para

GAPDH

59,4 GAPDH

Std 2 6,6

8 GAPDH

Std 3 Mezcla de

reacción

para

GAPDH

59,4 GAPDH

Std 3 6,6

9 GAPDH

Std 4 Mezcla de

reacción

para

GAPDH

59,4 GAPDH

Std 4 6,6

10 GAPDH

Std 5 Mezcla de

reacción

para

GAPDH

59,4 GAPDH

Std 5 6,6

Tubo Reacción

estándar

Mezcla de

reacción

Volumen

de la

mezcla de

reacción

(µL)

Estándar

Volumen

estándar

(µL)

Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa

Preparación de la placa de reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

3. Por cada grupo de réplicas, prepare las reacciones para los elementos desconocidos

o muestras:

a. A tubos del tamaño adecuado, añada los volúmenes de la mezcla de reacción y

de las muestras que se indican a continuación.

b. Para mezclar las reacciones, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo y, a

continuación, tape los tubos.

c. Centrifugue brevemente los tubos para quitar las burbujas de aire.

d. Añada 20 µL de la mezcla de reacción desconocida (muestra) a los pocillos

apropiados de la placa de reacción.

4. Selle la placa de reacción con película adhesiva óptica.

5. Centrifugue brevemente la placa de reacción para quitar las burbujas de aire.

6. Hasta que esté preparado para realizar la reacción, coloque la placa de reacción en

hielo en un sitio oscuro.

Directrices de

preparación

Cuando prepare su propio experimento de curva estándar relativa:

• Procure utilizar los consumibles adecuados.

• Asegúrese de que la colocación de las reacciones de PCR se corresponde con la

disposición de la placa que se muestra en el software StepOne. Puede:

– Aceptar la disposición de la placa que genera automáticamente el software.

– Utilizar el flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) para

cambiar la disposición de la placa en el software.

Tubo Reacción

desconocida

Mezcla de

reacción

Volumen

de la

mezcla de

reacción

(µL)

Muestra

Volumen

de muestra

(µL)

1 c-myc en

hígado Mezcla de

reacción

para c-myc

59,4 Hígado 6,6

2 c-myc en

riñón Mezcla de

reacción

para c-myc

59,4 Riñón 6,6

3 GAPDH en

hígado Mezcla de

reacción

para

GAPDH

59,4 Hígado 6,6

4 GAPDH en

riñón Mezcla de

reacción

para

GAPDH

59,4 Riñón 6,6

Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa

Preparación de la placa de reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de:

• La preparación de la placa de reacción, consulte el protocolo apropiado para los

reactivos que está utilizando en las reacciones de PCR:

–TaqMan® Gene Expression Assays Protocol

–Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol

• Los consumibles, consulte “Consumibles admitidos” en la página 3.

• El uso del flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) para cambiar

la disposición de la placa, consulte “Flujo de trabajo Advanced Setup

(Configuración avanzada)” en la página 206.

Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa

Preparación de la placa de reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Capítulo 4

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Realización del experimento de curva

estándar relativa

Este capítulo cubre los siguientes temas:

■Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

■Preparación de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

■(Opcional) Activación de las notificaciones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

■Inicio de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

■Monitorización de la reacción. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

■Descarga de la placa de reacción y transferencia de datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

Nota: Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en

esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR

System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o

seleccionando Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne).

Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa

Resumen del capítulo

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Resumen del capítulo

En este capítulo, se explica cómo realizar una reacción en Applied Biosystems StepOne™

Real-Time PCR System.

Flujo de trabajo

del experimento

de ejemplo

A continuación, se muestra el flujo de trabajo para realizar el experimento de ejemplo

que se incluye en esta guía de introducción.

Diseño del experimento (Capítulo 2)



Inicio del experimento



Preparación del experimento (Capítulo 3)

Análisis del experimento (Capítulo 5)

Fin del experimento



Realización del experimento (Capítulo 4)

1. Prepare el proceso.

2. Active las opciones de notificación.

3. Inicie el proceso.

4. Monitorice el proceso.

5. Descargue el instrumento y transfiera los datos.

Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa

Preparación de la reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Preparación de la reacción

Para preparar la reacción, abra el experimento y cargue la MicroAmp™ Fast Optical 48-

Well Reaction Plate en el instrumento StepOne™.

Apertura del

experimento de

ejemplo

1. Si aún no se está ejecutando el software StepOne™, haga doble clic en (acceso

directo al software StepOne) o seleccione Start (Inicio)All Programs (Todos los

programas)Applied Biosystems StepOneStepOne v2.0.

2. En la pantalla Home (Inicio), haga clic en Open (Abrir).

3. En el cuadro de diálogo Open (Abrir), desplácese hasta la carpeta experiments

(experimentos) (predeterminada).

4. Haga doble clic en Relative Standard Curve Example (Ejemplo de curva estándar

relativa) para abrir el archivo del experimento de ejemplo que ha creado en el

Capítulo 2.

Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa

Preparación de la reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Carga de la placa

de reacción

PELIGRO DE LESIONES FÍSICAS. Durante el uso del

instrumento, la temperatura del bloque puede superar los 100 °C. Si el instrumento se ha

utilizado recientemente, mantenga las manos alejadas de él hasta que el bloque alcance la

temperatura ambiente.

¡IMPORTANTE! Lleve guantes sin polvo para manejar la

placa de reacción

1. Abra la bandeja del instrumento.

2. Coloque las reacciones en el bloque.

La colocación de las reacciones depende del tipo de consumible que se utilice:

• Si utiliza una placa de reacción, colóquela con el pocillo A1 en la esquina

posterior izquierda.

• Si utiliza tiras de tubos de reacción, colóquelas en el bloque directamente.

3. Cierre cuidadosamente la bandeja del instrumento.

Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa

(Opcional) Activación de las notificaciones

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

(Opcional) Activación de las notificaciones

Active las opciones de notificación para que el software StepOne le avise por correo

electrónico del momento en que el instrumento StepOne comienza y completa el

proceso, o si se produce algún error en el proceso. La activación de la función de

notificación es opcional y no afecta al rendimiento del sistema StepOne™ ni a la duración

de la reacción.

¡IMPORTANTE! La función de notificación sólo está disponible si el ordenador donde

desea recibir la notificación está controlando el instrumento StepOne y está conectado a

una red Ethernet.

Nota: El sistema de notificación también está disponible en los ordenadores que

monitorizan un instrumento StepOne de manera remota. Para obtener más información

acerca de la monitorización remota, consulte “Monitorización remota” en la página 83.

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de ejemplo, el software StepOne está configurado para enviar

notificaciones a tres usuarios (científico, supervisor y técnico de mycompany.com)

cuando el sistema StepOne termina el proceso y si encuentra algún error durante la

operación. El servidor SMTP de ejemplo (www.mycompany.com) está configurado para

el cifrado SSL (Secure Sockets Layer) y, para utilizarlo, se requiere autenticación.

Configuración de

las opciones de

notificación

1. En el software StepOne, haga clic en Run (Proceso) en la columna de

navegación.

2. Haga clic en Notification Settings (Opciones de notificación).

3. Seleccione Enable Notifications (Activar notificaciones).

4. Seleccione los eventos que desencadenarán las notificaciones:

a. Seleccione Instrument Error (Error del instrumento).

b. Seleccione Run Completed (Proceso completado).

5. En el campo Enter e-mail addresses for notifications (Escriba las direcciones de

correo electrónico para las notificaciones), escriba: scientist@mycompany.com,

supervisor@mycompany.com, technician@mycompany.com.

6. En el campo Outgoing Mail Server (SMTP) (Servidor de correo saliente (SMTP)),

escriba smtp.mycompany.com.

7. Ajuste las opciones de autenticación:

a. Seleccione No en Server requires authentication (El servidor requiere

autenticación).

b. En el campo User Name (Nombre de usuario), escriba supervisor.

c. En el campo Password (Contraseña), escriba password.

Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa

(Opcional) Activación de las notificaciones

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Directrices de

proceso

Si configura el sistema StepOne para la notificación automática:

• El sistema StepOne debe estar configurado para su uso en red. Consulte la Guía de

instalación de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System.

• Determine los eventos de los que quiere recibir una notificación:

–Instrument Error (Error del instrumento): el sistema StepOne envía por correo

electrónico a los destinatarios todos los errores que se producen en el instrumento

StepOne durante cada proceso.

–Run Started (Proceso iniciado): el proceso StepOne envía un correo electrónico

a los destinatarios cada vez que el instrumento inicia una reacción.

–Run Completed (Proceso completado): el proceso StepOne envía un correo

electrónico a los destinatarios cada vez que el instrumento completa una

reacción.

• Obtenga las direcciones de correo electrónico en las que desea recibir

notificaciones.

¡IMPORTANTE! Separe las direcciones con una coma ( , ).

• Póngase en contacto con el administrador del sistema o con el departamento de

tecnología de la información para obtener:

– La dirección de red del servidor de protocolo de transferencia de correo simple

(SMTP) en la LAN

– Un nombre de usuario y contraseña para el servidor, si son necesarios para el

acceso

– La configuración de SSL (Secure Sockets Layer) del servidor (activada o

desactivada)

Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa

Inicio de la reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Inicio de la reacción

Inicie el proceso de acuerdo con la disposición del instrumento StepOne. La forma en la

que hay que iniciar el proceso depende de la disposición del sistema StepOne:

Inicio conectado Realice este procedimiento si el ordenador está conectado directamente al instrumento

StepOne por medio del cable del sistema StepOne.

1. En el software StepOne, haga clic en Temperature Plot (Gráfica de

temperatura).

2. Haga clic en START RUN (Iniciar proceso) .

Disposición Descripción Consulte…

Conectada El cable amarillo del sistema StepOne conecta el

ordenador al instrumento StepOne. “Inicio conectado”

más abajo

Autónoma • El ordenador y el instrumento StepOne no están

conectados, o

• El ordenador y el instrumento StepOne están

conectados a la misma red.

“Inicio autónomo”

en la página 74

Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa

Inicio de la reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Inicio autónomo Realice este procedimiento si el ordenador y el instrumento StepOne no están

directamente conectados por medio del cable amarillo del sistema StepOne.

1. Si el ordenador y el instrumento StepOne están conectados a la misma red, realice

los pasos 1a a 1f. De lo contrario, vaya al paso 2.

a. En el software StepOne, haga clic en Send Experiment to Instrument

(Enviar experimento al instrumento).

b. En el cuadro de diálogo Send Experiment to Instrument (Enviar experimento al

instrumento), haga clic en Browse (Examinar), seleccione el archivo Relative

Standard Curve Example.eds y, a continuación, haga clic en Open (Abrir).

c. Seleccione el instrumento StepOne en el menú desplegable Select Instrument

(Seleccionar instrumento).

Si no aparece su instrumento StepOne, configúrelo para la monitorización, tal

y como se explica en la Guía de instalación de Applied Biosystems StepOne™

Real-Time PCR System.

d. Haga clic en Send Experiment (Enviar experimento) para enviar el

experimento al instrumento StepOne a través de la red.

e. Cuando se le solicite, haga clic en OK (Aceptar) para cerrar el mensaje de

confirmación.

f. Vaya al paso 6.

2. Si el instrumento StepOne no está conectado al ordenador, realice los pasos 2a a 2d

para transferir el experimento utilizando una unidad USB.

a. Conecte la unidad USB a uno de los puertos USB del ordenador.

b. En el software StepOne, seleccione Save (Guardar)Save As (Guardar

como).

c. En el cuadro de diálogo Save (Guardar), desplácese a la unidad USB y, a

continuación, haga clic en Save (Guardar).

d. Extraiga la unidad USB del ordenador y, a continuación, conéctela al puerto

USB del instrumento StepOne.

experiments\Relative Standard Curve Example.eds

Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa

Inicio de la reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

3. Toque la pantalla táctil del instrumento StepOne y, a continuación, toque .

4. En la pantalla del menú principal, toque Browse Experiments (Buscar

experimentos).

5. En la pantalla Browse Methods (Métodos de búsqueda), toque (Folders)

(Carpetas).

6. En la pantalla Choose an Experiment Category (Elija una categoría de

experimento):

• Toque USB si ha transferido el experimento a una unidad USB.

• Toque Default (Predeterminado) si ha enviado el experimento a través de una

conexión de red.

7. En la pantalla Browse USB/Default Experiments (Buscar USB/experimentos

predeterminados):

a. Toque Relative Standard Curve Example (Ejemplo de curva estándar

relativa) para seleccionar el experimento.

b. Toque Start Run (Iniciar proceso).

8. En la pantalla Run Parameters (Parámetros de proceso):

a. Toque el campo Reaction Volume (Volumen de reacción), utilice el teclado

para escribir 20 µL y, a continuación, toque Done (Finalizado).

Ejemplo de curva estándar

Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa

Monitorización de la reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

b. Toque Start Run (Iniciar proceso).

Monitorización de la reacción

Monitorice el progreso desde un ordenador que ejecute el software StepOne o desde la

pantalla táctil del instrumento StepOne. La forma en la que monitorice el proceso

depende de la disposición del sistema StepOne:

8a 20

Disposición Descripción Consulte…

Conectada El cable del sistema StepOne conecta el

ordenador al instrumento StepOne. “Monitorización

conectada” más abajo

Autónoma

(en red) El ordenador y el instrumento StepOne están

conectados a la misma red. “Monitorización remota”

en la página 83

Autónoma

(básica) El ordenador y el instrumento StepOne no están

conectados. “Monitorización

autónoma” en la

página 86

Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa

Monitorización de la reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Monitorización

conectada

Si el ordenador está directamente conectado al instrumento StepOne por medio del cable

del sistema StepOne, puede ver el progreso de la reacción a tiempo real de la forma que

se describe a continuación. Durante el proceso, observe periódicamente las tres gráficas

disponibles en el software StepOne para detectar posibles problemas.

# Para... Acción

A Detener el proceso 1. En el software StepOne, haga clic en STOP RUN (Detener

proceso).

2. En el cuadro de diálogo Stop Run (Detener proceso), haga

clic en una de las siguientes opciones:

–Stop Immediately (Detener inmediatamente) para

detener el proceso inmediatamente.

–Stop after Current Cycle/Hold (Detener después de

ciclo actual/espera) para detener el proceso después del

ciclo o la espera actual.

–Cancel (Cancelar) para continuar el proceso.

B Ver los datos de

amplificación a tiempo

real

Seleccione Amplification Plot (Gráfica de amplificación).

Consulte “Acerca de la pantalla Amplification Plot (Gráfica de

amplificación)” en la página 78.

C Ver los datos de la

temperatura de la

reacción a tiempo real

Seleccione Temperature Plot (Gráfica de temperatura).

Consulte “Acerca de la pantalla Temperature Plot (Gráfica de

temperatura)” en la página 80.

D Ver el progreso de la

reacción en la pantalla

Run Method (Protocolo

de termociclado)

Seleccione Run Method (Protocolo de termociclado).

Consulte “Acerca de la pantalla Run Method (Protocolo de

termociclado)” en la página 81.

E Activar/desactivar las

opciones de

notificación

Active o desactive la opción Enable Notifications (Activar

notificaciones).

Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa

Monitorización de la reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Acerca de la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación)

La pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) permite ver la amplificación

de las muestras a medida que el instrumento StepOne recoge datos de fluorescencia

durante una reacción. Si se configura un protocolo de recogida de datos a tiempo real, en

la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) aparecen los datos de los

pocillos seleccionados en la ficha View Plate Layout (Ver disposición de placa). La

gráfica representa la fluorescencia de los distintos fluorocromos normalizados (∆Rn) y el

número de ciclos. La siguiente figura muestra la pantalla Amplification Plot (Gráfica de

amplificación) durante el experimento de ejemplo.

Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa

Monitorización de la reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

La pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) es útil para identificar y

examinar amplificaciones anormales. Una amplificación anormal puede incluir lo

• Aumento de la fluorescencia en los pocillos de control negativo.

• Ausencia de fluorescencia detectable en el ciclo esperable (determinada a partir de

experimentos similares anteriores utilizando los mismos reactivos en las mismas

condiciones).

Si se observa una amplificación anormal o una completa ausencia de señal, solucione el

error de la forma que se explica en la ayuda del software StepOne (haga clic en en la

barra de herramientas o seleccione Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne)).

Nota: Para ver los datos de la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación),

seleccione los pocillos que desea ver en la ficha View Plate Layout (Ver disposición de

placa).

Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa

Monitorización de la reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Acerca de la pantalla Temperature Plot (Gráfica de temperatura)

Durante una reacción, la pantalla Temperature Plot (Gráfica de temperatura) muestra las

temperaturas del bloque, la cubierta caliente y las muestras (calculadas) a tiempo real. La

siguiente figura muestra la pantalla Temperature Plot (Gráfica de temperatura) durante el

experimento de ejemplo.

La pantalla Temperature Plot (Gráfica de temperatura) puede ser útil para identificar

averías del hardware. Al monitorizar la pantalla Temperature Plot (Gráfica de

temperatura), observe las gráficas Sample (Muestra), Heated Cover (Cubierta caliente) y

Sample Block (Bloque) para detectar algún comportamiento anormal.

• En general, las gráficas Sample (Muestra) y Block (Bloque) deberían ser más o

menos un espejo la una de la otra. Una desviación significativa de las gráficas puede

indicar un problema.

• La gráfica Heated Cover (Cubierta caliente) debería mantener la temperatura

constante que se especifica en el protocolo de termociclado. Cualquier desviación

de la temperatura puede indicar un problema.

Para... Acción

A Añadir/quitar gráficas de

temperatura Seleccione Sample (Muestra), Heated Cover

(Cubierta caliente) o Sample Block (bloque) para

cambiar la presencia de los datos asociados en la

gráfica.

B Cambiar el tiempo que se muestra

por gráfica Seleccione View (Ver)(duración).

C Restringir el eje Y de la gráfica Seleccione Fixed View (Vista fija).

Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa

Monitorización de la reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Si observa una gráfica de temperatura anormal, solucione el error de la forma que se

explica en la ayuda del software StepOne (haga clic en en la barra de herramientas o

seleccione Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne)).

Nota: La temperatura de las muestras que se indica en el grupo Current Temperatures

(Temperaturas actuales) es un valor estimado.

Acerca de la pantalla Run Method (Protocolo de termociclado)

Después de comenzar el proceso, el sistema StepOne muestra su progreso en la pantalla

Run Method (Protocolo de termociclado). La vista informa del progreso de la reacción en

referencia con el perfil térmico de la misma. La siguiente figura muestra la pantalla Run

Method (Protocolo de termociclado) durante el experimento de ejemplo.

Para... Acción

A Cambiar el protocolo

de termociclado

(añadir ciclos, una

espera o una curva de

disociación)

1. En el panel de navegación, haga clic en Run Method

(Protocolo de termociclado).

2. En la pantalla Run Method (Protocolo de termociclado),

haga cualquiera de las siguientes acciones:

– Escriba el número de ciclos que se van a aplicar a la fase

cíclica.

– Seleccione Add Melt Curve Stage to End (Añadir curva

de disociación al final) si desea añadir una curva de

disociación al final de la reacción.

– Seleccione Add Holding Stage to End (Añadir fase de

espera al final) si desea añadir una fase de espera al final

de la reacción.

3. Haga clic en Send to Instrument (Enviar al instrumento).

Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa

Monitorización de la reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Nota: Si aparece una alerta, haga clic en el error para obtener más información y

solucionar el problema tal y como se explica en la ayuda del software StepOne (haga clic

en en la barra de herramientas o seleccione Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de

StepOne)).

Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa

Monitorización de la reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Monitorización

remota

Si el instrumento StepOne está conectado a una red, puede utilizar la función de

monitorización remota del software StepOne para ver el progreso de la reacción a tiempo

real desde cualquier ordenador de la red.

¡IMPORTANTE! Los ordenadores en red no pueden controlar el instrumento StepOne,

sólo monitorizarlo.

Para monitorizar el instrumento StepOne de manera remota:

1. En el software StepOne, seleccione Instrument (Instrumento)Remote Monitor

(Supervisor remoto).

2. En la barra de navegación, seleccione el instrumento StepOne.

Si en la barra de navegación no aparece el instrumento StepOne:

# Para... Acción

A Ver los datos de

amplificación a tiempo

real

Haga clic en Amplification Plot (Gráfica de amplificación).

Consulte “Acerca de la pantalla Amplification Plot (Gráfica de

amplificación)” en la página 78.

B Ver los datos de la

temperatura de la

reacción a tiempo real

Haga clic en Temperature Plot (Gráfica de temperatura).

Consulte “Acerca de la pantalla Temperature Plot (Gráfica de

temperatura)” en la página 80.

C Ver el progreso de la

reacción en la pantalla

Run Method (Protocolo

de termociclado)

Haga clic en Run Method (Protocolo de termociclado).

Consulte “Acerca de la pantalla Run Method (Protocolo de

termociclado)” en la página 81.

D Activar/desactivar las

opciones de

notificación

Active o desactive la opción Enable Notifications (Activar

notificaciones).

Consulte “(Opcional) Activación de las notificaciones” en la

página 71.

A B C

Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa

Monitorización de la reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

a. Haga clic en Add Instrument (Añadir instrumento).

b. Haga clic en el campo Instrument Name (Nombre de instrumento) y, a

continuación, escriba el nombre del instrumento.

c. Haga clic en el campo Host Name (Nombre de host) y, a continuación,

introduzca la dirección IP del instrumento.

d. Haga clic en Save & Exit (Guardar y salir).

Nota: Para obtener más información acerca de la configuración del instrumento

StepOne para el uso en red o la monitorización remota, consulte la Guía de

instalación de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System.

3. Haga clic en (Start monitoring this instrument) (Comenzar a monitorizar este

instrumento) de su instrumento.

Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa

Monitorización de la reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa

Monitorización de la reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Monitorización

autónoma

Si ha comenzado la reacción desde el instrumento StepOne, puede ver el progreso de la

misma desde la pantalla táctil. La pantalla Run Method (Protocolo de termociclado)

muestra el método del experimento y resalta los pasos del perfil térmico a medida que el

instrumento va realizándolos.

# Para... Acción

A Añadir una curva de

disociación a la

reacción

Toque (Add Dissociation Curve) (Añadir curva de

disociación) y, a continuación, toque OK (Aceptar).

B Ver el tiempo que

queda en el proceso Toque Display Method Time (Ver tiempo de método) y, a

continuación, toque para regresar a la pantalla Run Method

(Protocolo de termociclado).

C Detener el proceso Toque Stop (Detener) y, a continuación, toque:

•Stop (Detener) para detener el proceso después de que el

instrumento StepOne complete el ciclo o la espera actual.

•Abort (Abortar) para detener el proceso inmediatamente.

• para continuar el proceso sin ningún cambio.

D Ver información del

experimento Toque View Method Information (Ver información del

método) y, a continuación, toque para regresar a la pantalla

Run Method (Protocolo de termociclado).

E Ver el registro de

errores Toque la barra de estado para ver el registro de errores.

Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa

Descarga de la placa de reacción y transferencia de datos

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Descarga de la placa de reacción y transferencia de datos

Cuando el instrumento StepOne muestre la pantalla Run History (Historial de la

reacción), descargue la placa de reacción del instrumento StepOne y transfiera los datos

del experimento al ordenador para analizarlos.

Descarga de la

placa de reacción

PELIGRO DE LESIONES FÍSICAS. Durante el uso del

instrumento, la temperatura del bloque puede superar los 100 °C. Mantenga las manos

alejadas hasta que la bandeja de las muestras alcance la temperatura ambiente.

Nota: Cuando el instrumento StepOne complete una reacción, el sistema guardará los

detalles en el historial de reacciones, que permanece en el sistema hasta que el sistema

completa otro proceso.

1. Cuando aparezca la pantalla Run Report (Informe de proceso) en la pantalla táctil

del instrumento StepOne, toque .

2. Abra la bandeja del instrumento.

3. Saque la placa de reacción del bloque.

4. Cierre con cuidado la bandeja del instrumento.

¡IMPORTANTE! No apague el instrumento StepOne después de una reacción. El

instrumento activa automáticamente un modo de hibernación cuando no se está

utilizando.

Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa

Descarga de la placa de reacción y transferencia de datos

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Selección de un

método de

transferencia de

datos

Transfiera el experimento al ordenador para analizarlo, de acuerdo con la disposición del

sistema StepOne:

Transferencia de

datos conectada

Si el ordenador está conectado directamente al instrumento StepOne por medio del cable

del sistema StepOne, no hay que hacer nada. El software StepOne transfiere

automáticamente los datos del experimento al instrumento StepOne después de la

reacción.

Transferencia de

datos remota

Si el ordenador y el instrumento StepOne están conectados a la misma red Ethernet,

envíe el experimento al instrumento StepOne a través de la red:

1. En el software StepOne, haga clic en Download Experiment from Instrument

(Descargar experimento del instrumento).

2. En el cuadro de diálogo Download Experiment from Instrument (Descargar

experimento del instrumento), seleccione Select Instrument (Seleccionar

instrumento)<su instrumento>.

3. Seleccione Experiment (Experimento)Relative Standard Curve Example

(Ejemplo de curva estándar relativa).

4. En el campo Download File (Descargar archivo), haga clic en Browse (Examinar),

seleccione una carpeta en la que recibir los datos del experimento y, a continuación,

haga clic en Select (Seleccionar).

5. Haga clic en Download Experiment (Descargar experimento) para descargar el

experimento desde el instrumento StepOne al ordenador a través de la red.

6. Cuando se le solicite, haga clic en OK (Aceptar) para cerrar el mensaje de

confirmación.

Disposición Descripción Consulte…

Conectada El cable del sistema StepOne conecta el

ordenador al instrumento StepOne. “Transferencia de

datos conectada” más

abajo

Autónoma

(en red) El ordenador y el instrumento StepOne están

conectados a la misma red. “Transferencia de datos

remota” en la página 88

Autónoma

(básica) El ordenador y el instrumento StepOne no

están conectados. “Transferencia de

datos autónoma” en la

página 89

Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa

Descarga de la placa de reacción y transferencia de datos

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Transferencia de

datos autónoma

Si el ordenador no está conectado al instrumento StepOne, utilice la unidad USB para

transferir el experimento al instrumento:

1. Si aún no está conectada al instrumento, conecte una unidad USB al puerto USB.

2. Toque la pantalla táctil del instrumento StepOne para activarla y, a continuación,

toque .

3. En el menú principal, toque Collect Results (Recoger resultados) para guardar los

datos en la unidad USB.

Si el instrumento StepOne no encuentra la unidad USB, toque OK (Aceptar), espere

30 segundos y, a continuación, vuelva a tocar Collect Results (Recoger resultados).

4. Cuando aparezca un mensaje que le informa de que los datos se han transferido

correctamente, toque OK (Aceptar).

5. Extraiga la unidad USB del instrumento StepOne y, a continuación, conéctela al

puerto USB del ordenador.

6. En el escritorio del ordenador, utilice el explorador de Windows para abrir la unidad

USB.

Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa

Descarga de la placa de reacción y transferencia de datos

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

7. Copie el archivo Relative Standard Curve Example.eds en:

<unidad>:\Applied Biosystems\StepOne System\experiments

donde <unidad> es la unidad del disco duro del ordenador en la que está instalado

el software de StepOne. La unidad de instalación predeterminada del software es la

unidad C.

Capítulo 5

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Análisis del experimento de curva

estándar relativa

Este capítulo cubre los siguientes temas:

■Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

■Sección 5.1 Revisión de los resultados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93

■Sección 5.2 Solución de problemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113

Nota: Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en

esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR

System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o

seleccionando Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne).

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Resumen del capítulo

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Resumen del capítulo

El software StepOne™ analiza los datos mediante el método de cuantificación de curva

estándar relativa. En la primera sección de este capítulo, se explica cómo revisar los datos

analizados utilizando las pantallas de análisis y cómo presentar los datos. Si los

resultados son cuestionables, en la Sección 2 de este capítulo se explican algunos pasos

para solucionar los problemas.

Nota: El experimento de curva estándar relativa de ejemplo incluye cuatro pocillos

problemáticos que aparecen marcados con un aviso. Los avisos reflejan problemas

comunes que se puede encontrar al realizar sus propios experimentos. Se incluyen

procedimientos para ver los avisos y omitir uno de los pocillos.

Flujo de trabajo

del experimento

de ejemplo

A continuación, se muestra el flujo de trabajo para analizar el experimento de ejemplo

que se incluye en esta guía de introducción.

Diseño del experimento (Capítulo 2)



Experimento de curva estándar relativa

Inicio del experimento



Preparación de las reacciones (Capítulo 3)

Realización del experimento (Capítulo 4)



Fin del experimento

Análisis del experimento (Capítulo 5)

Sección 1. Revisión de los resultados:

1. Analice.

2. Revise la pantalla Standard Curve (Curva estándar).

3. Revise la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación).

4. Revise la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica) o

la tabla de pocillos.

5. Presente los datos.

Sección 2. Solución de problemas:

1. Revise las opciones de análisis; ajuste la línea basal y el umbral.

2. Revise la pantalla QC Summary (Resumen QC).

3. Omita pocillos.

4. Revise la pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente).

5. Revise la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos).

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Sección 5.1 Revisión de los resultados

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Sección 5.1 Revisión de los resultados

Esta sección cubre los siguientes temas:

■Análisis del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

■Visualización de la curva estándar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100

■Revisión de la gráfica de amplificación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103

■Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos . . . . . . . . . . . . 108

■Presentación de los datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Análisis del experimento

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Análisis del experimento

El software StepOne analiza el experimento y muestra los resultados en las pantallas de

análisis (por ejemplo, en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación), QC

Summary (Resumen QC), etc.)

Acerca del

experimento de

ejemplo

Para el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, utilice el archivo de datos que

se instala con el software StepOne. Este archivo de datos se ha creado con los mismos

parámetros de diseño que se indican en el Capítulo 2 y luego se ha procesado y analizado

en un instrumento StepOne™.

Encontrará el archivo de datos del experimento de ejemplo en su ordenador:

<unidad>:\Applied Biosystems\StepOne System\experiments\examples

donde <unidad> es la unidad del disco duro del ordenador en la que está instalado el

software StepOne. La unidad de instalación predeterminada del software es la unidad C.

Análisis del

experimento de

ejemplo

1. Si aún no se está ejecutando el software StepOne, haga doble clic en (acceso

directo al software StepOne) o seleccione Start (Inicio)All Programs (Todos los

programas)Applied BiosystemsStepOneStepOne v2.0.

2. En la pantalla Home (Inicio), haga clic en Open (Abrir).

3. En el cuadro de diálogo Open (Abrir), desplácese hasta la carpeta examples

(ejemplos).

4. Haga doble clic en Relative Standard Curve Example (Ejemplo de curva estándar

relativa) para abrir el archivo de datos del experimento de ejemplo.

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Análisis del experimento

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

5. Haga clic en Analyze (Analizar). El software analiza los datos utilizando las

opciones de análisis predeterminadas.

6. Consulte “Elementos del software” más adelante y “Consejos de desplazamiento”

en la página 98 para obtener información acerca de cómo desplazarse por las

pantallas de análisis.

Directrices Cuando analice su propio experimento de curva estándar relativa:

• Inmediatamente después de una reacción, el software StepOne analiza

automáticamente los datos utilizando las opciones de análisis predeterminadas y, a

continuación, muestra la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) en

el ordenador.

• Para volver a analizar los datos, seleccione todos los pocillos de la disposición de la

placa y, a continuación, haga clic en Analyze (Analizar).

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Análisis del experimento

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Elementos del

software

A continuación, se ilustran los elementos del software StepOne de las pantallas de

análisis.

1. Barra de menús: muestra los menús disponibles en el software:

• File (Archivo)

• Edit (Edición)

• Instrument (Instrumento)

• Analysis (Análisis)

• Tools (Herramientas)

• Help (Ayuda)

2. Barra de herramientas: muestra las herramientas disponibles en el software:

• New Experiment (Experimento nuevo)

• Open (Abrir)

• Save (Guardar)

• Close (Cerrar)

• Send Experiment to Instrument (Enviar experimento al instrumento)

• Download Experiment from Instrument (Descargar experimento del

instrumento)

• Export (Exportar)

• Print Report (Imprimir informe)

3. Cabecera del experimento: indica el nombre del experimento, el tipo de experimento

y los reactivos del experimento abierto.

4. Panel de menús del experimento: incluye vínculos a las siguientes pantallas del

software:

• Pantallas de configuración

• Pantallas del perfil de reacción

• Pantallas de análisis:

–Amplification Plot (Gráfica de amplificación)

–Standard Curve (Curva estándar)

–Gene Expression (Expresión génica)

–Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente)

–Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos)

–QC Summary (Resumen QC)

–Multiple Plots View (Vista de múltiples gráficas)

5. Panel de gráficas: muestra la pantalla de análisis seleccionada para el experimento

abierto.

6. Fichas de visualización: muestra la disposición de la placa o la tabla de pocillos del

experimento abierto.

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Análisis del experimento

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

7. Fichas del experimento: muestra una ficha por cada experimento abierto.

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Análisis del experimento

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Consejos de

desplazamiento

Cómo seleccionar pocillos

Para ver pocillos específicos en las pantallas de análisis, seleccione los pocillos en la

ficha View Plate Layout (Ver disposición de placa) de la siguiente manera:

1. Para seleccionar pocillos de un tipo específico, utilice los menús desplegables Select

Wells With (Seleccionar pocillos con): seleccione Sample (Muestra), Target

(Diana) o Task (Tarea) y, a continuación, seleccione el nombre de la muestra, el gen

diana o la tarea.

2. Para seleccionar un solo pocillo, haga clic en él en la disposición de la placa.

3. Para seleccionar varios pocillos, haga clic y arrastre el ratón por encima de los

pocillos deseados, pulse CTRL+clic, o pulse Mayús+clic en la disposición de la

placa.

4. Para seleccionar los 48 pocillos, haga clic en la esquina superior izquierda de la

disposición de la placa.

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Análisis del experimento

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Cómo ver múltiples gráficas

Utilice la vista Multiple Plots (Múltiples gráficas) para ver simultáneamente hasta cuatro

gráficas. Para desplazarse por la vista Multiple Plots (Múltiples gráficas):

1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis

(Análisis) Multiple Plots View (Vista de múltiples gráficas).

2. Para ver cuatro gráficas, haga clic en Show plots in a 2 ✕2 matrix (Mostrar

gráficas en una matriz de 2 X 2).

3. Para ver dos gráficas en filas, haga clic en Show plots in two rows (Ver gráficas

en dos filas).

4. Para ver dos gráficas en columnas, haga clic en Show plots in two columns

(Ver gráficas en dos columnas).

5. Para ver una gráfica específica, seleccione la gráfica en el menú desplegable situado

encima de la visualización de cada gráfica.

2 35

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Visualización de la curva estándar

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

100

Notas

Visualización de la curva estándar

La pantalla Standard Curve (Curva estándar) muestra la curva estándar de las muestras

designadas como estándares. El software StepOne calcula la cantidad de un gen diana

desconocido a partir de la curva estándar.

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, se pueden revisar los siguientes

valores en la pantalla Standard Curve (Curva estándar):

• Pendiente/eficiencia de amplificación

•Valor R

2 (coeficiente de correlación)

•Valores C

Visualización de

la curva estándar

1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis

(Análisis) Standard Curve (Curva estándar).

Nota: Si en la pantalla Standard Curve (Curva estándar) no aparece ningún dato,

haga clic en Analyze (Analizar).

2. Para ver los 48 pocillos en la pantalla Standard Curve (Curva estándar), haga clic en

la esquina superior izquierda de la disposición de la placa en la ficha View Plate

Layout (Ver disposición de placa).

3. En el menú desplegable Target (Diana), seleccione All (Todas).

4. En el menú desplegable Plot Color (Color de gráfica), seleccione Default

(Predeterminado).

5. Haga clic en Show/Hide the plot legend (Mostrar/ocultar la leyenda de la

gráfica).

6. Observe los valores que se muestran bajo la curva estándar. En el experimento de

ejemplo, los valores de cada gen diana se encuentran en los rangos aceptables:

7. Compruebe si todas las muestras están dentro del rango de la curva estándar. En el

experimento de ejemplo, todas las muestras (puntos azules) están dentro de la curva

estándar (puntos rojos).

Diana Pendiente Valor R2

Eficiencia de

amplificación

(Eff%)

GAPDH −3,438 1 95,363

c-myc −3,236 0,995 103,729

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Visualización de la curva estándar

101

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

8. Compruebe los valores CT:

a. Haga clic en la ficha View Well Table (Ver tabla de pocillos).

b. En el menú desplegable Group By (Agrupar por), seleccione Replicate

(Réplica).

c. Fíjese en los valores de la columna CT

. En el experimento de ejemplo, los

valores CT están dentro del rango esperado (>8 y <35).

Nota: Los valores CT de los pocillos D7, D8 y E1 son >35 debido a la poca

cantidad de gen diana. No es necesario omitir los pocillos del análisis.

3 4

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Visualización de la curva estándar

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

102

Notas

Directrices de

análisis

Cuando analice su propio experimento de curva estándar relativa, busque:

•Valores de pendiente/eficiencia de amplificación: la eficiencia de la

amplificación se calcula utilizando la pendiente de la línea de regresión de la curva

estándar. Una pendiente próxima al −3,3 indica una eficiencia de amplificación de

la PCR óptima, es decir, del 100%. Factores que afectan a la eficiencia de la

amplificación:

– Rango de cantidades estándar: para obtener medidas de la eficiencia más exactas,

utilice un amplio rango de cantidades estándar, de 5 a 6 órdenes de magnitud.

– Número de réplicas estándar: para obtener mediciones más precisas de la

eficiencia, incluya réplicas para reducir los efectos de las imprecisiones del

pipeteo.

– Apantalladores de la PCR: los apantalladores de la PCR de la reacción pueden

reducir la eficiencia de la amplificación.

•Val ores R2 (coeficiente de correlación): el valor R2 mide cuánto se ajusta la línea

de regresión a los puntos de CT del estándar. El valor 1,00 indica un ajuste perfecto

entre la línea de regresión y los puntos de datos. Es deseable que el valor R2sea

>0,99.

•Val ores CT: el ciclo umbral (CT) es el número de ciclo de PCR en el que la curva de

amplificación corta el umbral. Es deseable que el valor CT sea >8 y <35. Si el valor

CT es <8, eso indica que en la reacción hay demasiado molde. Si el valor CT es >35,

eso indica que en la reacción hay poca cantidad de molde. Cuando los valores CT

son >35, es de esperar que haya una desviación estándar mayor.

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Revisión de la gráfica de amplificación

103

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Si el experimento no cumple las directrices anteriores, solucione los problemas de la

siguiente forma:

• Omita pocillos (consulte “Omisión de pocillos para el análisis” en la página 118).

• Vuelva a realizar el experimento.

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de:

• La pantalla Standard Curve (Curva estándar), acceda a la ayuda del software

StepOne haciendo clic en o pulsando F1.

• La eficiencia de la amplificación, consulte Amplification Efficiency of TaqMan®

Gene Expression Assays Application Note.

Revisión de la gráfica de amplificación

En la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación), se muestra la amplificación

de todas las muestras de los pocillos seleccionados. Hay disponibles tres gráficas:

•∆Rn vs Cycle (∆Rn vs ciclo): ∆Rn es la variación de la señal de fluorescencia

normalizada generada en cada ciclo de la reacción de PCR y son los datos a partir de

los cuales se calcula CT

. En esta gráfica, ∆Rn se muestra en función del número de

ciclo. La gráfica sirve para identificar y examinar las amplificaciones irregulares y

para ver los valores del umbral y línea basal de la reacción.

•Rn vs Cycle (Rn vs ciclo): Rn es la fluorescencia de fluorocromo del notificador

normalizada. En esta gráfica, Rn se representa en función del número de ciclo. La

gráfica sirve para identificar y examinar las amplificaciones irregulares.

•CT vs Well (CT vs pocillo): el ciclo umbral (CT) es el número de ciclo de PCR en el

cual el nivel de fluorescencia corta el umbral. En esta gráfica, CT se representa en

función de la posición del pocillo. La gráfica sirve para localizar amplificaciones

con valores atípicos.

Cada gráfica se puede ver de las siguientes formas: lineal o log10.

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, hay que revisar cada gen diana

en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) para buscar:

• Valores de umbral y línea basal correctos

• Valores atípicos

Revisión de la

gráfica de

amplificación

1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis

(Análisis) Amplification Plot (Gráfica de amplificación).

Nota: Si en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) no aparece

ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar).

2. Observe los pocillos de GAPDH en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de

amplificación):

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Revisión de la gráfica de amplificación

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

104

Notas

a. Haga clic en la ficha View Plate Layout (Ver disposición de placa).

b. En los menús desplegables Select Wells With (Seleccionar pocillos con),

seleccione Target (Diana) y, a continuación, GAPDH.

3. En la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación):

a. En el menú desplegable Plot Type (Tipo de gráfica), seleccione ∆Rn vs Cycle

(∆Rn vs ciclo).

b. En el menú desplegable Color Plot By (Colorear gráfica por), seleccione Well

(Pocillo).

c. Haga clic en Show/Hide the plot legend (Mostrar/ocultar la leyenda de la

gráfica).

4. Observe los valores de la línea basal:

a. En el menú desplegable Graph Type (Tipo de gráfica), seleccione Linear

(Lineal).

b. Active la casilla de verificación Baseline (Línea basal) para ver los ciclos

inicial y final de la línea basal.

c. Compruebe que la línea basal está ajustada correctamente. En el experimento

del ejemplo, la línea basal termina antes de que se inicie la amplificación.

2a 2b

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Revisión de la gráfica de amplificación

105

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

5. Observe los valores de umbral:

a. En el menú desplegable Graph Type (Tipo de gráfica), seleccione Log

(Registro).

b. En el menú desplegable Target (Diana), seleccione GAPDH.

c. Active la casilla de verificación Threshold (Umbral) para ver el umbral.

d. Compruebe que el umbral está situado correctamente. En el experimento de

ejemplo, el umbral está en la fase exponencial.

3a 4a 3b

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Revisión de la gráfica de amplificación

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

106

Notas

6. Busque cualquier valor atípico:

a. En el menú desplegable Plot Type (Tipo de gráfica), seleccione CT vs Well (CT

vs pocillo).

b. Busque pocillos fuera de la curva de amplificación. En el experimento de

ejemplo, no hay ningún valor atípico para GAPDH.

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Revisión de la gráfica de amplificación

107

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

7. Repita los pasos 2 a 6 para los pocillos de c-myc. En el experimento de ejemplo, hay

un valor atípico para el gen c-myc (pocillo D1). Omitirá este pocillo en la sección de

solución de problemas (“Omisión de pocillos para el análisis” en la página 118).

Directrices de

análisis

Cuando analice su propio experimento de curva estándar relativa, busque:

• Los valores de línea basal y umbral correctos: el software StepOne calcula

automáticamente los valores de línea basal y umbral dando por hecho que los datos

tienen una gráfica de amplificación típica. Una gráfica de amplificación típica

tiene:

a. Una fase de meseta o plateau

b. Una fase lineal

c. Una fase exponencial (geométrica)

d. Un determinado ruido de fondo

e. Una línea basal

¡IMPORTANTE! Los errores en el experimento (por ejemplo, errores de

contaminación o pipeteo) pueden producir curvas de amplificación atípicas que

pueden derivar a cálculos incorrectos de los valores de línea basal y umbral por

parte del software StepOne. Por lo tanto, Applied Biosystems recomienda examinar

la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) y revisar los valores de

línea basal y umbral asignados a cada pocillo después del análisis.

• Valores atípicos

Si el experimento no cumple las directrices anteriores, solucione los problemas de la

siguiente forma:

• Ajuste manualmente la línea basal y/o el umbral (consulte “Revisión de las opciones

de análisis” en la página 114).

• Omita pocillos (consulte “Omisión de pocillos para el análisis” en la página 118).

Ciclo

∆Rn

Umbral

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

108

Notas

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de la pantalla Amplification Plot (Gráfica de

amplificación), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando

F1.

Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de

pocillos

La pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica) muestra los resultados

de los cálculos de cuantificación relativa a través del perfil de expresión génica. Hay

disponibles dos gráficas:

•RQ vs Target (Cuantificación relativa vs diana): agrupa los valores de

cuantificación relativa (RQ) por diana. Se traza cada muestra para cada gen diana.

•RQ vs Sample (Cuantificación relativa vs muestra): agrupa los valores de

cuantificación relativa (RQ) por muestra. Se traza cada gen diana para cada muestra.

Cada gráfica se puede ver de las siguientes formas: lineal, log10, Ln, log2.

En la tabla de pocillos, se muestran datos de cada pocillo de la placa de reacción,

incluidos:

• El nombre de la muestra, el nombre de el gen diana, la tarea y los fluorocromos

• El ciclo umbral calculado (CT), la fluorescencia normalizada (Rn) y los valores de

cantidades

•Avisos

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, se revisa:

• Para cada gen diana de la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión

génica) para el nivel de expresión (o cambio en número de veces de la expresión) de

la muestra de gen diana en relación con la muestra de referencia.

• La tabla de pocillos para evaluar la precisión de los grupos de réplicas.

Revisión de la

gráfica de

expresión génica

y la tabla de

pocillos

1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis

(Análisis) Gene Expression (Expresión génica).

Nota: Si en la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica) no

aparece ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar).

2. En la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica):

a. En el menú desplegable Plot Type (Tipo de gráfica), seleccione RQ vs Sample

(Cuantificación relativa vs Muestra).

b. En el menú desplegable Graph Type (Tipo de gráfica), seleccione Log10.

c. En el menú desplegable Orientation (Orientación), seleccione Ve r t i c a l B a rs

(Barras verticales).

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos

109

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

d. Haga clic en Show/Hide the plot legend (Mostrar/ocultar la leyenda de la

gráfica).

En el experimento de ejemplo, se muestra el nivel de expresión de c-myc en el

hígado en relación con su nivel de expresión en la muestra de referencia (riñón).

Dado que la muestra de referencia se compara consigo misma, el nivel de expresión

es 1. Si el resultado se muestra en el tipo de gráfico Log10, el nivel de expresión de

la muestra de referencia aparece como 0 en el gráfico (log10 de 1=0).

3. Revise la tabla de pocillos:

a. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis

(Análisis) Amplification Plot (Gráfica de amplificación) y, a

continuación, seleccione la ficha View Well Table (Ver tabla de pocillos).

b. En el menú desplegable Group By (Agrupar por), seleccione Replicate

(Réplica).

c. Fíjese en la columna CT SD para evaluar la precisión de los grupos de réplicas.

En el experimento de ejemplo, hay un valor atípico (pocillo D1). Este pocillo se

omite en la sección de solución de problemas (“Omisión de pocillos para el

análisis” en la página 118).

2a 2b 2c

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

110

Notas

Nota: Para mostrar u ocultar columnas en la tabla de pocillos, marque/desmarque el

nombre de columna en el menú desplegable Show in Table (Mostrar en tabla).

Directrices de

análisis

Cuando analice su propio experimento de curva estándar relativa, busque:

• Diferencias en la expresión génica (como un cambio en número de veces de la

expresión) en relación con la muestra de referencia.

• Desviación estándar en los grupos de réplicas (valores CT SD). Si es preciso, omita

los valores atípicos (“Omisión de pocillos para el análisis” en la página 118).

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de

expresión génica) o la tabla de pocillos, acceda a la ayuda del software StepOne haciendo

clic en o pulsando F1.

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Presentación de los datos

111

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Presentación de los datos

Hay distintas formas de presentar los datos del experimento:

• Guardando la gráfica como un archivo de imagen

• Imprimiendo la gráfica

• Imprimiendo la disposición de la placa

• Creando diapositivas

• Imprimiendo un informe

• Exportando datos

Para obtener más información acerca de estos procedimientos, acceda a la ayuda del

software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Presentación de los datos

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

112

Notas

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Sección 5.2 Solución de problemas

113

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Sección 5.2 Solución de problemas

Esta sección cubre los siguientes temas:

■Revisión de las opciones de análisis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114

■Revisión del resumen QC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116

■Omisión de pocillos para el análisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118

■Revisión de la gráfica multicomponente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120

■Revisión de la gráfica de datos brutos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Revisión de las opciones de análisis

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

114

Notas

Revisión de las opciones de análisis

El cuadro de diálogo Analysis Settings (Opciones de análisis) muestra las opciones de

análisis del ciclo umbral (CT), los avisos, la cuantificación relativa y las opciones

avanzadas. Si las opciones de análisis predeterminadas del software StepOne no son

adecuadas para el experimento, puede cambiarlas en el cuadro de diálogo Analysis

Settings (Opciones de análisis) y, a continuación, volver a analizar el experimento.

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, se utilizan las opciones de

análisis predeterminadas sin ningún cambio.

Revisión de las

opciones de

análisis

1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis

(Análisis).

2. Haga clic en Analysis Settings (Opciones de análisis) para abrir el cuadro de

diálogo Analysis Settings (Opciones de análisis).

3. En el experimento de ejemplo, se utilizan opciones de análisis para cada ficha:

•C

T Settings (Opciones de CT)

• Flag Settings (Opciones de avisos)

• Relative Quantification Settings (Opciones de cuantificación relativa)

• Advanced Settings (Opciones avanzadas)

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Revisión de las opciones de análisis

115

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Directrices de

análisis

A menos que ya haya determinado cuál son las opciones óptimas para el experimento,

utilice las opciones de análisis predeterminadas en el software StepOne. Si las opciones

predeterminadas no son adecuadas para el experimento, puede cambiar:

•CT Settings (Opciones de CT): utilice esta ficha para ajustar manualmente el umbral

y la línea basal. Si ajusta manualmente el umbral y la línea basal, Applied

Biosystems recomienda lo siguiente:

•Flag Settings (Opciones de avisos): utilice esta ficha para:

– Ajustar la sensibilidad para que se marquen más o menos pocillos.

– Cambiar los parámetros de los avisos que aplica el software StepOne.

•Relative Quantitation Settings (Opciones de cuantificación relativa): utilice esta

ficha para:

– Cambiar la muestra de referencia y/o el control endógeno.

– Seleccionar el algoritmo que se debe utilizar para determinar los valores mínimos

y máximos de RQ (nivel de confianza o desviaciones estándar).

•Advanced Settings (Opciones avanzadas): utilice esta ficha para cambiar las

opciones de línea basal pocillo a pocillo.

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de las opciones de análisis, acceda al software

StepOne pulsando F1 cuando se abra el cuadro de diálogo Analysis Settings (Opciones

de análisis).

Opción Recomendación

Umbral Introduzca un valor para el umbral de manera que:

• Esté por encima del ruido de fondo.

• Esté por debajo de las fases de meseta o plateau y fase lineal de

la curva de amplificación.

• Esté dentro de la fase exponencial de la curva de amplificación.

Línea basal Seleccione los valores Start Cycle (Ciclo inicial) y End Cycle (Ciclo

final) antes de que comience la amplificación.

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Revisión del resumen QC

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

116

Notas

Revisión del resumen QC

La pantalla QC Summary (Resumen QC) muestra una lista de avisos del software

StepOne, e incluye la frecuencia y ubicación de los mismos en el experimento abierto.

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, hay que revisar la pantalla QC

Summary (Resumen QC) para saber si los datos del experimento han desencadenado

algún aviso:

• Los pocillos D7, D8 y E1 han producido datos que han desencadenado el aviso

HIGHSD.

• El pocillo D1 ha producido datos que han desencadenado el aviso OUTLIERRG.

Revisión del

resumen QC

1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis

(Análisis) QC Summary (Resumen QC).

Nota: Si en la pantalla QC Summary (Resumen QC) no aparece ningún dato, haga

clic en Analyze (Analizar).

2. Revise el resumen de avisos. En el experimento de ejemplo, hay 4 pocillos

marcados.

3. En la tabla Flag Details (Detalles de aviso), observe las columnas Frequency

(Frecuencia) y Wells (Pocillos) para determinar qué avisos aparecen en el

experimento. En el experimento de ejemplo:

• El aviso HIGHSD aparece 3 veces, en los pocillos D7, D8 y E1.

• El aviso OUTLIERRG aparece 1 vez en el pocillo D1.

Nota: Un valor 0 en la columna Frequency (Frecuencia) indica que el aviso no

aparece en el experimento.

4. Por cada aviso que aparezca en el experimento, haga clic en la fila de avisos para ver

información detallada acerca del aviso. En el experimento de ejemplo:

a. El aviso HIGHSD (pocillos D7, D8 y E1) indica una gran desviación estándar

en el grupo de réplicas. Esto es lo esperado para los valores CT >35 debido a la

poca cantidad de gen diana. No es necesario omitir los pocillos del análisis.

b. El aviso OUTLIERRG (pocillo D1) indica que en el grupo de réplicas hay un

valor atípico. Vaya a “Omisión de pocillos para el análisis” en la página 118

para quitar el pocillo D1.

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Revisión del resumen QC

117

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Posibles avisos En los experimentos de curva estándar relativa, los datos del experimento pueden

desencadenar los avisos que se indican a continuación.

Si en el experimento no aparece un aviso, su frecuencia será 0. Si la frecuencia es >0, eso

significa que el aviso aparece en algún lugar del experimento. La posición del pocillo se

indica en la columna Wells (Pocillos).

Aviso Descripción

AMPNC Amplificación en control negativo

BADROX Señal de referencia pasiva incorrecta

BLFAIL Error del algoritmo de línea basal

CTFAIL Error del algoritmo CT

EXPFAIL Error del algoritmo exponencial

HIGHSD Desviación estándar alta en el grupo de réplicas

NOAMP No hay amplificación

NOISE Ruido mayor que otros pocillos en la placa

NOSIGNAL No hay señal en el pocillo

OFFSCALE La fluorescencia está fuera de la escala

OUTLIERRG Valor atípico en el grupo de réplicas

SPIKE Picos de ruido

THOLDFAIL Error en el algoritmo del umbral

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Omisión de pocillos para el análisis

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

118

Notas

Directrices de

análisis

Cuando analice su propio experimento de curva estándar relativa:

• Haga clic en cada aviso de la tabla Flag Details (Detalles de avisos) con una

frecuencia >0 para ver información detallada acerca del aviso. Si es necesario, haga

clic en el vínculo de solución de problemas para saber cómo corregir el aviso.

• Puede cambiar las opciones de los avisos:

– Ajustar la sensibilidad para que se marquen más o menos pocillos.

– Cambiar los parámetros de los avisos que aplica el software StepOne.

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de la pantalla QC Summary (Resumen QC) o de las

opciones de avisos, acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o

pulsando F1.

Omisión de pocillos para el análisis

Los errores de los experimentos pueden causar que algunos pocillos se amplifiquen de

manera insuficiente o no se amplifiquen. Estos pocillos suelen producir valores CT que

difieren significativamente de los valores medios de los pocillos de réplicas asociadas. Si

se incluyen en los cálculos, estos valores atípicos pueden dar lugar a mediciones

erróneas; para garantizar la precisión, omita los valores atípicos del análisis.

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, se utiliza la tabla de pocillos

para quitar el pocillo D1 del análisis. El pocillo D1 está marcado con el aviso

OUTLIERRG (consulte “Revisión del resumen QC” en la página 116).

Omisión de

pocillos

1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis

(Análisis) Amplification Plot (Gráfica de amplificación).

Nota: Si en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) no aparece

ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar).

2. En la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación), seleccione CT vs Well

(CT vs pocillo) en el menú desplegable Plot Type (Tipo de gráfica).

3. Seleccione la ficha View Well Table (Ver tabla de pocillos).

4. En la tabla de pocillos:

a. En el menú desplegable Group By (Agrupar por), seleccione Replicate

(Réplica).

b. Fíjese si en el grupo de réplicas hay algún valor atípico (asegúrese de que están

marcados con un aviso). En el experimento de ejemplo, el pocillo D1 es un

valor atípico.

c. Active la casilla de verificación Omit (Omitir) junto al pocillo D1.

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Omisión de pocillos para el análisis

119

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

5. Haga clic en Analyze (Analizar) para volver a analizar los datos del experimento sin

el pocillo D1.

Directrices de

análisis

Cuando analice su propio experimento de curva estándar relativa, fíjese bien si en los

grupos de réplicas hay valores atípicos. Si es necesario, quite manualmente los valores

atípicos con la tabla de pocillos. Siga el procedimiento “Omisión de pocillos” anterior

para quitar los valores atípicos del experimento.

Pocillo

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Revisión de la gráfica multicomponente

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

120

Notas

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de la omisión de pocillos para el análisis, acceda a

la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. En la ayuda, busque

los temas relacionados con la omisión de pocillos:

1. Haga clic en la ficha Search (Buscar).

2. Escriba omit well (omisión de pocillos).

3. Haga clic en List Topics (Ver temas).

4. Haga doble clic en los temas que desee leer.

Revisión de la gráfica multicomponente

La pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente) muestra la contribución

espectral completa de cada fluorocromo de un pocillo seleccionado durante el tiempo que

dura el proceso de PCR.

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, en la pantalla Multicomponent

Plot (Gráfica multicomponente) hay que fijarse en:

•Fluorocromo ROX

™ (referencia pasiva)

•Fluorocromo FAM

™ (notificador)

• Picos, depresiones y/o cambios repentinos

• Amplificación en pocillos de control negativo

Revisión de la

gráfica

multicomponente

1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis

(Análisis) Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente).

Nota: Si en la pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente) no aparece

ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar).

2. Muestre un solo pocillo a la vez en la pantalla Multicomponente Plot (Gráfica

multicomponente):

a. Haga clic en la ficha View Plate Layout (Ver disposición de placa).

b. Seleccione un pocillo en la disposición de la placa; el pocillo se muestra en la

pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente).

3. En el menú desplegable Plot Color (Color de gráfica), seleccione Dye

(Fluorocromo).

4. Haga clic en Show/Hide the plot legend (Mostrar/ocultar la leyenda de la

gráfica).

5. Compruebe la señal del fluorocromo FAM. En el experimento de ejemplo, la señal

del fluorocromo FAM aumenta a lo largo de la reacción de PCR, lo que indica que la

amplificación es normal.

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Revisión de la gráfica multicomponente

121

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

6. Compruebe la señal del fluorocromo ROX. En el experimento de ejemplo, la señal

del fluorocromo ROX permanece constante a lo largo de la reacción de PCR, lo que

indica que los datos son típicos.

7. Seleccione de uno en uno los pocillos de control negativo y compruebe la

amplificación. En el experimento de ejemplo, no hay amplificación en los pocillos

de control negativo.

32a4

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Revisión de la gráfica de datos brutos

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

122

Notas

Directrices de

análisis

Cuando analice su propio experimento de curva estándar relativa, busque:

• Referencia pasiva: el nivel de fluorescencia del fluorocromo de referencia pasiva

debe permanecer relativamente constante a lo largo de la reacción de PCR.

• Fluorocromo del notificador: el nivel de fluorescencia del fluorocromo del

notificador debería presentar una región plana que se corresponde con la línea basal,

seguida por un rápido aumento en la fluorescencia a medida que la amplificación

continúa.

• Cualquier irregularidad de la señal: no debería haber ningún pico, depresión ni

cambio súbito en la señal fluorescente.

• Pocillos de control negativo: no debería haber ninguna amplificación en los pocillos

de control negativo.

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de la pantalla Multicomponent Plot (Gráfica

multicomponente), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o

pulsando F1.

Revisión de la gráfica de datos brutos

En la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos), se muestra la señal de

fluorescencia bruta (no normalizada) para cada filtro óptico de los pocillos seleccionados

durante cada ciclo de la PCR a tiempo real.

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, hay que revisar la pantalla Raw

Data Plot (Gráfica de datos brutos) para comprobar si hay un aumento estable de la señal

(que no hay ninguna depresión ni cambio abrupto) a partir del filtro apropiado.

Revisión de la

gráfica de datos

brutos

1. En el panel Experiment Menu (Menú de experimento), seleccione Analysis

(Análisis) Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos).

Nota: Si en la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos) no aparece ningún

dato, haga clic en Analyze (Analizar).

2. Para ver los 48 pocillos en la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos), haga

clic en la esquina superior izquierda de la disposición de la placa en la ficha View

Plate Layout (Ver disposición de placa).

3. Haga clic en Show/Hide the plot legend (Mostrar/ocultar la leyenda de la

gráfica).

4. Haga clic y arrastre el puntero Show Cycle (Mostrar ciclo) desde el ciclo 1 al 40. En

el experimento de ejemplo, hay un aumento estable en la señal desde el filtro 1, que

se corresponde con el filtro del fluorocromo FAM™.

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Revisión de la gráfica de datos brutos

123

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Los filtros del sistema StepOne™ son:

Directrices de

análisis

Cuando analice su propio experimento de curva estándar relativa, fíjese en lo siguiente

para cada filtro:

• Crecimiento característico de la señal

• Depresiones o cambios abruptos

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos

brutos), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.

Filtro Fluorocromo

1 Fluorocromo FAM™

Fluorocromo SYBR®

Green

2 Fluorocromo JOE™

Fluorocromo VIC®

3 Fluorocromo™ROX

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa

Revisión de la gráfica de datos brutos

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

124

Notas

Capítulo 6

125

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Diseño del experimento de C

comparativos

Este capítulo cubre los siguientes temas:

■Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126

■Creación de un nuevo experimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127

■Definición de las propiedades del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129

■Definición de los métodos y materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131

■Configuración de los genes diana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135

■Configuración de las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137

■Configuración de las opciones de cuantificación relativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140

■Configuración del protocolo de termociclado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141

■Revisión de la configuración de la reacción. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142

■Solicitud de materiales para el experimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148

■Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152

Nota: Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en

esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR

System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o

seleccionando Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne).

Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos

Resumen del capítulo

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

126

Notas

Resumen del capítulo

En este capítulo, se explica cómo utilizar el asistente de diseño en el software StepOne™

para configurar el experimento de CT comparativos (∆∆CT). El asistente de diseño le

guiará por los procedimientos óptimos recomendados por Applied Biosystems a medida

que vaya introduciendo los parámetros de diseño del experimento de ejemplo.

Flujo de trabajo

del experimento

de ejemplo

A continuación, se muestra el flujo de trabajo para diseñar el experimento de ejemplo que

se incluye en esta guía de introducción.

Nota: Diseñe el experimento de ejemplo con el flujo de trabajo del asistente de diseño

del software StepOne. Cuando diseñe sus propios experimentos, puede seleccionar flujos

de trabajo alternativos (consulte “Uso de esta guía con sus propios experimentos” en la

página 9).

Diseño del experimento (Capítulo 6)

1. Cree un nuevo experimento.

2. Defina las propiedades del experimento.

3. Defina los métodos y los materiales.

4. Configure los genes diana.

5. Configure las muestras.

6. Configure la cuantificación relativa.

7. Configure el protocolo de termociclado.

8. Revise la configuración de la reacción.

9. Solicite materiales para el experimento.

10.Finalice el flujo de trabajo del asistente de

diseño.

Experimento de CT comparativos (∆∆CT)

Inicio del experimento



Análisis del experimento (Capítulo 9)



Preparación de las reacciones (Capítulo 7)

Realización del experimento (Capítulo 8)



Fin del experimento

Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos

Creación de un nuevo experimento

127

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Creación de un nuevo experimento

Cree un experimento nuevo con el asistente de diseño del software StepOne.

Creación de un

experimento

1. Haga doble clic en (acceso directo al software StepOne) o seleccione Start

(Inicio)All Programs (Todos los programas)Applied Biosystems

StepOneStepOne v2.0.

2. En la pantalla Home (Inicio), haga clic en Design Wizard (Asistente de

diseño) para abrir el asistente de diseño.

3. Consulte “Elementos del software” más adelante para obtener información acerca

de la navegación por el asistente de diseño.

Elementos del

software

A continuación, se ilustran los elementos del software StepOne para el asistente de

diseño.

1. Barra de menús: muestra los menús disponibles en el software:

• File (Archivo)

• Edit (Edición)

• Instrument (Instrumento)

• Analysis (Análisis)

• Tools (Herramientas)

• Help (Ayuda)

Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos

Creación de un nuevo experimento

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

128

Notas

2. Barra de herramientas: muestra las herramientas disponibles en el software:

• New Experiment (Experimento nuevo)

• Open (Abrir)

• Close (Cerrar)

• Send Experiment to Instrument (Enviar experimento al instrumento)

• Download Experiment from Instrument (Descargar experimento del

instrumento)

3. Cabecera del experimento: indica el nombre del experimento, el tipo de experimento

y los reactivos del experimento abierto.

4. Panel de navegación: ofrece enlaces a todas las pantallas del asistente de diseño:

• Experiment Properties (Propiedades del experimento)

• Methods & Materials (Métodos y materiales)

• Targets (Dianas)

• Opciones de cuantificación relativa

• Samples (Muestras)

• Run Method (Protocolo de termociclado)

• Reaction Setup (Configuración de la reacción)

• Materials List (Lista de materiales)

Nota: Inicialmente, el asistente de diseño muestra el tipo de experimento

Quantitation - Standard Curve (Cuantificación: curva estándar). Las pantallas

disponibles de este asistente pueden cambiar si se selecciona otro tipo de

experimento. Por ejemplo, la pantalla Relative Quantitation Settings (Opciones de

cuantificación relativa) no aparece hasta que se selecciona el tipo de experimento de

curva estándar o CT comparativos (∆∆CT).

Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos

Definición de las propiedades del experimento

129

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

5. Fichas del experimento: se muestra una ficha por cada experimento abierto.

Definición de las propiedades del experimento

En la pantalla Experiment Properties (Propiedades de experimento), escriba la

información de identificación del experimento y, a continuación, seleccione el tipo de

experimento que desea diseñar.

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de CT comparativos (∆∆CT) de ejemplo:

• El experimento se identifica como un ejemplo.

• Se utiliza una MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate.

• El tipo de experimento es de cuantificación.

Pantalla

Experiment

Properties

(Propiedades de

experimento)

1. Haga clic en el campo Experiment Name (Nombre de experimento) y, a

continuación, escriba Comparative CT Example (Ejemplo de CT comparativos).

Nota: La cabecera del experimento se actualiza con el nombre del experimento que

acaba de escribir.

2. Haga clic en el campo Barcode (Código de barras) y, a continuación, escriba el

código de barras en la placa de reacción de PCR.

3. Haga clic en el campo User Name (Nombre de usuario) y, a continuación, escriba

Example User (Usuario de ejemplo).

Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos

Definición de las propiedades del experimento

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

130

Notas

4. Haga clic en el campo Comments (Comentarios) y, a continuación, escriba

Comparative CT Getting Started Guide Example (Ejemplo de la guía de

introducción del CT comparativos).

5. Seleccione Quantitation (Cuantificación) en el tipo de experimento.

6. Haga clic en Next (Siguiente) >.

Directrices de

diseño

Cuando diseñe su propio experimento de CT comparativos:

• Escriba un nombre para el experimento que sea descriptivo y fácil de recordar. El

nombre del experimento se utiliza como nombre de archivo predeterminado del

experimento. Puede introducir hasta 100 caracteres en el campo Experiment Name

(Nombre de experimento).

Nota: No se pueden utilizar los siguientes caracteres en en campo Experiment

Name (Nombre de experimento): barra inclinada hacia delante (/), barra inclinada

hacia atrás (\), signo mayor que (>), signo menor que (<), asterisco (*), signo de

interrogación (?), comillas ("), línea vertical (|), dos puntos (:) o punto y coma (;).

• Utilice MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plates, MicroAmp™ Fast 8-Tube

Strips o MicroAmp® Fast Reaction Tubes with Caps. Los consumibles tipo rápido se

pueden utilizar con reactivos tipo rápido y estándar.

•(Opcional) Introduzca un código de barras para identificarlo en la placa de reacción

de PCR. Puede introducir hasta 100 caracteres en el campo Barcode (Código de

barras).

•(Opcional) Escriba un nombre de usuario para identificar al propietario del

experimento. Puede introducir hasta 100 caracteres en el campo User Name

(Nombre de usuario).

•(Opcional) Escriba comentarios para describir el experimento. Puede introducir

hasta 1000 caracteres en el campo Comments (Comentarios).

Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos

Definición de los métodos y materiales

131

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

• Seleccione Quantitation (Cuantificación) en el tipo de experimento.

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de:

• La pantalla Experiment Properties (Propiedades de experimento), acceda a la ayuda

del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.

• Consumibles, consulte “Consumibles admitidos” en la página 3.

• Experimentos de cuantificación, consulte la Guía de reactivos de Applied

Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System.

Definición de los métodos y materiales

En la pantalla Methods & Materials (Métodos y materiales), seleccione el método de

cuantificación, los reactivos, la velocidad de rampa y el tipo de molde de PCR que se van

a utilizar en el experimento.

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de CT comparativos de ejemplo:

• Se utiliza el método de cuantificación de CT comparativos.

• Se utilizan reactivos TaqMan®.

• Se utiliza la velocidad de rampa rápida en el proceso del instrumento.

• cDNA (preparado a partir de RNA total aislado de hígado, riñón y cerebro) es el tipo

de molde. Antes de utilizar el molde cDNA, primero hay que realizar una

retrotranscripción para convertir el RNA en cDNA (consulte “Preparación del

molde” en la página 157).

Pantalla Methods

& Materials

(Métodos y

materiales)

1. Seleccione Comparative CT (∆∆CT) (CT comparativos) como método de

cuantificación.

2. Seleccione ensayos TaqMan® para los reactivos.

3. Seleccione Fast (~40 minutes to complete a run) (Rápido (40 minutos

aproximadamente para completar una reacción)) para la velocidad de la rampa.

4. Seleccione cDNA (complementary DNA) (cDNA (DNA complementario)) como

tipo de molde.

5. Haga clic en Next (Siguiente) >.

Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos

Definición de los métodos y materiales

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

132

Notas

Directrices de

diseño

Cuando diseñe su propio experimento de CT comparativos:

• Seleccione Comparative CT (∆∆CT) (CT comparativos (∆∆CT) como método de

cuantificación. Los experimentos de CT comparativos (∆∆CT) determinan el cambio

de expresión de un gen diana en una muestra en relación con el mismo gen diana en

una muestra de referencia. Para obtener los resultados, se utilizan fórmulas

aritméticas. Para configurar la placa de reacción, el método de CT comparativos

requiere dianas, muestras, una muestra de referencia y un control endógeno.

Nota: Antes de utilizar el método de CT comparativos, Applied Biosystems

recomienda determinar si las eficiencias de PCR del ensayo diana y el ensayo de

control endógeno son aproximadamente iguales. Applied Biosystems TaqMan®

Gene Expression Assays y Custom TaqMan® Gene Expression Assays tienen unas

eficiencias de amplificación equivalentes del 100% (±10%).

• Seleccione los reactivos que desea utilizar:

– Seleccione ensayos TaqMan® si desea utilizar estos reactivos para detectar la

amplificación y cuantificar la cantidad de gen diana en las muestras. Los

reactivos TaqMan se componen de dos cebadores y una sonda TaqMan®. Los

cebadores están diseñados para amplificar el gen diana. La sonda TaqMan está

diseñada para hibridar en el gen diana y generar una señal de fluorescencia

cuando se amplifica el gen diana.

¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo

TAMRA™ como notificador ni apantallador con el sistema StepOne™.

– Seleccione reactivos SYBR® Green si desea utilizar estos reactivos para

detectar la amplificación y cuantificar la cantidad de gen diana en las muestras.

Los reactivos SYBR Green se componen de dos cebadores y un fluorocromo

SYBR Green. Los cebadores están diseñados para amplificar el gen diana. El

Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos

Definición de los métodos y materiales

133

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

fluorocromo SYBR Green genera una señal de fluorescencia cuando se une a

DNA de doble cadena. El fluorocromo SYBR Green suele formar parte de la

mezcla maestra SYBR Green que se añade a la reacción. Si utiliza un

fluorocromo SYBR Green:

Active la casilla de verificación Include Melt Curve (Incluir curva de

disociación) para realizar un análisis de curva de disociación de el gen diana

amplificado.

Seleccione Standard (Estándar) para la velocidad de la rampa. Applied

Biosystems no dispone de una mezcla maestra rápida para reactivos SYBR

Green.

Nota: Se pueden utilizar otros reactivos basados en fluorescencia en el sistema

StepOne; sin embargo, debe diseñar su experimento con el flujo de trabajo

Advanced Setup (Configuración avanzada) en lugar con el asistente de diseño.

Consulte “Flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada)” en la

página 206.

• Seleccione la velocidad de rampa apropiada para el proceso del instrumento:

– Seleccione Fast (~40 Minutes to Complete a Run) (Rápido (aproximadamente

40 minutos para completar una reacción)) si utiliza reactivos tipo rápido para las

reacciones de PCR.

– Seleccione Standard (~2 Hours to Complete a Run) (Estándar

(aproximadamente 2 horas para completar una reacción)) si utiliza reactivos

estándar para las reacciones de PCR (incluidos reactivos SYBR Green y reactivos

TaqMan estándar).

• Seleccione el molde de PCR apropiado:

– Seleccione cDNA (complementary DNA) (cDNA (DNA complementario)) si va

a realizar una RT-PCR de 2 pasos y ya ha realizado la retrotranscripción para

convertir el RNA en cDNA. Se añade DNA complementario a las reacciones de

PCR.

– Seleccione RNA si va a realizar una RT-PCR de 1 paso. Se añade el RNA o

mRNA total a las reacciones de PCR.

– Seleccione gDNA (genomic DNA) (gDNA (DNA genómico)) si ya ha extraído el

gDNA de un tejido o una muestra. Se añade DNA genómico purificado a las

reacciones de PCR.

Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos

Definición de los métodos y materiales

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

134

Notas

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de:

• La pantalla Methods & Materials (Métodos y materiales), acceda a la ayuda del

software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.

• La determinación de las eficiencias de PCR, acceda a la ayuda del software StepOne

haciendo clic en o pulsando F1. En la ayuda, realice la búsqueda de la siguiente

manera:

a. Haga clic en la ficha Search (Buscar).

b. Escriba PCR efficiency (Eficiencia de PCR).

c. Haga clic en List Topics (Ver temas).

d. Haga doble clic en Determine PCR Efficiency (Determinar la eficiencia de la

PCR).

• Si utiliza el método de cuantificación de curva estándar relativa, consulte los

capítulos 2 - 5 de esta guía.

• El uso del método de cuantificación de curva estándar, consulte la Guía de

introducción a StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de curva

estándar.

• Los reactivos TaqMan y SYBR Green, consulte la Guía de reactivos de Applied

Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System.

• La PCR, incluida la PCR en singleplex y en multiplex, y la RT PCR de 1 y de 2

pasos, consulte la Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time

PCR System.

Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos

Configuración de los genes diana

135

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Configuración de los genes diana

En la pantalla Targets (Dianas), escriba el número de genes diana que desea cuantificar

en la placa de reacción de PCR y, a continuación, configure el ensayo para cada gen

diana.

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de CT comparativos de ejemplo:

• Se cuantifican dos dianas en la placa de reacción.

• El ensayo Target 1 (Diana 1) está configurado para el gen diana que se está

estudiando. En el experimento de ejemplo, es TP53 (un factor de transcripción que

regula otros genes).

• El ensayo Target 2 (Diana 2) se configura para el control endógeno. Para el

experimento de ejemplo, se trata de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa

(GAPDH) humano. El GAPDH se utiliza como control endógeno, porque sus

niveles de expresión suelen ser relativamente estables.

Pantalla Targets

(Dianas)

1. Haga clic en el campo How many targets do you want to quantify in the reaction

plate? (¿Cuántas dianas desea cuantificar en la placa de reacción?) y, a

continuación, escriba 2.

Nota: El número de filas de la tabla de ensayos diana se actualiza con el número

que escriba.

2. Configure el ensayo Target 1 (Diana 1):

a. Haga clic en la celda Enter Target Name (Escribir nombre de gen diana) y, a

continuación, escriba TP53.

b. En el menú desplegable Reporter (Notificador), seleccione FAM

(predeterminado).

c. En el menú desplegable Quencher (Apantallador), seleccione NFQ-MGB

(predeterminado).

d. Deje la opción predeterminada en el campo Color.

3. Configure el ensayo Target 2 (Diana 2):

a. Haga clic en la celda Enter Target Name (Escribir nombre de gen diana) y, a

continuación, escriba GAPDH.

b. En el menú desplegable Reporter (Notificador), seleccione FAM

(predeterminado).

c. En el menú desplegable Quencher (Apantallador), seleccione NFQ-MGB

(predeterminado).

d. Deje la opción predeterminada en el campo Color.

Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos

Configuración de los genes diana

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

136

Notas

4. Haga clic en Next (Siguiente) >.

Nota: En todos los genes diana, deje en blanco el campo (Optional) Enter Gene Name

((Opcional) Escriba el nombre del gen). Puede buscar el identificador del gen/ensayo

para solicitar los materiales (consulte “Solicitud de materiales para el experimento” en la

página 148).

Directrices de

diseño

Cuando diseñe su propio experimento de CT comparativos:

• Identifique cada ensayo diana con un nombre y un color únicos. Puede introducir

hasta 100 caracteres en el campo Target Name (Nombre de gen diana).

• Seleccione un control endógeno para cada muestra. El control endógeno es un gen

diana que está presente en todas las muestras que se están investigando. Se debería

expresar por igual en todos los tipos de muestras, con independencia del tratamiento

o el origen del tejido (ejemplos de controles endógenos: β-actina, GAPDH y RNA

ribosomal 18S [rRNA 18S]). El control endógeno se utiliza para normalizar los

resultados de la PCR; el control endógeno corrige la cantidad de molde, la

eficiencia de extracción del ácido nucleico, la eficiencia de la retrotranscripción y

los errores de calibración de las pipetas. Tenga en cuenta que:

– Cada tipo de muestra (por ejemplo, cada tejido de un estudio en el que se

comparan múltiples tejidos) requiere un control endógeno.

– Si las muestras están distribuidas en múltiples placas, cada placa debe tener un

control endógeno. Asimismo, cada placa debe incluir un control endógeno para

cada tipo de muestra de la placa.

• Seleccione el fluorocromo del notificador utilizado en el ensayo diana:

– Seleccione FAM si el fluorocromo FAM™ está unido al extremo de 5′ de la sonda

TaqMan que se utiliza para detectar el gen diana.

Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos

Configuración de las muestras

137

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

– Seleccione JOE si el fluorocromo JOE™ está unido al extremo de 5′ de la sonda

TaqMan que se utiliza para detectar el gen diana.

– Seleccione VIC si el fluorocromo VIC® está unido al extremo de 5′ de la sonda

TaqMan que se utiliza para detectar el gen diana.

– Seleccione SYBR si utiliza fluorocromo SYBR® Green para detectar DNA de

doble cadena.

• Seleccione el apantallador utilizado en el ensayo diana:

– Seleccione NFQ-MGB si a la sonda TaqMan de 3′ que está utilizando para

detectar el gen diana hay unido un apantallador no fluorescente de unión al surco

menor de la doble cadena de DNA.

– Seleccione None (Ninguno) si se utiliza fluorocromo SYBR Green.

¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo

TAMRA™ como notificador ni apantallador con el sistema StepOne™.

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de:

• La pantalla Targets (Dianas) , acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic

en o pulsando F1.

• La selección de un control endógeno, consulte la nota de aplicación Using TaqMan®

Endogenous Control Assays to Select an Endogenous Control for Experimental

Studies.

Configuración de las muestras

En la pantalla Samples (Muestras), escriba el número de muestras, réplicas y controles

negativos que va a incluir en la placa de reacción, escriba los nombres de las muestras y,

a continuación, seleccione las reacciones de muestra/diana que va a configurar.

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de CT comparativos de ejemplo:

• Se utilizan tres muestras: cDNA preparado a partir de RNA total aislado de hígado,

riñón y cerebro. Las muestras contienen cantidades desconocidas de TP53 (diana) y

del gen GAPDH (control endógeno).

• Se utilizan tres réplicas. Las réplicas son reacciones idénticas que contienen

componentes y volúmenes idénticos.

• Se utilizan seis controles negativos. Las reacciones de control negativo contienen

agua en lugar de la muestra y no se deberían amplificar. El software incluye

automáticamente tres controles negativos para cada ensayo diana.

Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos

Configuración de las muestras

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

138

Notas

Pantalla Samples

(Muestras)

1. Haga clic en el campo How many samples do you want to test in the reaction

plate? (Cuántas muestras desea probar en la placa de reacción?) y, a continuación,

escriba 3.

Nota: El número de filas de la tabla de las muestras se actualiza con el número que

escriba.

2. Haga clic en el campo How many replicates do you need? (¿Cuántas réplicas

necesita?) y, a continuación, escriba 3.

3. Configure la muestra 1:

a. Haga clic en el campo Enter Sample Name (Escriba nombre de muestra) y, a

continuación, escriba Liver (Hígado).

b. Deje la opción predeterminada en el campo Color.

4. Configure la muestra 2:

a. Haga clic en el campo Enter Sample Name (Escriba nombre de muestra) y, a

continuación, escriba Kidney (Riñón).

b. Deje la opción predeterminada en el campo Color.

5. Configure la muestra 3:

a. Haga clic en el campo Enter Sample Name (Escriba nombre de muestra) y, a

continuación, escriba Brain (Cerebro).

b. Deje la opción predeterminada en el campo Color.

6. Seleccione All Sample/Target Reactions (Todas las reacciones de muestra/diana)

para configurar todos los genes diana de todas las muestras.

7. En el panel Well Count (Número de pocillos), confirme que hay:

• 18 pocillos desconocidos

• 24 pocillos vacíos

Nota: El software incluye automáticamente tres controles negativos para cada

ensayo diana. Los pocillos de control negativo se muestran en la disposición de la

placa (pocillos A1 a A6).

8. En la ficha View Plate Layout (Ver disposición de la placa), en el menú desplegable

Arrange Plate by (Ordenar placa por), seleccione Rows (Filas) (predeterminado).

9. Haga clic en Next (Siguiente) >.

Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos

Configuración de las muestras

139

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Directrices de

diseño

Cuando diseñe su propio experimento de CT comparativos:

• Identifique cada muestra con un nombre y un color únicos. Puede introducir hasta

100 caracteres en el campo Sample Name (Nombre de muestra).

• Escriba el número de reacciones idénticas (réplicas) que desea configurar. Applied

Biosystems recomienda tres réplicas para cada reacción de muestra.

• El software incluye automáticamente tres controles negativos para cada ensayo

diana.

• Seleccione la combinación de reacciones de muestra/diana deseada:

– Seleccione All Sample/Target Reactions (Todas las reacciones de

muestra/diana) para configurar todos los genes diana de todas las muestras.

– Seleccione Specify Sample/Target Reactions (Especifique reacciones de

muestra/diana) para configurar de uno en uno los genes diana que se van a

amplificar en cada muestra.

Nota: En el asistente de diseño, cada reacción de PCR sólo puede contener una

muestra y un ensayo diana.

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de la pantalla Samples (Muestras), acceda a la

ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.

Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos

Configuración de las opciones de cuantificación relativa

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

140

Notas

Configuración de las opciones de cuantificación relativa

En la pantalla Relative Quantitation Settings (Opciones de cuantificación relativa),

seleccione la muestra de referencia y el control endógeno para realizar la cuantificación

relativa.

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de CT comparativos de ejemplo:

• El tejido de cerebro se utiliza como muestra de referencia.

• GAPDH se utiliza como control endógeno.

Pantalla Relative

Quantitation

Settings

(Opciones de

cuantificación

relativa)

1. En el menú desplegable Which sample do you want to use as the reference sample?

(¿Qué muestra desea utilizar como muestra de referencia?), seleccione Brain

(cerebro).

2. En el menú desplegable Which target do you want to use as the endogenous control?

(¿Qué diana desea utilizar como control endógeno?), seleccione GAPDH.

3. Haga clic en Next (Siguiente) >.

Directrices de

diseño

Cuando diseñe su propio experimento de CT comparativos:

• Seleccione una muestra de referencia entre las muestras creadas anteriormente

(“Configuración de las muestras” en la página 137). Los resultados de la

amplificación de las muestras se comparan con los resultados de la amplificación de

la muestra de referencia para determinar la expresión relativa.

• Seleccione un control endógeno en los ensayos diana creados previamente

(“Configuración de los genes diana” en la página 135). Los resultados de la

amplificación del control endógeno se utilizan para normalizar los resultados de la

amplificación del gen diana para corregir las diferencias en la cantidad de molde

añadido a cada reacción.

Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos

Configuración del protocolo de termociclado

141

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de:

• La pantalla Relative Quantitation Settings (Opciones de cuantificación relativa),

acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.

• Las muestras de referencia (también denominadas calibradores) y los controles

endógenos, consulte User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression.

Configuración del protocolo de termociclado

En la pantalla Run Method (Protocolo de termociclado), revise el volumen de la reacción

y el perfil térmico del protocolo de termociclado predeterminado. Si es necesario, puede

editar el protocolo de termociclado predeterminado o sustituirlo por otro de la biblioteca

Run Method (Protocolo de termociclado).

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de CT comparativos de ejemplo, se utiliza el protocolo de

termociclado predeterminado sin modificaciones.

Revisión de la

pantalla Run

Method

(Protocolo de

termociclado)

1. Haga clic en la ficha Graphical View (Vista gráfica) (predeterminada) o Tabular

View (Vista tabular).

2. Asegúrese de que en el campo Reaction Volume Per Well (Volumen de reacción por

pocillo) aparece 20 µL.

3. Asegúrese de que en el perfil térmico aparecen las etapas y los ciclos que se indican

a continuación.

4. Haga clic en Next (Siguiente) >.

Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos

Revisión de la configuración de la reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

142

Notas

Directrices de

diseño

Cuando diseñe su propio experimento de CT comparativos:

• Escriba un número entre 10 y 30 para el volumen de reacción/pocillo. El sistema

StepOne admite volúmenes de reacción de entre 10 y 30 µL.

• Revise el perfil térmico:

– Asegúrese de que el perfil térmico es apropiado para los reactivos.

– Si va a realizar una RT-PCR de 1 paso, incluya un paso de retrotranscripción.

Si el experimento necesita un perfil térmico diferente, modifique el perfil térmico o

cambie el protocolo de termociclado por otro de la biblioteca Run Method

(Protocolo de termociclado). La biblioteca Run Method (Protocolo de termociclado)

está incluida en el software StepOne.

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de la biblioteca Run Method (Protocolo de

termociclado) o acerca de la pantalla Run Method (Protocolo de termociclado), acceda a

la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.

Revisión de la configuración de la reacción

En la pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción), seleccione el tipo de ensayo

(si utiliza reactivos TaqMan) y, a continuación, revise los volúmenes calculados para

preparar las reacciones de PCR y las diluciones de las muestras. Si es necesario, puede

editar el volumen de reacción, el volumen de reacción de exceso, las concentraciones de

los reactivos y/o la concentración de las muestras.

¡IMPORTANTE! Realice estos pasos para cada ensayo diana de la placa de reacción.

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de CT comparativos de ejemplo:

• Se utilizan Applied Biosystems TaqMan® Gene Expression Assays.

• El volumen de reacción por pocillo es 20 µL.

• El volumen de reacción de exceso es del 10%.

• Los componentes de la reacción son:

–TaqMan

® Fast Universal PCR Master Mix (2✕)

– Ensayo de TP53 (20✕)

– Ensayo de GAPDH (20✕)

–Muestra

– Agua

• La concentración de la muestra diluida es de 5,0 ng/µL.

• La concentración de la solución de partida de la muestra es de 100 ng/µL.

Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos

Revisión de la configuración de la reacción

143

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Pantalla Reaction

Setup

(Configuración de

reacción)

Complete la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción) para

el ensayo de TP53

1. Seleccione la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción)

(predeterminada).

2. En el panel Select Target (Seleccionar diana), seleccione TP53.

3. En el menú desplegable Assay Type (Tipo de ensayo), seleccione Inventoried/Made

to Order (En inventario/Fabricado bajo pedido).

4. Asegúrese de que en el campo Reaction Volume Per Well (Volumen de reacción por

pocillo) aparece 20 µL.

5. Asegúrese de que en el campo Excess Reaction Volume (Volumen de reacción en

exceso) muestra 10%.

6. En el panel Reactions for TP53 (Reacciones para TP53):

a. Asegúrese de que en el campo Master Mix Concentration (Concentración de

mezcla maestra) aparece 2✕.

b. Asegúrese de que en el campo Assay Mix Concentration (Concentración de

ensayo) aparece 20✕.

c. Revise los componentes y los volúmenes calculados para las reacciones de

PCR:

Componente Volumen (µL) para 1 reacción

Mezcla maestra (2✕)10,0

Ensayo (20✕)1,0

Muestra (10✕)2,0

‡

‡ El volumen de la muestra se limita al 10% del volumen total de la

reacción.

H2O7,0

Volumen total 20,0

Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos

Revisión de la configuración de la reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

144

Notas

Complete la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción) para

el ensayo de GAPDH

1. Seleccione la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción)

(predeterminada).

2. En el panel Select Target (Seleccionar diana), seleccione GAPDH.

3. En el menú desplegable Assay Type (Tipo de ensayo), seleccione Inventoried/Made

to Order (En inventario/Fabricado bajo pedido).

4. Asegúrese de que en el campo Reaction Volume Per Well (Volumen de reacción por

pocillo) aparece 20 µL.

5. Asegúrese de que en el campo Excess Reaction Volume (Volumen de reacción en

exceso) muestra 10%.

6. En el panel Reactions for GAPDH (Reacciones para GAPDH):

a. Asegúrese de que en el campo Master Mix Concentration (Concentración de

mezcla maestra) aparece 2✕.

b. Asegúrese de que en el campo Assay Mix Concentration (Concentración de

ensayo) aparece 20✕.

3 54

Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos

Revisión de la configuración de la reacción

145

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

c. Revise los componentes y los volúmenes calculados para las reacciones de

PCR:

Complete la ficha Sample Dilution Calculations (Cálculos de la dilución de muestra)

1. Seleccione la ficha Sample Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de muestra).

2. Haga clic en el campo Diluted Sample Concentration (10✕ for Reaction Mix)

(Concentración de muestra diluida (10X para la mezcla de reacción)) y, a

continuación, escriba 5,0.

3. En el menú desplegable de la unidad, seleccione ng/µL (predeterminado).

Componente Volumen (µL) para 1 reacción

Mezcla maestra (2✕)10,0

Ensayo (20✕)1,0

Muestra (10✕)2,0

‡

‡ El volumen de la muestra se limita al 10% del volumen total de la

reacción.

H2O7,0

Volumen total 20,0

3 54

Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos

Revisión de la configuración de la reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

146

Notas

4. Revise los volúmenes calculados para las diluciones de las muestras:

Imprima las instrucciones de la configuración de la reacción

Imprima las instrucciones detalladas de la configuración de la reacción y, a continuación,

guárdelas para el Capítulo 7, “Preparación de las reacciones de CT comparativos.”

1. Haga clic en Print Reaction Setup (Imprimir configuración de reacción).

2. En el cuadro de diálogo, seleccione:

• Detailed Reaction Setup Instructions (Instrucciones detalladas de la

configuración de la reacción)

• Include Plate Layout (Incluir disposición de la placa)

•Use sample color (Utilizar color de muestra)

Nombre de la

muestra

Concentración

de la solución

origen (ng/µL)

Volumen de

muestra

(µL)

Volumen de

disolvente

(µL)

Volumen total

de muestra

diluida (µL)

Hígado 100,0 1,0 19,0 20,0

Riñón 100,0 1,0 19,0 20,0

Cerebro 100,0 1,0 19,0 20,0

Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos

Revisión de la configuración de la reacción

147

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

3. Haga clic en Print (Imprimir).

4. En el cuadro de diálogo Print (Imprimir), seleccione la impresora y las opciones de

impresión y, a continuación, haga clic en OK (Aceptar).

5. Haga clic en Next (Siguiente) >.

Directrices de

diseño

Cuando diseñe su propio experimento de CT comparativos:

• Si utiliza reactivos TaqMan, seleccione el tipo de ensayo que va a utilizar:

– Seleccione Inventoried/Made to Order (En inventario/Fabricado bajo pedido) si

utiliza Applied Biosystems TaqMan®Gene Expression Assays (en inventario o

fabricados bajo pedido) o Applied Biosystems Custom TaqMan®Gene

Expression Assays.

– Seleccione Custom (Personalizado) si va a diseñar sus propios ensayos con el

software Primer Express®.

• Escriba un número entre 10 y 30 para el volumen de reacción/pocillo. El sistema

StepOne admite volúmenes de reacción de entre 10 y 30 µL.

• Incluya el volumen de reacción en exceso para contabilizar la pérdida que se

produce durante el pipeteo. Applied Biosystems recomienda un volumen de

reacción en exceso de al menos el 10%.

• Revise las concentraciones de la mezcla de reacción para cada gen diana: Si es

necesario:

– Para los reactivos TaqMan, modifique las concentraciones de la mezcla maestra y

el ensayo.

– Para los reactivos SYBR Green, modifique las concentraciones de la mezcla

maestra, el cebador directo y el cebador reverso.

– Para la RT-PCR de 1 paso, modifique la concentración de retrotranscripción.

• Revise los componentes de la mezcla de reacción para cada gen diana:

– Si va a trabajar de modo rápido, asegúrese de utilizar una mezcla maestra rápida

en las reacciones de PCR.

– Si va a realizar reacciones de PCR en modo estándar, asegúrese de utilizar una

mezcla maestra tipo estándar en las reacciones de PCR.

– En la RT-PCR de 1 paso, asegúrese de incluir retrotranscriptasa en las reacciones

de PCR y de utilizar un tampón específico.

Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos

Solicitud de materiales para el experimento

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

148

Notas

• Revise los cálculos de la dilución de las muestras para cada muestra. Si es necesario,

modifique la concentración de muestra diluida (incluidas las unidades) y la

concentración de la solución de partida.

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de:

• La pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción), acceda a la ayuda del

software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.

• Para los ensayos de Applied Biosystems, refiérase a:

–TaqMan® Gene Expression Assays Protocol

–Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol

Solicitud de materiales para el experimento

En la pantalla Materials List (Lista de materiales), revise la lista de materiales que se

recomiendan para preparar para la placa de reacción de PCR.

Opcionalmente, puede solicitar los materiales recomendados a la tienda en línea de

Applied Biosystems. Cree una cesta de la compra, añada productos a la cesta de compra

y, a continuación, inicie la sesión para enviar su pedido. Para acceder a la tienda en línea

de Applied Biosystems, debe tener una conexión a Internet ilimitada.

Nota: El software StepOne recomienda los materiales que debe solicitar de acuerdo con

el diseño del experimento. Se da por hecho que se va a diseñar el experimento, solicitar

los materiales y luego preparar (Capítulo 7) y procesar (Capítulo 8) la placa de reacción

cuando reciba los materiales.

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de CT comparativos de ejemplo, los materiales recomendados son:

•MicroAmp

™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate

•MicroAmp

™ Optical 48-Well Adhesive Film

•TaqMan

® Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase® UNG

• Ensayo de TP53: Hs00153340_m1 (RefSeq NM_000546.2)

• Ensayo de GAPDH: Kit de control endógeno de GAPDH (GAPDH) humano

(PN 4333764T)

Pantalla Ordering

Materials

(Solicitud de

materiales)

1. Busque el ensayo diana en la tienda en línea de Applied Biosystems:

a. Asegúrese de que el ordenador está conectado a Internet.

b. Haga clic en el campo Enter Gene Name (Escriba el nombre del gen), escriba

TP53 y, a continuación, haga clic en Find Assay (Buscar ensayo).

c. En el cuadro de diálogo Find Assay Results (Buscar resultados de ensayo),

seleccione la fila Hs00153340_m1.

d. Haga clic en el campo Enter Gene Name (Escriba el nombre del gen), escriba

GAPDH y, a continuación, haga clic en Find Assay (Buscar ensayo).

Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos

Solicitud de materiales para el experimento

149

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

e. En el cuadro de diálogo Find Assay Results (Buscar resultados de ensayo),

seleccione la fila 4333764T.

f. Haga clic en Apply Assay Selection (Aplicar selección de ensayo).

2. Complete el panel Experiment Materials List (Lista de materiales del experimento):

a. En el menú desplegable Display (Visualización), seleccione All Items (Todos

los elementos) (predeterminada) y, a continuación, revise los materiales

recomendados. Si es necesario, utilice la barra de desplazamiento situada a la

derecha para ver todos los elementos.

b. Active la casilla de verificación junto a cada uno de los siguientes elementos:

•MicroAmp

™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate

•MicroAmp

™ Optical 48-Well Adhesive Film

•TaqMan

® Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase® UNG

• Ensayo de TP53: Hs00153340_m1 (RefSeq NM_000546.2)

• Ensayo de GAPDH: Kit de control endógeno de GAPDH (GAPDH)

humano (PN 4333764T)

Nota: Para obtener más información acerca de un elemento específico, haga

clic en el vínculo del número de referencia para conectarse a la tienda en línea

de Applied Biosystems. En la página de inicio, escriba el número de referencia

en el campo Search (Búsqueda) y, a continuación, haga clic en Go (Ir).

c. Haga clic en Add Selected Items to Shopping List (Añadir elementos

seleccionados a la cesta de compra).

3. Compruebe si la cesta de compra del experimento contiene los materiales deseados

y que las cantidades son correctas y, a continuación, haga clic en Order Materials

in List (Solicitar materiales de la lista).

Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos

Solicitud de materiales para el experimento

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

150

Notas

4. En el cuadro de diálogo, Order Materials - Log In (Solicitar materiales – Inicio de

sesión), escriba el nombre de usuario y la contraseña de la tienda en línea de

Applied Biosystems y, a continuación, haga clic en Login and Submit (Iniciar la

sesión y enviar).

Nota: Si no tiene cuenta en la tienda en línea de Applied Biosystems, haga clic en

5. Después de realizar el pedido, haga clic en Finish Designing Experiment (Finalizar

el diseño del experimento).

Directrices de

diseño

Cuando diseñe su propio experimento de CT comparativos:

• Confirme que el ordenador tiene una conexión a Internet ilimitada.

1b,1d

2c 2a

Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos

Solicitud de materiales para el experimento

151

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

• Applied Biosystems recomienda las siguientes versiones de navegadores y Adobe®

Acrobat® Reader para utilizar el sitio web de Applied Biosystems:

Nota: Asegúrese de que se han activado las cookies y Java Script para que el sitio

web funcione correctamente.

• Seleccione todos los materiales que necesite para el experimento y añádalos a la

cesta de compra.

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de la pantalla Materials List (Lista de materiales),

acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.

Sistema operativo

del pc de

escritorio

Netscape®

Navigator

Microsoft®

Internet Explorer

Adobe® Acrobat®

Reader

Windows®

98/NT/2000 v6.x o posterior v6.x o posterior v4.0 o posterior

Macintosh® OS 9 o

posterior v6.x o posterior v5.2 o posterior v4.0 o posterior

Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos

Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

152

Notas

Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño

Para finalizar el flujo de trabajo del asistente de diseño, revise la disposición de la placa

y, a continuación, seleccione una opción de salida.

Acerca del

experimento de

ejemplo

El software StepOne selecciona automáticamente ubicaciones para los pocillos en la

placa de reacción. En el experimento de CT comparativos de ejemplo:

• Los pocillos se colocan tal y como se muestra a continuación.

• El experimento se guarda tal y como está y se cierra.

Nota: Para el experimento de ejemplo, no realice el proceso en este momento.

Finalización del

asistente de

diseño

1. En la ventana Review Plate for Experiment (Revisar placa para el experimento),

revise la disposición de la placa. Asegúrese de que hay:

• 18 pocillos desconocidos

• 6 pocillos de control negativo

• 24 pocillos vacíos

Nota: Si la disposición de la placa es incorrecta, haga clic en Return to the Wizard

(Volver al asistente) y compruebe los valores que ha introducido.

2. Haga clic en Save Experiment (Guardar experimento).

Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos

Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño

153

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

3. En el cuadro de diálogo Save Experiment (Guardar experimento), haga clic en Save

(Guardar) para aceptar la ubicación y el nombre de archivo predeterminados. El

experimento de ejemplo se guarda y se cierra, y regresa a la pantalla de inicio.

Nota: De manera predeterminada, el experimento de ejemplo se guarda en la

carpeta Applied Biosystems\StepOne System\experiments.

Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos

Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

154

Notas

Directrices de

diseño

Cuando diseñe su propio experimento de CT comparativos:

• En la ventana Review Plate for Experiment (Revisar placa para el experimento),

seleccione la opción de salida apropiada:

– Haga clic en Save Experiment (Guardar experimento) si desea guardar y cerrar

el experimento sin realizar ningún otro cambio ni iniciar el proceso.

– Haga clic en Start Run for This Experiment (Iniciar proceso para este

experimento) si desea guardar el experimento e iniciar el proceso. Asegúrese de

que la placa de reacción está cargada en el instrumento.

– Haga clic en Edit Plate Layout (Editar disposición de placa) si desea utilizar el

flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) para modificar la

disposición de la placa.

– Haga clic en Create Another Experiment Using the Design Wizard (Crear otro

experimento con el asistente de diseño) si desea guardar y cerrar el experimento

y, a continuación, crear otro experimento con el asistente de diseño.

– Haga clic en Return to the Wizard (Regresar al asistente) si desea regresar al

experimento para realizar cambios con el asistente de diseño.

• De manera predeterminada, los experimentos se guardan en la carpeta Applied

Biosystems\StepOne System\experiments. Para cambiar:

– La ubicación en la que se guarda un experimento específico, desplácese a la

ubicación deseada con el cuadro de diálogo Save Experiment (Guardar

experimento).

– La ubicación en la que se guardan los experimentos de manera predeterminada,

seleccione Tools (Herramientas)Preferences (Preferencias) y, a continuación,

seleccione la ficha General (predeterminada). En el campo Default Data Folder

(Carpeta de datos predeterminada), desplácese a la ubicación deseada.

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca del uso del flujo de trabajo Advanced Setup

(Configuración avanzada), consulte “Flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración

avanzada)” en la página 206.

Capítulo 7

155

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Preparación de las reacciones de CT

comparativos

Este capítulo cubre los siguientes temas:

■Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156

■Preparación del molde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157

■Preparación de las diluciones de las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158

■Preparación de la mezcla de reacción. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 160

■Preparación de la placa de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163

Nota: Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en

esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR

System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o

seleccionando Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne).

Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos

Resumen del capítulo

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

156

Notas

Resumen del capítulo

En este capítulo, se explica cómo preparar las reacciones de PCR para el experimento de

CT comparativos (∆∆CT) de ejemplo y se ofrecen directrices para preparar las reacciones

de PCR para su propio experimento de CT comparativos.

Flujo de trabajo

del experimento

de ejemplo

A continuación, se muestra el flujo de trabajo para preparar las reacciones de PCR para el

experimento de ejemplo que se incluye en esta guía de introducción.

Diseño del experimento (Capítulo 6)



Experimento de CT comparativos (∆∆CT)

Inicio del experimento



Realización del experimento (Capítulo 8)

Análisis del experimento (Capítulo 9)



Fin del experimento

Preparación de las reacciones (Capítulo 7)

1. Prepare el molde.

2. Prepare las diluciones de las muestras.

3. Prepare la mezcla de reacción para cada ensayo

diana.

4. Prepare la placa de reacción.

Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos

Preparación del molde

157

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Preparación del molde

Prepare el molde para las reacciones de PCR con el High-Capacity cDNA Reverse

Transcription Kit.

¡IMPORTANTE! Applied Biosystems recomienda utilizar High-Capacity cDNA Reverse

Transcription Kit para realizar una retrotranscripción a partir de RNA total y obtener un

conjunto de cDNA. Los TaqMan® Gene Expression Assays se han diseñado utilizando el

High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit; no se han probado otros protocolos para

los TaqMan Gene Expression Assays.

Acerca del

experimento de

ejemplo

Para el experimento de CT comparativos de ejemplo, el molde para las reacciones de PCR

es cDNA sintetizado a partir de las muestras de RNA total utilizando el High-Capacity

cDNA Reverse Transcription Kit.

Materiales

necesarios

• RNA aislado total preparado a partir de tejidos de hígado, riñón y cerebro.

• Uno de los Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits:

Nota: El High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit se llamaba antiguamente

High-Capacity cDNA Archive Kit.

Preparación del

molde

Utilice el High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit para sintetizar cDNA de

cadena sencilla a partir de las muestras de RNA total. Siga los procedimientos de Applied

Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol para:

1. Preparar la mezcla maestra de la reacción.

PELIGRO QUÍMICO. El tampón de reacción 10X puede

causar irritación de los ojos, la piel y las vías respiratorias. Consulte la ficha técnica

de seguridad (MSDS) y siga las instrucciones de manipulación indicadas. Use

protectores oculares, vestimenta protectora y guantes apropiados.

2. Prepare las reacciones de cDNA.

Kit Número de

referencia

High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit

(200 reacciones) 4368814

High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit

(1000 reacciones) 4368813

High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit

with RNase Inhibitor (200 reacciones) 4374966

High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit

with RNase Inhibitor (1000 reacciones) 4374967

Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos

Preparación de las diluciones de las muestras

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

158

Notas

3. Realice la retrotranscripción en un termociclador.

Directrices de

preparación

Cuando prepare su propio experimento de CT comparativos (∆∆CT):

• Applied Biosystems recomienda extraer primero el DNA o RNA del tejido o

muestra.

• Applied Biosystems recomienda los siguientes moldes:

–cDNA (cDNA) complementario: cDNA sintetizado a partir de las muestras de

RNA total utilizando un High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit.

–RNA: RNA o mRNA total purificado extraído de un tejido o una muestra.

–DNA (gDNA) genómico: gDNA purificado ya extraído de un tejido o una

muestra.

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de:

• La preparación de moldes de cDNA, consulte Applied Biosystems High-Capacity

cDNA Reverse Transcription Kits Protocol (PN 4375575). El protocolo no se

incluye en los High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits. Puede descargarlo

desde el sitio web Applied Biosystems Documents on Demand:

http://docs.appliedbiosystems.com/search.taf

• La preparación de moldes de RNA o gDNA, consulte el protocolo de los reactivos

de purificación que haya seleccionado. Para localizar los reactivos de purificación

de Applied Biosystems, visite el sitio web de Applied Biosystems:

http://www.appliedbiosystems.com/

Preparación de las diluciones de las muestras

Realice diluciones de las muestras antes de añadir las muestras a la mezcla de reacción

final. Diluya las muestras con los volúmenes que ha calculado el software StepOne™

(“Complete la ficha Sample Dilution Calculations (Cálculos de la dilución de muestra)”

en la página 145).

Acerca del

experimento de

ejemplo

Para el experimento de CT comparativos de ejemplo:

• Las diluciones de las muestras son necesarias porque el volumen de las muestras se

limita al 10% del volumen total de la reacción en el software StepOne. El volumen

total de la reacción es de 20 µL/reacción, por lo que el volumen de las muestras es

de 2 µL/reacción.

• La concentración de la solución de partida es de 100 ng/µL. Después de diluir la

muestra de acuerdo con la tabla Sample Dilutions Calculations (Cálculos de

diluciones de las muestras), la muestra tendrá una concentración de 5,0 ng/µL. Esto

supone una concentración de 10✕ cuando se añaden 2 µL al volumen de mezcla de

reacción final de 20 µL. Hay una concentración de 1✕ en la reacción final.

Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos

Preparación de las diluciones de las muestras

159

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

• Los volúmenes calculados en el software son:

Materiales

necesarios

• Agua para diluir la muestra

• Tubos de microcentrífuga

•Pipetas

• Puntas de pipeta

• Solución de partida de las muestras

•Agitador

• Centrífuga

Preparación de

las diluciones de

las muestras

1. Etiquete un tubo de microcentrífuga diferente para cada muestra diluida:

•Hígado

•Riñón

•Cerebro

2. Añada el volumen de agua requerido (disolvente) a cada tubo vacío:

3. Añada el volumen de solución de partida de las muestras requerido (disolvente) a

cada tubo vacío:

4. Agite cada muestra diluida entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifugue

brevemente los tubos.

Nombre de la

muestra

Concentración

de la solución

origen (ng/µL)

Volumen de

muestra

(µL)

Volumen de

disolvente

(µL)

Volumen total

de muestra

diluida (µL)

Hígado 100,0 1,0 19,0 20,0

Riñón 100,0 1,0 19,0 20,0

Cerebro 100,0 1,0 19,0 20,0

Tubo Nombre de la muestra Volumen de

disolvente (µL)

1 Hígado 19,0

2Riñón 19,0

3Cerebro 19,0

Tubo Nombre de la muestra Volumen de

muestra (µL)

1 Hígado 1,0

2Riñón 1,0

3Cerebro 1,0

Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos

Preparación de la mezcla de reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

160

Notas

5. Coloque las muestras diluidas en hielo hasta que prepare la placa de reacción.

Directrices de

preparación

Cuando prepare su propio experimento de CT comparativos:

• Podría necesitar diluciones de las muestras porque el volumen de las muestras se

limita al 10% del volumen total de la reacción en el software StepOne. Debe realizar

diluciones de las muestras antes de añadir las muestras a la mezcla de reacción final.

• Para conseguir un rendimiento óptimo de los TaqMan® Gene Expression Assays o

los Custom TaqMan® Gene Expression Assays, utilice entre 10 y 100 ng de molde

de cDNA por 20-µL de reacción. Para reactivos tipo rápido, Applied Biosystems

recomienda 10 ng.

• Utilice tampón TE o agua para diluir la muestra.

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de los ensayos de Applied Biosystems, consulte:

•TaqMan® Gene Expression Assays Protocol

•Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol.

Preparación de la mezcla de reacción

Prepare la mezcla de reacción con los componentes y volúmenes que ha calculado el

software StepOne (“Complete la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla

de reacción) para el ensayo de TP53” en la página 143 y “Complete la ficha Reaction

Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción) para el ensayo de GAPDH” en la

página 144).

Nota: El software calcula todos los componentes de las reacciones de PCR. Sin

embargo, para preparar la mezcla de reacción de esta sección, incluya únicamente la

mezcla maestra, el ensayo y agua. Añada la muestra cuando prepare la placa de reacción

(consulte “Preparación de la placa de reacción” en la página 163).

Acerca del

experimento de

ejemplo

Para el experimento de CT comparativos de ejemplo:

• Los componentes de la mezcla de reacción son:

–TaqMan

® Fast Universal PCR Master Mix (2✕)

– Ensayo de TP53 (20✕)

– Ensayo de GAPDH (20✕)

– Agua

Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos

Preparación de la mezcla de reacción

161

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

• Los volúmenes calculados en el software para ambos ensayos diana son:

Nota: En este momento, no se añade la muestra.

Materiales

necesarios

• Tubos de microcentrífuga

•Pipetas

• Puntas de pipeta

• Componentes de la mezcla de reacción (enumerados arriba)

• Centrífuga

Preparación de la

mezcla de

reacción

¡IMPORTANTE! Prepare la mezcla de reacción para cada ensayo diana por separado.

1. Etiquete un tubo del tamaño apropiado para cada mezcla de reacción:

• Mezcla de reacción para TP53

• Mezcla de reacción para GAPDH

2. Para el ensayo de TP53, añada los volúmenes requeridos de cada componente al

tubo de la mezcla de reacción de TP53:

Componente Volumen (µL) para

1 reacción

Mezcla maestra (2✕)10,0

Ensayo (20✕)1,0

H2O7,0

Volumen total 18,0

Componente Volumen (µL) para

1 reacción

Volumen (µL) para

12 reacciones

(más un exceso del

10%)

TaqMan® Fast Universal PCR

Master Mix (2✕)10,0 132,0

Ensayo de TP53 (20✕) 1,0 13,2

Agua 7,0 92,4

Volumen total de la mezcla de

reacción

18,0 237,6

Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos

Preparación de la mezcla de reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

162

Notas

3. Para el ensayo de GAPDH, añada los volúmenes requeridos de cada componente al

tubo de la mezcla de reacción de GAPDH:

4. Para mezclar la mezcla de reacción de cada tubo, pipetee suavemente hacia arriba y

hacia abajo y, a continuación, tápelos.

5. Centrifugue brevemente los tubos para quitar las burbujas de aire.

6. Coloque las mezclas de las reacciones en hielo hasta que prepare la placa de

reacción.

Directrices de

preparación

Cuando prepare su propio experimento de CT comparativos:

• Si el experimento incluye más de un ensayo diana, prepare la mezcla de reacción

para cada ensayo diana de manera separada.

• Incluya un volumen de exceso en los cálculos para compensar la pérdida que se

produce durante las transferencias de reactivos. Applied Biosystems recomienda un

volumen de exceso de al menos el 10%.

• Incluya todos los componentes requeridos.

• Prepare los reactivos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

• Mantenga los ensayos protegidos de la luz, en el refrigerador, hasta que esté listo

para usarlos. Una exposición excesiva a la luz puede afectar a las sondas

fluorescentes.

• Antes de utilizarlo:

– Dé vueltas al bote para mezclar bien la mezcla maestra.

– Agite el ensayo para resuspenderlo y, a continuación, centrifugue brevemente el

tubo.

– Para descongelar las muestras congeladas, colóquelas en hielo. Una vez

descongeladas, agite las muestras para resuspenderlas y, a continuación,

centrifugue los tubos brevemente.

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de la preparación de la mezcla de reacción,

consulte el protocolo apropiado para los reactivos que está utilizando en las reacciones de

PCR:

•TaqMan

® Gene Expression Assays Protocol

Componente Volumen (µL) para

1 reacción

Volumen (µL) para

12 reacciones

(más un exceso del

10%)

TaqMan® Fast Universal PCR

Master Mix (2✕)10,0 132,0

Ensayo de GAPDH (20✕) 1,0 13,2

Agua 7,0 92,4

Volumen total de la mezcla de

reacción

18,0 237,6

Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos

Preparación de la placa de reacción

163

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

• Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol

Preparación de la placa de reacción

Prepare las reacciones para cada grupo de réplicas y, a continuación, transfiéralas a la placa

de reacción. Utilice la disposición de la placa que se muestra en el software StepOne.

Acerca del

experimento de

ejemplo

Para el experimento de CT comparativos de ejemplo:

• Se utiliza una MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate.

• El volumen de la reacción es de 20 µL/pocillo.

• La placa de reacción contiene:

– 18 pocillos desconocidos

– 6 pocillos de control negativo

– 24 pocillos vacíos

• Se utiliza la disposición de la placa que genera automáticamente el software

StepOne:

Materiales

necesarios

• Tubos de microcentrífuga

•Pipetas

• Puntas de pipeta

• Mezcla de reacción para TP53 (página 161)

• Mezcla de reacción para GAPDH (página 161)

•Agua

• Muestras (página 159)

•MicroAmp

™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate

•MicroAmp

™ Optical 48-Well Adhesive Film

• Centrífuga

Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos

Preparación de la placa de reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

164

Notas

Preparación de la

placa de reacción

1. Para cada gen diana, prepare las reacciones de control negativo:

a. A un tubo del tamaño apropiado, añada los volúmenes de la mezcla de reacción

y de agua que se indican a continuación.

b. Para mezclar la reacción, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo y, a

continuación, tape el tubo.

c. Centrifugue brevemente el tubo para quitar las burbujas de aire.

d. Añada 20 µL de la reacción de control negativo a los pocillos apropiados de la

placa de reacción.

2. Por cada grupo de réplicas, prepare las reacciones para los elementos desconocidos

o muestras:

a. A tubos del tamaño adecuado, añada los volúmenes de la mezcla de reacción y

de las muestras que se indican a continuación.

Tubo Mezcla de

reacción

Volumen de la

mezcla de

reacción (µL)

Volumen de

agua (µL)

1 Mezcla de reacción

para TP53 59,4 6,6

2 Mezcla de reacción

para GAPDH 59,4 6,6

Tubo Reacción

desconocida

Mezcla de

reacción

Volumen

de la

mezcla de

reacción

(µL)

Muestra

Volumen

de muestra

(µL)

1 Hígado TP53 Mezcla de

reacción

para TP53

59,4 Hígado 6,6

2 Riñón TP53 Mezcla de

reacción

para TP53

59,4 Riñón 6,6

3 Cerebro TP53 Mezcla de

reacción

para TP53

59,4 Cerebro 6,6

4 GAPDH en

hígado Mezcla de

reacción

para

GAPDH

59,4 Hígado 6,6

5 GAPDH en

riñón Mezcla de

reacción

para

GAPDH

59,4 Riñón 6,6

Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos

Preparación de la placa de reacción

165

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

b. Para mezclar las reacciones, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo y, a

continuación, tape los tubos.

c. Centrifugue brevemente los tubos para quitar las burbujas de aire.

d. Añada 20 µL de la mezcla de reacción desconocida (muestra) a los pocillos

apropiados de la placa.

3. Selle la placa de reacción con película adhesiva óptica.

4. Centrifugue brevemente la placa de reacción para quitar las burbujas de aire.

5. Hasta que esté preparado para realizar la reacción, coloque la placa de reacción en

hielo en un sitio oscuro.

Directrices de

preparación

Cuando prepare su propio experimento de CT comparativos:

• Procure utilizar los consumibles adecuados.

• Asegúrese de que la colocación de las reacciones de PCR se corresponde con la

disposición de la placa que se muestra en el software StepOne. Puede:

– Aceptar la disposición de la placa que genera automáticamente el software.

– Utilizar el flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) para

cambiar la disposición de la placa en el software.

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de:

• La preparación de la placa de reacción, consulte el protocolo apropiado para los

reactivos que está utilizando en las reacciones de PCR:

–TaqMan® Gene Expression Assays Protocol

–Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol

• Los consumibles, consulte la página 3.

• El uso del flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) para cambiar

la disposición de la placa, consulte “Flujo de trabajo Advanced Setup

(Configuración avanzada)” en la página 206.

6Cerebro

GAPDH Mezcla de

reacción

para

GAPDH

59,4 Cerebro 6,6

Tubo Reacción

desconocida

Mezcla de

reacción

Volumen

de la

mezcla de

reacción

(µL)

Muestra

Volumen

de muestra

(µL)

Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos

Preparación de la placa de reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

166

Notas

Capítulo 8

167

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Realización del experimento de CT

comparativos

Este capítulo cubre los siguientes temas:

■Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168

■Preparación de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169

■Realización del experimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171

Nota: Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en

esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR

System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o

seleccionando Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne).

Capítulo 8 Realización del experimento de CT comparativos

Resumen del capítulo

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

168

Notas

Resumen del capítulo

En este capítulo, se explica cómo realizar una reacción en Applied Biosystems StepOne™

Real-Time PCR System.

Flujo de trabajo

del experimento

de ejemplo

A continuación, se muestra el flujo de trabajo para realizar el experimento de ejemplo

que se incluye en esta guía de introducción.

Diseño del experimento (Capítulo 6)



Inicio del experimento



Preparación del experimento (Capítulo 7)

Análisis del experimento (Capítulo 9)

Fin del experimento



Realización del experimento (Capítulo 8)

1. Prepare el proceso.

2. Active las opciones de notificación.

3. Inicie el proceso.

4. Monitorice el proceso.

5. Descargue el instrumento y transfiera los datos.

Capítulo 8 Realización del experimento de CT comparativos

Preparación de la reacción

169

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Preparación de la reacción

Para preparar el proceso, abra el experimento y cargue la MicroAmp™ Fast Optical 48-

Well Reaction Plate en el instrumento StepOne™.

Apertura del

experimento de

ejemplo

1. Si aún no se está ejecutando el software StepOne™, haga doble clic en (acceso

directo al software StepOne) o seleccione Start (Inicio)All Programs (Todos los

programas)Applied Biosystems StepOneStepOne v2.0.

2. En la pantalla Home (Inicio), haga clic en Open (Abrir).

3. En el cuadro de diálogo Open (Abrir), desplácese hasta la carpeta experiments

(experimentos) (predeterminada).

4. Haga doble clic en Comparative CT Example (Ejemplo de CT comparativos) para

abrir el archivo del experimento de ejemplo que ha creado en el Capítulo 6.

Capítulo 8 Realización del experimento de CT comparativos

Preparación de la reacción

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

170

Notas

Carga de la placa

de reacción

PELIGRO DE LESIONES FÍSICAS. Durante el uso del

instrumento, la temperatura del bloque puede superar los 100 °C. Si el instrumento se ha

utilizado recientemente, mantenga las manos alejadas de él hasta que el bloque alcance la

temperatura ambiente.

¡IMPORTANTE! Lleve guantes sin polvo para manejar la

placa de reacción

1. Abra la bandeja del instrumento.

2. Coloque las reacciones en el bloque.

La colocación de las reacciones depende del tipo de consumible que se utilice:

• Si utiliza una placa de reacción, colóquela con el pocillo A1 en la esquina

posterior izquierda.

• Si utiliza tiras de tubos de reacción, colóquelas en el bloque directamente.

3. Cierre cuidadosamente la bandeja del instrumento.

Capítulo 8 Realización del experimento de CT comparativos

Realización del experimento

171

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Realización del experimento

Realice los siguientes procedimientos del capítulo 4:

•“(Opcional) Activación de las notificaciones” en la página 71

•“Inicio de la reacción” en la página 73

•“Monitorización de la reacción” en la página 76

•“Descarga de la placa de reacción y transferencia de datos” en la página 87

Asegúrese de seleccionar el archivo Comparative CT Example.eds en lugar del archivo

Relative Standard Curve Example.eds.

Capítulo 8 Realización del experimento de CT comparativos

Realización del experimento

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

172

Notas

Capítulo 9

173

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Análisis del experimento de C

comparativos

Este capítulo cubre los siguientes temas:

■Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174

■Sección 9.1 Revisión de los resultados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175

■Sección 9.2 Solución de problemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193

Nota: Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en

esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR

System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o

seleccionando Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne).

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos

Resumen del capítulo

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

174

Notas

Resumen del capítulo

El software StepOne™ analiza los datos con el método de cuantificación de CT

comparativos (∆∆CT). En la primera sección de este capítulo, se explica cómo revisar los

datos analizados utilizando las pantallas de análisis y cómo presentar los datos. Si los

resultados son cuestionables, en la Sección 2 de este capítulo se explican algunos pasos

para solucionar los problemas.

Flujo de trabajo

del experimento

de ejemplo

A continuación, se muestra el flujo de trabajo para analizar el experimento de ejemplo

que se incluye en esta guía de introducción.

Diseño del experimento (Capítulo 6)



Experimento de CT comparativos (∆∆CT)

Inicio del experimento



Preparación de las reacciones (Capítulo 7)

Realización del experimento (Capítulo 8)



Fin del experimento

Análisis del experimento (Capítulo 9)

Sección 1. Revisión de los resultados:

1. Analice.

2. Revise la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica)

o la tabla de pocillos.

3. Revise la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación).

4. Presente los datos.

Sección 2. Solución de problemas:

1. Revise las opciones de análisis; ajuste la línea basal y el umbral.

2. Revise la pantalla QC Summary (Resumen QC).

3. Omita pocillos.

4. Revise la pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente).

5. Revise la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos).

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos

Sección 9.1 Revisión de los resultados

175

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Sección 9.1 Revisión de los resultados

Esta sección cubre los siguientes temas:

■Análisis del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176

■Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos . . . . . . . . . . . . 182

■Revisión de la gráfica de amplificación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185

■Presentación de los datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos

Análisis del experimento

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

176

Notas

Análisis del experimento

El software StepOne analiza el experimento y muestra los resultados en las pantallas de

análisis (por ejemplo, en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación), QC

Summary (Resumen QC), etc.)

Acerca del

experimento de

ejemplo

Para el experimento de CT comparativos de ejemplo, utilice el archivo de datos que se

instala con el software StepOne. Este archivo de datos se ha creado con los mismos

parámetros de diseño que se indican en el Capítulo 6 y luego se ha procesado y analizado

en un instrumento StepOne™.

Encontrará el archivo de datos del experimento de ejemplo en su ordenador:

<unidad>:\Applied Biosystems\StepOne System\experiments\examples

donde <unidad> es la unidad del disco duro del ordenador en la que está instalado el

software de StepOne. La unidad de instalación predeterminada del software es la

unidad C.

Análisis del

experimento de

ejemplo

1. Si aún no se está ejecutando el software StepOne, haga doble clic en (acceso

directo al software StepOne) o seleccione Start (Inicio)All Programs (Todos los

programas)Applied BiosystemsStepOneStepOne v2.0.

2. En la pantalla Home (Inicio), haga clic en Open (Abrir).

3. En el cuadro de diálogo Open (Abrir), desplácese hasta la carpeta examples

(ejemplos).

4. Haga doble clic en Comparative CT Example (Ejemplo de CT comparativos) para

abrir el archivo de datos del experimento de ejemplo.

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos

Análisis del experimento

177

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

5. Haga clic en Analyze (Analizar). El software analiza los datos utilizando las

opciones de análisis predeterminadas.

6. Consulte “Elementos del software” más adelante y “Consejos de desplazamiento”

en la página 179 para obtener información acerca de cómo desplazarse por las

pantallas de análisis.

Directrices Cuando analice su propio experimento de CT comparativos:

• Inmediatamente después de una reacción, el software StepOne analiza

automáticamente los datos utilizando las opciones de análisis predeterminadas y, a

continuación, muestra la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) en

el ordenador.

• Para volver a analizar los datos, seleccione todos los pocillos de la disposición de la

placa y, a continuación, haga clic en Analyze (Analizar).

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos

Análisis del experimento

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

178

Notas

Elementos del

software

A continuación, se ilustran los elementos del software StepOne de las pantallas de

análisis.

1. Barra de menús: muestra los menús disponibles en el software:

• File (Archivo)

• Edit (Edición)

• Instrument (Instrumento)

• Analysis (Análisis)

• Tools (Herramientas)

• Help (Ayuda)

2. Barra de herramientas: muestra las herramientas disponibles en el software:

• New Experiment (Experimento nuevo)

• Open (Abrir)

• Save (Guardar)

• Close (Cerrar)

• Send Experiment to Instrument (Enviar experimento al instrumento)

• Download Experiment from Instrument (Descargar experimento del

instrumento)

• Export (Exportar)

• Print Report (Imprimir informe)

3. Cabecera del experimento: indica el nombre del experimento, el tipo de experimento

y los reactivos del experimento abierto.

4. Panel de menús del experimento: incluye vínculos a las siguientes pantallas del

software:

• Pantallas de configuración

• Pantallas del perfil de reacción

• Pantallas de análisis:

–Amplification Plot (Gráfica de amplificación)

–Gene Expression (Expresión génica)

–Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente)

–Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos)

–QC Summary (Resumen QC)

–Multiple Plots View (Vista de múltiples gráficas)

5. Panel de gráficas: muestra la pantalla de análisis seleccionada para el experimento

abierto.

6. Fichas de visualización: muestra la disposición de la placa o la tabla de pocillos del

experimento abierto.

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos

Análisis del experimento

179

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

7. Fichas del experimento: muestra una ficha por cada experimento abierto.

Consejos de

desplazamiento

Cómo seleccionar pocillos

Para ver pocillos específicos en las pantallas de análisis, seleccione los pocillos en la

ficha View Plate Layout (Ver disposición de placa) de la siguiente manera:

1. Para seleccionar pocillos de un tipo específico, utilice los menús desplegables Select

Wells With (Seleccionar pocillos con): seleccione Sample (Muestra), Target

(Diana) o Task (Tarea) y, a continuación, seleccione el nombre de la muestra, el gen

diana o la tarea.

2. Para seleccionar un solo pocillo, haga clic en él en la disposición de la placa.

3. Para seleccionar varios pocillos, haga clic y arrastre el ratón por encima de los

pocillos deseados, pulse CTRL+clic, o pulse Mayús+clic en la disposición de la

placa.

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos

Análisis del experimento

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

180

Notas

4. Para seleccionar los 48 pocillos, haga clic en la esquina superior izquierda de la

disposición de la placa.

Cómo ver múltiples gráficas

Utilice la vista Multiple Plots (Múltiples gráficas) para ver simultáneamente hasta cuatro

gráficas. Para desplazarse por la vista Multiple Plots (Múltiples gráficas):

1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis

(Análisis) Multiple Plots View (Vista de múltiples gráficas).

2. Para ver cuatro gráficas, haga clic en Show plots in a 2 ✕2 matrix (Mostrar

gráficas en una matriz de 2 X 2).

3. Para ver dos gráficas en filas, haga clic en Show plots in two rows (Ver gráficas

en dos filas).

4. Para ver dos gráficas en columnas, haga clic en Show plots in two columns

(Ver gráficas en dos columnas).

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos

Análisis del experimento

181

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

5. Para ver una gráfica específica, seleccione la gráfica en el menú desplegable situado

encima de la visualización de cada gráfica.

2 35

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos

Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

182

Notas

Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de

pocillos

La pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica) muestra los resultados

de los cálculos de cuantificación relativa a través del perfil de expresión génica. Hay

disponibles dos gráficas:

•RQ vs Target (Cuantificación relativa vs diana): agrupa los valores de

cuantificación relativa (RQ) por diana. Se traza cada muestra para cada gen diana.

•RQ vs Sample (Cuantificación relativa vs muestra): agrupa los valores de

cuantificación relativa (RQ) por muestra. Se traza cada gen diana para cada muestra.

Cada gráfica se puede ver de las siguientes formas: lineal, log10, Ln, log2.

En la tabla de pocillos, se muestran datos de cada pocillo de la placa de reacción,

incluidos:

• El nombre de la muestra, el nombre de el gen diana, la tarea y los fluorocromos

• El ciclo umbral calculado (CT), la fluorescencia normalizada (Rn) y los valores de

cantidades

•Avisos

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de CT comparativos de ejemplo, se revisa:

• Cada gen diana de la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica)

para el nivel de expresión (o cambio en número de veces de la expresión) de la

muestra de gen diana en relación con la muestra de referencia.

• La tabla de pocillos para evaluar la precisión de los grupos de réplicas.

Revisión de la

gráfica de

expresión génica

y la tabla de

pocillos

1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis

(Análisis) Gene Expression (Expresión génica).

Nota: Si en la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica) no

aparece ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar).

2. En la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica):

a. En el menú desplegable Plot Type (Tipo de gráfica), seleccione RQ vs Sample

(Cuantificación relativa vs Muestra).

b. En el menú desplegable Graph Type (Tipo de gráfica), seleccione Log10.

c. En el menú desplegable Orientation (Orientación), seleccione Ve r t i c a l B a rs

(Barras verticales).

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos

Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos

183

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

d. Haga clic en Show/Hide the plot legend (Mostrar/ocultar la leyenda de la

gráfica).

En el experimento de ejemplo, se muestra el nivel de expresión de TP53 en el

hígado y el riñón en relación con su nivel de expresión en la muestra de referencia

(cerebro). Dado que la muestra de referencia se compara consigo misma, el nivel de

expresión es 1. Si el resultado se muestra en el tipo de gráfico Log10, el nivel de

expresión de la muestra de referencia aparece como 0 en el gráfico (log10 de 1=0).

3. Revise la tabla de pocillos:

a. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis

(Análisis) Amplification Plot (Gráfica de amplificación) y, a

continuación, seleccione la ficha View Well Table (Ver tabla de pocillos).

b. En el menú desplegable Group By (Agrupar por), seleccione Replicate

(Réplica).

c. Fíjese en la columna CT SD para evaluar la precisión de los grupos de réplicas.

En el experimento de ejemplo, no hay ningún valor atípico.

2a 2b 2c

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos

Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

184

Notas

Nota: Para mostrar u ocultar columnas en la tabla de pocillos, marque/desmarque el

nombre de columna en el menú desplegable Show in Table (Mostrar en tabla).

Directrices de

análisis

Cuando analice su propio experimento de CT comparativos, busque:

• Diferencias en la expresión génica (como un cambio en número de veces de la

expresión) en relación con la muestra de referencia.

• Desviación estándar en los grupos de réplicas (valores CT SD). Si es preciso, omita

los valores atípicos (consulte “Omisión de pocillos para el análisis” en la

página 197).

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de

expresión génica) o la tabla de pocillos, acceda a la ayuda del software StepOne haciendo

clic en o pulsando F1.

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos

Revisión de la gráfica de amplificación

185

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Revisión de la gráfica de amplificación

En la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación), se muestra la amplificación

de todas las muestras de los pocillos seleccionados. Hay disponibles tres gráficas:

•∆Rn vs Cycle (∆Rn vs ciclo): ∆Rn es la variación de la señal de fluorescencia

normalizada generada en cada ciclo de la reacción de PCR y son los datos a partir de

los cuales se calcula CT

. En esta gráfica, ∆Rn se muestra en función del número de

ciclo. La gráfica sirve para identificar y examinar las amplificaciones irregulares y

para ver los valores del umbral y línea basal de la reacción.

•Rn vs Cycle (Rn vs ciclo): Rn es la fluorescencia de fluorocromo del notificador

normalizada. En esta gráfica, Rn se muestra en función del número de ciclo. La

gráfica sirve para identificar y examinar las amplificaciones irregulares.

•CT vs Well (CT vs pocillo): el ciclo umbral (CT) es el número de ciclo de PCR en el

cual el nivel de fluorescencia corta el umbral. En esta gráfica, CT se muestra en

función de la posición del pocillo. La gráfica sirve para localizar amplificaciones

con valores atípicos.

Cada gráfica se puede ver de las siguientes formas: lineal o log10.

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de CT comparativos de ejemplo, hay que revisar cada gen diana en la

pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) para buscar:

• Valores de umbral y línea basal correctos

• Valores atípicos

Revisión de la

gráfica de

amplificación

1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis

(Análisis) Amplification Plot (Gráfica de amplificación).

Nota: Si en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) no aparece

ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar).

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos

Revisión de la gráfica de amplificación

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

186

Notas

2. Observe los pocillos de GAPDH en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de

amplificación):

a. Haga clic en la ficha View Plate Layout (Ver disposición de placa).

b. En los menús desplegables Select Wells With (Seleccionar pocillos con),

seleccione Target (Diana) y, a continuación, GAPDH.

3. En la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación):

a. En el menú desplegable Plot Type (Tipo de gráfica), seleccione ∆Rn vs Cycle

(∆Rn vs ciclo).

b. En el menú desplegable Color Plot By (Colorear gráfica por), seleccione Well

(Pocillo).

c. Haga clic en Show/Hide the plot legend (Mostrar/ocultar la leyenda de la

gráfica).

2a 2b

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos

Revisión de la gráfica de amplificación

187

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

4. Observe los valores de la línea basal:

a. En el menú desplegable Graph Type (Tipo de gráfica), seleccione Linear

(Lineal).

b. Active la casilla de verificación Baseline (Línea basal) para ver los ciclos

inicial y final de la línea basal.

c. Compruebe que la línea basal está ajustada correctamente. En el experimento

del ejemplo, la línea basal termina antes de que se inicie la amplificación.

3a 4a 3b

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos

Revisión de la gráfica de amplificación

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

188

Notas

5. Observe los valores de umbral:

a. En el menú desplegable Graph Type (Tipo de gráfica), seleccione Log

(Registro).

b. En el menú desplegable Target (Diana), seleccione GAPDH.

c. Active la casilla de verificación Threshold (Umbral) para ver el umbral.

d. Compruebe que el umbral está situado correctamente. En el experimento de

ejemplo, el umbral está en la fase exponencial.

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos

Revisión de la gráfica de amplificación

189

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

6. Busque cualquier valor atípico:

a. En el menú desplegable Plot Type (Tipo de gráfica), seleccione CT vs Well

(CTvs pocillo).

b. Busque pocillos fuera de la curva de amplificación. En el experimento de

ejemplo, no hay ningún valor atípico para GAPDH.

7. Repita los pasos 2 a 6 para los pocillos de TP53. En el experimento de ejemplo, no

hay ningún valor atípico para TP53.

Directrices de

análisis

Cuando analice su propio experimento de CT comparativos, busque:

• Los valores de línea basal y umbral correctos: el software StepOne calcula

automáticamente los valores de línea basal y umbral dando por hecho que los datos

tienen una gráfica de amplificación típica. Una gráfica de amplificación típica

tiene:

a. Una fase de meseta o plateau

b. Una fase lineal

c. Una fase exponencial (geométrica)

d. Un determinado ruido de fondo

e. Una línea basal

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos

Revisión de la gráfica de amplificación

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

190

Notas

¡IMPORTANTE! Los errores en el experimento (por ejemplo, errores de

contaminación o pipeteo) pueden producir curvas de amplificación atípicas que

pueden derivar a cálculos incorrectos de los valores de línea basal y umbral por

parte del software StepOne. Por lo tanto, Applied Biosystems recomienda examinar

la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) y revisar los valores de

línea basal y umbral asignados a cada pocillo después del análisis.

• Valores atípicos

Si el experimento no cumple las directrices anteriores, solucione los problemas de la

siguiente forma:

• Ajuste manualmente la línea basal y/o el umbral (consulte “Revisión de las opciones

de análisis” en la página 194).

• Omita pocillos (consulte “Omisión de pocillos para el análisis” en la página 197).

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de la pantalla Amplification Plot (Gráfica de

amplificación), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.

Ciclo

∆Rn

Umbral

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos

Presentación de los datos

191

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Presentación de los datos

Hay distintas formas de presentar los datos del experimento:

• Guardando la gráfica como un archivo de imagen

• Imprimiendo la gráfica

• Imprimiendo la disposición de la placa

• Creando diapositivas

• Imprimiendo un informe

• Exportando datos

Para obtener más información acerca de estos procedimientos, acceda a la ayuda del

software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos

Presentación de los datos

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

192

Notas

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos

Sección 9.2 Solución de problemas

193

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Sección 9.2 Solución de problemas

Esta sección cubre los siguientes temas:

■Revisión de las opciones de análisis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194

■Revisión del resumen QC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196

■Omisión de pocillos para el análisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197

■Revisión de la gráfica multicomponente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200

■Revisión de la gráfica de datos brutos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos

Revisión de las opciones de análisis

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

194

Notas

Revisión de las opciones de análisis

El cuadro de diálogo Analysis Settings (Opciones de análisis) muestra las opciones de

análisis del ciclo umbral (CT), los avisos, la cuantificación relativa y las opciones

avanzadas. Si las opciones de análisis predeterminadas del software StepOne no son

adecuadas para el experimento, puede cambiarlas en el cuadro de diálogo Analysis

Settings (Opciones de análisis) y, a continuación, volver a analizar el experimento.

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de CT comparativos de ejemplo, se utilizan las opciones de análisis

predeterminadas sin ningún cambio.

Revisión de las

opciones de

análisis

1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis

(Análisis).

2. Haga clic en Analysis Settings (Opciones de análisis) para abrir el cuadro de

diálogo Analysis Settings (Opciones de análisis).

3. En el experimento de ejemplo, se utilizan opciones de análisis para cada ficha:

•C

T Settings (Opciones de CT)

• Flag Settings (Opciones de avisos)

• Opciones de cuantificación relativa

• Advanced Settings (Opciones avanzadas)

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos

Revisión de las opciones de análisis

195

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Directrices de

análisis

A menos que ya haya determinado cuál son las opciones óptimas para el experimento,

utilice las opciones de análisis predeterminadas en el software StepOne. Si las opciones

predeterminadas no son adecuadas para el experimento, puede cambiar:

•CT Settings (Opciones de CT): utilice esta ficha para ajustar manualmente el umbral

y la línea basal. Si ajusta manualmente el umbral y la línea basal, Applied

Biosystems recomienda lo siguiente:

•Flag Settings (Opciones de avisos): utilice esta ficha para:

– Ajustar la sensibilidad para que se marquen más o menos pocillos.

– Cambiar los parámetros de los avisos que aplica el software StepOne.

•Relative Quantitation Settings (Opciones de cuantificación relativa): utilice esta

ficha para:

– Cambiar la muestra de referencia y/o el control endógeno.

– Seleccionar el algoritmo que se debe utilizar para determinar los valores mínimos

y máximos de RQ (nivel de confianza o desviaciones estándar).

•Advanced Settings (Opciones avanzadas): utilice esta ficha para cambiar las

opciones de línea basal pocillo a pocillo.

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de las opciones de análisis, acceda al software

StepOne pulsando F1 cuando se abra el cuadro de diálogo Analysis Settings (Opciones

de análisis).

Opción Recomendación

Umbral Introduzca un valor para el umbral de manera que:

• Esté por encima del ruido de fondo.

• Esté por debajo de las fases de meseta o plateau y fase lineal de

la curva de amplificación.

• Esté dentro de la fase exponencial de la curva de amplificación.

Línea basal Seleccione los valores Start Cycle (Ciclo inicial) y End Cycle (Ciclo

final) antes de que comience la amplificación.

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos

Revisión del resumen QC

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

196

Notas

Revisión del resumen QC

La pantalla QC Summary (Resumen QC) muestra una lista de avisos del software

StepOne, e incluye la frecuencia y ubicación de los mismos en el experimento abierto.

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de CT comparativos de ejemplo, hay que revisar la pantalla QC

Summary (Resumen QC) para saber si los datos del experimento han desencadenado

algún aviso. En el experimento de ejemplo, no se ha desencadenado ningún aviso.

Revisión del

resumen QC

1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis

(Análisis) QC Summary (Resumen QC).

Nota: Si en la pantalla QC Summary (Resumen QC) no aparece ningún dato, haga

clic en Analyze (Analizar).

2. Revise el resumen de avisos. En el experimento de ejemplo, hay 0 pocillos

marcados.

3. En la tabla Flag Details (Detalles de aviso), observe las columnas Frequency

(Frecuencia) y Wells (Pocillos) para determinar qué avisos aparecen en el

experimento. En el experimento de ejemplo, en la columna Frequency (Frecuencia)

se muestra 0 en todas las columnas.

Nota: Un valor 0 en la columna Frequency (Frecuencia) indica que el aviso no

aparece en el experimento.

4. (Opcional) Haga clic en cada fila de avisos para ver información detallada acerca

del aviso.

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos

Omisión de pocillos para el análisis

197

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Posibles avisos En los experimentos de CT comparativos, los datos del experimento pueden

desencadenar los avisos que se indican a continuación.

Si en el experimento no aparece un aviso, su frecuencia será 0. Si la frecuencia es >0, eso

significa que el aviso aparece en algún lugar del experimento. La posición del pocillo se

indica en la columna Wells (Pocillos).

Directrices de

análisis

Cuando analice su propio experimento de CT comparativos:

• Haga clic en cada aviso de la tabla Flag Details (Detalles de avisos) con una

frecuencia >0 para ver información detallada acerca del aviso. Si es necesario, haga

clic en el vínculo de solución de problemas para saber cómo corregir el aviso.

• Puede cambiar las opciones de los avisos:

– Ajustar la sensibilidad para que se marquen más o menos pocillos.

– Cambiar los parámetros de los avisos que aplica el software StepOne.

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de la pantalla QC Summary (Resumen QC) o de las

opciones de avisos, acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o

pulsando F1.

Omisión de pocillos para el análisis

Los errores de los experimentos pueden causar que algunos pocillos se amplifiquen de

manera insuficiente o no se amplifiquen. Estos pocillos suelen producir valores CT que

difieren significativamente de los valores medios de los pocillos de réplicas asociadas. Si

se incluyen en los cálculos, estos valores atípicos pueden dar lugar a mediciones

erróneas; para garantizar la precisión, omita los valores atípicos del análisis.

Aviso Descripción

AMPNC Amplificación en control negativo

BADROX Señal de referencia pasiva incorrecta

BLFAIL Error del algoritmo de línea basal

CTFAIL Error del algoritmo CT

EXPFAIL Error del algoritmo exponencial

HIGHSD Desviación estándar alta en el grupo de réplicas

NOAMP No hay amplificación

NOISE Ruido mayor que otros pocillos en la placa

NOSIGNAL No hay señal en el pocillo

OFFSCALE La fluorescencia está fuera de la escala

OUTLIERRG Valor atípico en el grupo de réplicas

SPIKE Picos de ruido

THOLDFAIL Error en el algoritmo del umbral

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos

Omisión de pocillos para el análisis

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

198

Notas

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de CT comparativos de ejemplo, no hay valores atípicos; no es

necesario omitir ningún pocillo del análisis.

Omisión de

pocillos

1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis

(Análisis) Amplification Plot (Gráfica de amplificación).

Nota: Si en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) no aparece

ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar).

2. En la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación), seleccione CT vs Well

(CT vs pocillo) en el menú desplegable Plot Type (Tipo de gráfica).

3. Seleccione la ficha View Well Table (Ver tabla de pocillos).

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos

Omisión de pocillos para el análisis

199

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

4. En la tabla de pocillos:

a. En el menú desplegable Group By (Agrupar por), seleccione Replicate

(Réplica).

b. Fíjese si en el grupo de réplicas hay algún valor atípico (asegúrese de que están

marcados con un aviso). En el experimento de ejemplo, no hay ningún valor

atípico.

Directrices de

análisis

Cuando analice su propio experimento de CT comparativos, fíjese bien si en los grupos

de réplicas hay valores atípicos. Si es necesario, quite manualmente los valores atípicos

con la tabla de pocillos:

1. En el panel Experiment Menu (Menú de experimento), seleccione Analysis

(Análisis) Amplification Plot (Gráfica de amplificación).

Nota: Si en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) no aparece

ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar).

2. En la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación), seleccione CT vs Well

(CT vs pocillo) en el menú desplegable Plot Type (Tipo de gráfica).

3. Seleccione la ficha View Well Table (Ver tabla de pocillos).

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos

Revisión de la gráfica multicomponente

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

200

Notas

4. En la tabla de pocillos:

a. En el menú desplegable Group By (Agrupar por), seleccione Replicate

(Réplica).

b. Fíjese si en el grupo de réplicas hay algún valor atípico (asegúrese de que están

marcados).

c. Active la casilla de verificación Omit (Omitir) que hay junto a los pocillos con

valores atípicos.

5. Haga clic en Analyze (Analizar) para volver a analizar los datos del experimento sin

los pocillos con valores atípicos.

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de la omisión de pocillos para el análisis, acceda a

la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. En la ayuda, busque

los temas relacionados con la omisión de pocillos:

1. Haga clic en la ficha Search (Buscar).

2. Escriba omit well (omisión de pocillos).

3. Haga clic en List Topics (Ver temas).

4. Haga doble clic en los temas que desee leer.

Revisión de la gráfica multicomponente

La pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente) muestra la contribución

espectral completa de cada fluorocromo de un pocillo seleccionado durante el tiempo que

dura el proceso de PCR.

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de CT comparativos de ejemplo, en la pantalla Multicomponent Plot

(Gráfica multicomponente) hay que fijarse en:

•Fluorocromo ROX

™ (referencia pasiva)

•Fluorocromo FAM

™ (notificador)

• Picos, depresiones y/o cambios repentinos

• Amplificación en pocillos de control negativo

Revisión de la

gráfica

multicomponente

1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis

(Análisis) Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente).

Nota: Si en la pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente) no aparece

ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar).

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos

Revisión de la gráfica multicomponente

201

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

2. Muestre un solo pocillo a la vez en la pantalla Multicomponente Plot (Gráfica

multicomponente):

a. Haga clic en la ficha View Plate Layout (Ver disposición de placa).

b. Seleccione un pocillo en la disposición de la placa; el pocillo se muestra en la

pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente).

3. En el menú desplegable Plot Color (Color de gráfica), seleccione Dye

(Fluorocromo).

4. Haga clic en Show/Hide the plot legend (Mostrar/ocultar la leyenda de la

gráfica).

5. Compruebe la señal del fluorocromo FAM. En el experimento de ejemplo, la señal

del fluorocromo FAM aumenta a lo largo de la reacción de PCR, lo que indica que la

amplificación es normal.

6. Compruebe la señal del fluorocromo ROX. En el experimento de ejemplo, la señal

del fluorocromo ROX permanece constante a lo largo de la reacción de PCR, lo que

indica que los datos son típicos.

32a4

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos

Revisión de la gráfica multicomponente

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

202

Notas

7. Seleccione de uno en uno los pocillos de control negativo y compruebe la

amplificación. En el experimento de ejemplo, no hay amplificación en los pocillos

de control negativo.

Directrices de

análisis

Cuando analice su propio experimento de CT comparativos, busque:

• Referencia pasiva: el nivel de fluorescencia del fluorocromo de referencia pasiva

debe permanecer relativamente constante a lo largo de la reacción de PCR.

• Fluorocromo del notificador: el nivel de fluorescencia del fluorocromo del

notificador debería indicar una región plana que se corresponde con la línea basal,

seguida por un rápido aumento en la fluorescencia a medida que la amplificación

continúa.

• Cualquier irregularidad de la señal: no debería haber ningún pico, depresión ni

cambio súbito en la señal fluorescente.

• Pocillos de control negativo: no debería haber ninguna amplificación en los pocillos

de control negativo.

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de la pantalla Multicomponent Plot (Gráfica

multicomponente), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o

pulsando F1.

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos

Revisión de la gráfica de datos brutos

203

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Revisión de la gráfica de datos brutos

En la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos), se muestra la señal de

fluorescencia bruta (no normalizada) para cada filtro óptico de los pocillos seleccionados

durante cada ciclo de la PCR a tiempo real.

Acerca del

experimento de

ejemplo

En el experimento de CT comparativos de ejemplo, hay que revisar la pantalla Raw Data

Plot (Gráfica de datos brutos) para comprobar si hay un aumento estable de la señal (que

no hay ninguna depresión ni cambio abrupto) a partir del filtro apropiado.

Revisión de la

gráfica de datos

brutos

1. En el panel Experiment Menu (Menú de experimento), seleccione Analysis

(Análisis) Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos).

Nota: Si en la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos) no aparece ningún

dato, haga clic en Analyze (Analizar).

2. Para ver los 48 pocillos en la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos), haga

clic en la esquina superior izquierda de la disposición de la placa en la ficha View

Plate Layout (Ver disposición de placa).

3. Haga clic en Show/Hide the plot legend (Mostrar/ocultar la leyenda de la

gráfica).

4. Haga clic y arrastre el puntero Show Cycle (Mostrar ciclo) desde el ciclo 1 al 40. En

el experimento de ejemplo, hay un aumento estable en la señal a partir del filtro 1,

que se corresponde con el filtro del fluorocromo FAM™.

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos

Revisión de la gráfica de datos brutos

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

204

Notas

Los filtros del sistema StepOne™ son:

Directrices de

análisis

Cuando analice su propio experimento de CT comparativos, fíjese en lo siguiente para

cada filtro:

• Crecimiento característico de la señal

• Depresiones o cambios abruptos

Para obtener más

información

Para obtener más información acerca de la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos

brutos), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.

Filtro Fluorocromo

1 Fluorocromo FAM™

Fluorocromo SYBR®

Green

2 Fluorocromo JOE™

Fluorocromo VIC®

3 Fluorocromo ROX™

Apéndice A

205

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

Flujos de trabajo alternativos para el

experimento

Este apéndice cubre los siguientes temas:

■Flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) . . . . . . . . . . . . . . . . 206

■Flujo de trabajo QuickStart (Inicio rápido) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207

■Flujo de trabajo de molde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 208

■Flujo de trabajo de exportación/importación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209

Nota: Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en

esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR

System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o

seleccionando Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne).

Apéndice A Flujos de trabajo alternativos para el experimento

Flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada)

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

206

Notas

Flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada)

Si crea un experimento de curva estándar relativa o CT comparativos (∆∆CT) con el flujo

de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) del software StepOne™, puede

configurar el experimento de acuerdo con su criterio.

1. Configure un nuevo experimento:

a. Haga doble clic en (acceso directo al software StepOne) o seleccione Start

(Inicio)All Programs (Todos los programas)Applied Biosystems

StepOneStepOne v2.0.

b. En la columna Set Up (Configurar), haga clic en Advanced Setup

(Configuración avanzada).

c. En el panel de navegación, haga clic en Experiment Properties

(Propiedades del experimento) (predeterminado) y, a continuación, escriba las

propiedades del experimento de ejemplo.

d. En el panel de navegación, haga clic en Plate Setup (Configuración de

placa) y, a continuación, asigne los genes diana, los estándares (sólo en

experimentos de curva estándar relativa) y las muestras.

e. En el panel de navegación, haga clic en Run Method (Protocolo de

termociclado) y, a continuación, escriba el volumen de la reacción y cambie el

perfil térmico según convenga

f. En el panel de navegación, haga clic en Reaction Setup (Configuración

de reacción) y, a continuación, revise los volúmenes calculados para las

reacciones de PCR, la dilución seriada (sólo en experimentos de curva estándar

relativa) y las diluciones de las muestras. Edítelos si es preciso.

g. (Opcional) En el panel de navegación, haga clic en Materials List (Lista

de materiales) y, a continuación, seleccione y compre los materiales que

necesite para el experimento.

2. Prepare las reacciones de PCR:

a. Prepare el molde.

b. Prepare las diluciones de las muestras.

c. Prepare la dilución seriada (sólo en experimentos de curva estándar relativa).

d. Prepare la mezcla de reacción.

e. Prepare la placa de reacción.

Apéndice A Flujos de trabajo alternativos para el experimento

Flujo de trabajo QuickStart (Inicio rápido)

207

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

3. Realice el experimento:

a. Cargue el instrumento.

b. Inicie el proceso

c. Descargue el instrumento.

4. Analice los datos.

Flujo de trabajo QuickStart (Inicio rápido)

Si crea un experimento de curva estándar relativa o CT comparativos con el flujo de

trabajo QuickStart (Inicio rápido), puede procesar las reacciones en el instrumento sin

ninguna información sobre la configuración de la placa.

1. Prepare las reacciones de PCR:

a. Prepare el molde.

b. Prepare las diluciones de las muestras.

c. Prepare la dilución seriada (sólo en experimentos de curva estándar relativa).

d. Prepare la mezcla de reacción.

e. Prepare la placa de reacción.

2. Inicie rápidamente el experimento:

a. Haga doble clic en (acceso directo al software StepOne) o seleccione Start

(Inicio)All Programs (Todos los programas)Applied

BiosystemsStepOneStepOne v2.0.

b. En la pantalla Run (Proceso), haga clic en QuickStart (Inicio rápido).

c. Seleccione la ficha Experiment Properties (Propiedades del experimento) y, a

continuación, escriba las propiedades del experimento.

d. Seleccione la ficha Run Method (Protocolo de termociclado) y, a

continuación, escriba el volumen de la reacción y cambie el perfil térmico

según convenga

3. Realice el experimento:

a. Cargue el instrumento.

b. Inicie el proceso.

c. Descargue el instrumento.

4. Complete la configuración de la placa.

5. Analice los datos.

Apéndice A Flujos de trabajo alternativos para el experimento

Flujo de trabajo de molde

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

208

Notas

Flujo de trabajo de molde

Si crea un molde para un experimento de curva estándar relativa o CT comparativos,

puede configurar muchos experimentos con la misma información de configuración.

1. Cree un molde:

a. Haga doble clic en (acceso directo al software StepOne) o seleccione Start

(Inicio)All Programs (Todos los programas)Applied Biosystems

StepOneStepOne v2.0.

b. Abra un experimento existente o cree uno nuevo tal y como se describe en el

Capítulo 2 o Capítulo 6.

c. Seleccione File (Archivo)Save As Template (Guardar como molde).

d. En el cuadro de diálogo Save As Template (Guardar como molde), escriba un

nombre de archivo y, a continuación, haga clic en Save (Guardar) para guardar

el molde.

e. Haga clic en Close (Cerrar).

2. Cree un experimento utilizando el molde:

a. Si aún no está en la pantalla Home (Inicio), haga clic en Home (Inicio).

b. En la columna Set Up (Configurar), haga clic en Template (Molde).

c. En el cuadro de diálogo Open (Abrir), seleccione el molde que ha creado en el

paso 1.

d. Modifique el experimento con las herramientas del flujo de trabajo Advanced

Setup (Configuración avanzada).

e. Haga clic en Save (Guardar), escriba un nombre de archivo y, a

continuación, haga clic en Save (Guardar) para guardar el experimento.

3. Prepare las reacciones de PCR:

a. Prepare el molde.

b. Prepare las diluciones de las muestras.

c. Prepare la dilución seriada (sólo en experimentos de curva estándar relativa).

d. Prepare la mezcla de reacción.

e. Prepare la placa de reacción.

Apéndice A Flujos de trabajo alternativos para el experimento

Flujo de trabajo de exportación/importación

209

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Notas

4. Realice el experimento:

a. Cargue el instrumento.

b. Inicie el proceso.

c. Descargue el instrumento.

5. Analice los datos.

Flujo de trabajo de exportación/importación

Si crea un experimento de curva estándar relativa o CT comparativos con el flujo de

trabajo de exportación/importación, puede configurar un experimento nuevo con los

datos exportados desde otros experimentos.

1. Haga doble clic en (acceso directo al software StepOne) o seleccione Start

(Inicio)All Programs (Todos los programas)Applied Biosystems

StepOneStepOne v2.0.

2. Abra un experimento existente o cree uno nuevo tal y como se describe en el

Capítulo 2 o el Capítulo 6.

3. Mientras el experimento está abierto, exporte la información de configuración:

a. Seleccione File (Archivo)Export (Exportar).

b. En la ficha Export Properties (Propiedades de exportación), seleccione Setup

(Configuración).

c. Seleccione One File (Un archivo) en el menú desplegable.

d. Seleccione (*.txt) en el menú desplegable File Type (Tipo de archivo).

e. Seleccione Open file(s) when export is complete (Abrir archivos cuando

termine la exportación).

f. Haga clic en Start Export (Iniciar exportación) y, a continuación, haga clic en

Close Export Tool (Cerrar herramienta de exportación) cuando se le solicite.

Apéndice A Flujos de trabajo alternativos para el experimento

Flujo de trabajo de exportación/importación

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

210

Notas

4. Utilice el archivo exportado como molde y cree la configuración de placa deseada:

a. Con una aplicación de hojas de cálculo (por ejemplo, el software Microsoft®

Excel), abra el archivo de texto exportado.

b. Sustituya los parámetros del archivo de texto según convenga Cuando haya

terminado, guarde el archivo en un formato de texto delimitado por

tabuladores.

¡IMPORTANTE! El archivo de texto debe tener el formato correspondiente al

formato de la disposición de la placa del software StepOne. Para obtener más

información acerca del formato de disposición de la placa, acceda a la ayuda

haciendo clic en en la barra de herramientas o seleccionando Help

(Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne).

5. Si aún no está en la pantalla Home (Inicio), haga clic en Home (Inicio).

6. En la columna Set Up (Configurar), haga clic en Advanced Setup

(Configuración avanzada).

7. Información de configuración de la importación:

a. Seleccione File (Archivo)Import (Importar).

b. Haga clic en Browse (Examinar), seleccione el archivo *.txt que ha creado en

el paso 4 y, a continuación, haga clic en Select (Seleccionar).

c. Haga clic en Start Import (Iniciar importación).

8. Prepare las reacciones de PCR:

a. Prepare el molde.

b. Prepare las diluciones de las muestras.

c. Prepare la dilución seriada (sólo en experimentos de curva estándar relativa).

d. Prepare la mezcla de reacción.

e. Prepare la placa de reacción.

9. Realice el experimento:

a. Cargue el instrumento.

b. Inicie el proceso.

c. Descargue el instrumento.

10. Analice los datos.

211

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Bibliografía

Kwok, S. and Higuchi, R. 1989. Avoiding false positives with PCR. Nature

339:237–238.

Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F., et al. 1985. Enzymatic amplification of β-globin

genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.

Science 230:1350–1354.

Bibliografía

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

212

213

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Glosario

AIF Abreviatura de archivo de información de ensayo (Assay Information File).

alelo Para unun gen dianaa diana determinado, cualquiera de las diferentes secuencias que

aparecen en la población.

amplicón Segmento de DNA amplificado durante la PCR.

amplificación Etapa del protocolo de termociclado, durante el cual se produce la generación del

amplicón. En los experimentos de cuantificación, los datos de fluorescencia recogidos

durante la amplificación se muestran en una gráfica de amplificación y se utilizan para

calcular los resultados. Si la amplificación está incluida en el proceso del instrumento

StepOne™ para experimentos de genotipado o presencia/ausencia, los datos de

fluorescencia recogidos durante la amplificación se muestran en una gráfica de

amplificación y se pueden utilizar para solucionar problemas.

apantallador Molécula unida al extremo de 3′ de las sondas TaqMan® para evitar que el notificador

emita una señal de fluorescencia mientras la sonda está intacta. Con los reactivos

TaqMan®, se puede utilizar un apantallador no fluorescente de unión al surco menor de la

doble hélice del DNA (NFQ-MGB). Con reactivos SYBR Green, no se utiliza ningún

apantallador.

¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo TAMRA™

como notificador o apantallador con el sistema StepOne™.

apantallador no

fluorescente de

unión al surco

menor de cadena

de DNA (NFQ-MGB)

Moléculas que están unidas al extremo de 3′ de las sondas TaqMan®. Si la sonda está

intacta, el apantallador no fluorescente (NFQ) evita que el fluorocromo del notificador

emita una señal de fluorescencia. Dado que el NFQ no emite ninguna fluorescencia,

produce señales de fondo más bajas, lo que se deriva en una mayor precisión en la

cuantificación. El ligando de unión de surco menor (MGB) aumenta la temperatura de

desnaturalización (Tm) sin aumentar la longitud de la sonda. También permite el diseño

de sondas más cortas.

archivo de

información de

ensayo (AIF)

Archivo de datos del CD que se incluye con cada pedido de ensayo. El nombre de archivo

incluye el número del código de barras de la placa. La información del AIF se incluye en

un formato delimitado por tabuladores.

asistente de diseño Función del software StepOne™ que le ayuda a configurar el experimento guiándole a

través de los procedimientos óptimos para comenzar el diseño del experimento.

DNA de muestra

(10✕)Componente de reacción que se muestra en la pantalla Reaction Setup (Configuración de

la reacción). El software asume que el DNA de muestra que se añade a la mezcla de

reacción está en una concentración del 10✕. Por ejemplo, si el volumen de la reacción es

de 20 µL, el volumen calculado de la muestra de la reacción 1 es 2 µL.

Glosario

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

214

Auto∆Opción para aumentar o reducir la temperatura y/o el tiempo en los ciclos subsiguientes

de la reacción de PCR. Cuando Auto∆ está habilitado, las opciones se indican por medio

de un icono en el perfil térmico:

•Auto∆ activado:

•Auto∆ desactivado:

biblioteca de

ensayos SNP Recogida de ensayos SNP en el software StepOne™.

biblioteca de genes

diana Recogida de genes diana en el software StepOne™.

biblioteca de

muestras Recogida de las muestras en el software StepOne™. La biblioteca de muestras contiene el

nombre de la muestra y el color de la muestra.

calibración espacial Tipo de calibración del sistema StepOne™ en el que el sistema asigna las posiciones de

los pocillos en el bloque. Los datos de la calibración espacial se utilizan para que el

software pueda asociar aumentos de la fluorescencia durante una reacción con pocillos

específicos de la placa de reacción.

calibrador Véase muestra de referencia.

cantidad En los experimentos de cuantificación, la cantidad de gen diana en las muestras. La

cantidad absoluta puede referirse al número de copias, la masa, la molaridad o la carga

viral. La cantidad relativa se refiere a la diferencia entre la cantidad de gen diana

normalizada en la muestra y la cantidad de gen diana normalizada en la muestra de

referencia.

cantidad estándar Cantidad conocida de la reacción de PCR.

• En los experimentos de curva estándar, la muestra de concentración conocida de

gen diana. Las unidades de la cantidad estándar pueden ser la masa, el número de

copias, la carga viral u otras unidades para medir la cantidad del gen diana.

• En los experimentos de curvas estándar relativas, la muestra de concentración

conocida en el estándar. Por ejemplo, la cantidad estándar puede referirse a la

cantidad de cDNA o la cantidad de solución de partida. Las unidades no son

relevantes en los experimentos de curvas estándar relativas, porque se compensan o

simplifican en los cálculos.

cantidad inicial Cuando se define una curva estándar o una dilución seriada, se corresponde con la

cantidad mayor o menor de partida.

cantidad

normalizada Cantidad de gen diana dividida por la cantidad de control endógeno.

cebador directo Oligonucleótido que flanquea el extremo de 5′ del gen diana. El cebador reverso y el

cebador directo se utilizan juntos en las reacciones de PCR para amplificar el gen diana.

cebador reverso Oligonucleótido que flanquea el extremo de 3′ del gen diana. El cebador reverso y el

cebador directo se utilizan juntos en las reacciones de PCR para amplificar el gen diana.

Glosario

215

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

ciclo umbral (CT)Número del ciclo de la PCR en el que ∆Rn corta el umbral en la gráfica de amplificación.

coeficientes de

regresión Valores calculados a partir de la línea de regresión de las curvas estándar, incluido el valor

R2, la pendiente y el punto de intersección y. Los valores del coeficiente de regresión se

pueden utilizar para evaluar la calidad de los resultados a partir de los estándares. Véase

también curva estándar.

color de gen diana Color asignado a un gen diana para identificarlo en la disposición de la placa y las

gráficas de análisis.

Concentración de

muestra diluida

(10X para la mezcla

de reacción)

Campo del software que aparece en la ficha Sample Dilution Calculations (Cálculos de

dilución de las muestras) de la pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción). En

este campo, escriba la concentración de la muestra que desea utilizar para añadir a la

mezcla de reacción de todas las muestras del experimento. "10✕ for Reaction Mix" (10X

para la mezcla de reacción) significa que el software asume que la muestra o el

componente estándar de la mezcla de reacción tiene una concentración del 10✕. Por

ejemplo, si la concentración de las muestras diluidas es 50,0 ng/µL (10✕), la

concentración de la muestra final de la reacción es 5 ng/µL (1✕).

configuración

avanzada Función del software StepOne™ que permite configurar el experimento de acuerdo con el

diseño de dicho experimento.

control endógeno Diana que debería tener un nivel de expresión similar en todas las muestras que se están

probando. Se utiliza en experimentos de curva estándar relativa y CT comparativos (∆∆CT)

para normalizar las señales de fluorescencia del gen diana que se está cuantificando.

También se conoce como gen de mantenimiento.

control interno

positivo (IPC) En los experimentos de presencia/ausencia, un molde de DNA sintético corto que se

añade a las reacciones de PCR. Se puede utilizar el IPC para distinguir los falsos negativos

en las reacciones afectadas por los apantalladores de PCR, una configuración incorrecta

del ensayo o un fallo del reactivo o del instrumento.

control negativo

(NTC) En los experimentos del sistema StepOne™, tarea asignada a los genes diana o los ensayos

de SNP en los pocillos que contienen agua o tampones en lugar de un molde de las

muestras. En los pocillos de control negativo, no se debería producir ninguna

amplificación del gen diana.

control positivo En los experimentos de genotipado, la tarea del ensayo de SNP en pocillos que contienen

una muestra con un genotipo conocido.

CTAbreviatura de ciclo umbral (Threshold Cycle).

CT automático Opción de análisis en la que el software calcula de manera automática el umbral y la línea

basal de la gráfica de amplificación. El software utiliza la línea basal y el umbral para

calcular el ciclo umbral (CT).

CT manual Opción de análisis en la que se introduce el valor del umbral y se selecciona si se desean

utilizar cálculos de línea basal automáticos o manuales. El software utiliza el valor del

umbral que se introduce y la línea basal para calcular el ciclo umbral (CT).

Glosario

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

216

curva de

disociación Visualización de los datos recogidos durante la fase de la curva de disociación. Los picos

de la curva de disociación pueden indicar la temperatura de desnaturalización (Tm) del

gen diana o pueden identificar la presencia de amplificaciones no específicas. La curva

de disociación se puede ver como fluorescencia del notificador normalizado (Rn) y la

temperatura o como la derivada de la fluorescencia del notificador normalizada (−Rn′) vs

la temperatura.

curva estándar En los experimentos de curva estándar y curva estándar relativa:

• La línea con un ajuste óptimo que resulta al representar los valores CT frente a las

cantidades conocidas del estándar. Véase también línea de regresión.

• Conjunto de estándares que contiene una serie de cantidades conocidas. Los datos

de las reacciones de la curva estándar se utilizan para generar la curva estándar. La

curva estándar se define por el número de puntos de la serie, el número de réplicas

estándar, la cantidad inicial y el factor de dilución. Véase también dilución seriada

del estándar.

delta Rn (∆Rn)Abreviatura de notificador normalizado con línea basal corregida (baseline-corrected

normalized reporter).

desconocidos En los experimentos de cuantificación, la tarea del gen diana en pocillos que contienen

una muestra con cantidades de gen diana desconocidas.

En los experimentos de genotipado, la tarea del ensayo de SNP en pocillos que contienen

una muestra con un genotipo desconocido.

En los experimentos de presencia/ausencia, la tarea del gen diana en pocillos que

contienen una muestra en la que no se conoce la presencia del gen diana.

diana La secuencia de ácido nucleico que se desea amplificar y detectar.

dilución seriada En los experimentos de curvas estándar y curvas estándar relativas, conjunto de normas

que contienen una serie de cantidades conocidas. La dilución seriada se prepara por medio

de estándares de dilución en serie. Por ejemplo, la solución de partida estándar se utiliza

para preparar el primer punto de dilución, el primer punto de dilución se utiliza para

preparar el segundo punto de dilución, etc. Los volúmenes necesarios para preparar una

dilución seriada se calculan mediante el número de puntos de dilución, el número de

réplicas estándar, la cantidad inicial, el factor de dilución y la concentración del estándar

en la solución de partida. Véase también curva estándar.

disolvente Reactivo utilizado para diluir una muestra o estándar antes de añadirlo a la reacción de

PCR. El disolvente puede ser agua o un tampón.

disposición de

placa Ilustración de la rejilla de 6 ×8 pocillos y contenido asignado a la placa de reacción. En

el software, puede utilizar la disposición de la placa como una herramienta de selección

para asignar el contenido de los pocillos, ver las asignaciones de los pocillos y ver los

resultados. La disposición de la placa se muestra en las pantallas Design Wizard

(Asistente de diseño), Advanced Setup (Configuración avanzada), de reacción y de

análisis. La disposición de la placa se puede imprimir, incluir en un informe, exportar y

guardar como una diapositiva para una presentación.

Glosario

217

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

disposición

autónoma Disposición del sistema en la que el instrumento StepOne™ no está conectado a un

ordenador por medio del cable amarillo del sistema StepOne™. En su lugar, se utiliza una

unidad USB ( ) para transferir datos entre los componentes del sistema StepOne™. En

esta disposición, el instrumento StepOne™ se controla por medio de la pantalla táctil del

instrumento.

disposición

conectada Disposición del sistema en la que el instrumento StepOne™ está conectado directamente

a un ordenador conectado por medio del cable del sistema StepOne™ amarillo. En esta

disposición, el instrumento StepOne™ está controlado por medio del software StepOne™

del ordenador conectado.

EFF% Véase eficiencia de amplificación (EFF%).

eficiencia de

amplificación

(EFF%)

Cálculo de la eficiencia de la amplificación de la PCR. La eficiencia de la amplificación

se calcula utilizando la pendiente de la línea de regresión de la curva estándar. Una

pendiente próxima al −3,3 indica una eficiencia de amplificación de la PCR óptima del

100%. Factores que afectan a la eficiencia de la amplificación:

•Rango de cantidades estándar: para obtener medidas de la eficiencia más exactas

y precisas, utilice un amplio rango de cantidades estándar, de 5 a 6 órdenes de

magnitud (multiplicado por 105 a 106).

•Número de réplicas estándar: para obtener mediciones de la eficiencia más

precisas, incluya réplicas para reducir los efectos de las imprecisiones del pipeteo.

•Apantalladores de la PCR: los apantalladores de la PCR en la reacción pueden

reducir la eficiencia de la amplificación.

ensayo En el sistema StepOne™, reacción de PCR que contiene cebadores para amplificar un gen

diana y una sonda para detectar el gen diana amplificado.

mezcla de ensayos Componente de reacción de PCR de los Applied Biosystems TaqMan® Gene Expression

Assays y los TaqMan® SNP Genotyping Assays que consta de cebadores diseñados para

amplificar un gen diana y una sonda TaqMan® diseñada para detectar la amplificación del

gen diana.

ensayo SNP Se utiliza en los experimentos de genotipado. Es una reacción de PCR que contiene

cebadores para amplificar el SNP y dos sondas para detectar diferentes alelos.

ensayos bajo

pedido Los ensayos TaqMan® que se fabrican cuando se solicitan. Sólo se envían los ensayos que

cumplen las especificaciones de control de calidad de la fabricación.

ensayos en

inventario Ensayos TaqMan® fabricados previamente, que cumplen las especificaciones de control

de calidad y que se guardan en el inventario.

estándar Muestra que contiene cantidades estándar conocidas. Las reacciones estándar se utilizan

en experimentos de cuantificación para generar curvas estándar. Véase también curva

estándar y dilución seriada del estándar.

Glosario

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

218

experimento Se refiere al proceso completo de realización de una reacción con el sistema StepOne™,

incluida la configuración, el proceso y el análisis. Tipos de experimentos que se pueden

realizar con el sistema StepOne™:

• Cuantificación : curva estándar

• Cuantificación : curva estándar relativa

• Cuantificación: CT comparativos (∆∆CT)

• Curva de disociación

• Genotipado

•Presencia/ausencia

experimento de

punto final Experimento en el que los datos de fluorescencia que se recogen en una lectura a punto

final se utilizan para calcular resultados para experimentos de genotipado o

presencia/ausencia.

factor de dilución Valor numérico que define la secuencia de cantidades en la curva estándar. El factor de

dilución y la cantidad inicial sirven para calcular la cantidad estándar de cada punto de la

curva estándar. Por ejemplo, si la curva estándar se define con un factor de dilución de

1:10 o 10, la diferencia entre 2 puntos adyacentes cualquiera en la curva se multiplica por

10.

fase Componente del perfil térmico. Una fase consta de uno o varios pasos.

fase cíclica Fase del perfil térmico que se repite. Si la fase cíclica se utiliza para realizar la PCR, se

denomina fase de amplificación.

fase de curva de

disociación Fase del perfil térmico con un incremento de temperatura para generar una curva de

disociación.

fase de espera Fase del perfil térmico que incluye uno o varios pasos. Por ejemplo, puede añadir una fase

de espera al perfil térmico para activar enzimas, para desactivar enzimas o para incubar

una reacción.

fluorocromo del

sistema Fluorocromo fabricado por Applied Biosystems y precalibrado en el sistema StepOne™.

Fluorocromos del sistema:

•Fluorocromo FAM

™

•Fluorocromo JOE

™

•Fluorocromo ROX

™

• Fluorocromo SYBR® Green

•Fluorocromo VIC

¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo TAMRA™

como notificador o apantallador con el sistema StepOne™.

Glosario

219

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

fluorocromo

personalizado Fluorocromo que no fabrica Applied Biosystems. Puede utilizar fluorocromos

personalizados para realizar experimentos de PCR a tiempo real en el sistema StepOne™.

Antes de utilizar fluorocromos personalizados, realice una calibración del fluorocromo

personalizado.

¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo TAMRA™

como notificador o apantallador con el sistema StepOne™.

fluorocromo puro Reactivo que contiene el fluorocromo fluorescente. Los fluorocromos puros se utilizan

para realizar una calibración de fluorocromo puro en el sistema StepOne™. Véase también

fluorocromo del sistema.

gen de

mantenimiento Véase control endógeno.

gráfica de

amplificación Visualización de los datos recogidos durante la fase cíclica de la amplificación de la PCR.

Se puede ver como:

• Notificador normalizado con línea basal corregida (∆Rn) frente al ciclo

• Notificador normalizado (Rn) frente al ciclo

• Ciclo umbral (CT) frente al pocillo

gráfica de datos

brutos Visualización del incremento de la fluorescencia de los pocillos seleccionados de todos

los filtros. Muestra el incremento de la fluorescencia de todos los puntos de recogida de

datos de la reacción.

gráfica de

discriminación de

alelos

Visualización de los datos recogidos durante la lectura a punto final. La gráfica de

discriminación de alelos es una gráfica de la señal del notificador normalizada procedente

de la sonda del alelo 1 que se ha trazado a partir de la señal del notificador normalizada

procedente de la sonda del alelo 2.

gráfica de

temperatura Visualización de temperaturas de la muestra, la cubierta del instrumento y el bloque de

instrumento durante el proceso del instrumento.

gráfica

multicomponente Visualización de los datos recogidos durante la fase cíclica de la PCR a tiempo real. La

gráfica multicomponente muestra la fluorescencia de todos los ciclos de la reacción.

grupo de réplicas Conjunto de reacciones idénticas de un experimento.

identificador de

ensayo Valor o código asignado por Applied Biosystems a los TaqMan® Gene Expression Assays

y los TaqMan® SNP Genotyping Assays.

identificador

refSNP Número que identifica el identificador de agrupamiento de SNP (refSNP) de referencia.

Lo genera dbSNP (Single Nucleotide Polymorphism Database of Nucleotide Sequence

Variation o Base de datos de polimorfismos nucleótidos únicos de variación de secuencia

nucleótida). Se puede utilizar para buscar en el almacén de Applied Biosystems un

Applied Biosystems SNP Genotyping Assay. También se denomina número rs.

inhibidor del IPC Reactivo añadido a las reacciones de PCR para bloquear la amplificación del control

positivo interno (IPC).

Glosario

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

220

intersección y Coeficiente de regresión calculado a partir de la línea de regresión de la curva estándar. La

intersección y indica el ciclo umbral esperado (CT) para una muestra con una cantidad

igual a 1 (por ejemplo, 1 ng/µL).

IPC Abreviatura de control positivo interno (Internal Positive Control). Además, en los

experimentos de presencia/ausencia, es la tarea del gen diana de IPC en pocillos que

contiene el molde de IPC.

IPC bloqueado En los experimentos de presencia/ausencia, tarea asignada al gen diana de IPC en los

pocillos que contienen un agente de bloqueo de IPC en lugar de una muestra. Véase

también pocillos de IPC bloqueados por control negativo.

IPC+ Llamada de presencia/ausencia cuando el control interno positivo (IPC) es correcto.

lectura a punto final Se utiliza en los experimentos de genotipado y presencia/ausencia. Es la parte del proceso

del instrumento que se produce después de la amplificación. En los experimentos de

genotipado, los datos de fluorescencia que se recogen durante la lectura a punto final se

muestran en la gráfica de discriminación de alelos y se utilizan para asignar genotipos. En

los experimentos de presencia/ausencia, los datos de fluorescencia que se recogen durante

la lectura a punto final se muestran en la gráfica de presencia/ausencia, y se utilizan para

detectar la presencia o ausencia de la diana.

lectura previa a la

PCR Se utiliza en los experimentos de genotipado y presencia/ausencia. Es la parte del proceso

del instrumento que se produce antes de la amplificación. Los datos de fluorescencia que

se recogen durante la lectura previa a la PCR se utilizan para normalizar los datos de

fluorescencia a tiempo final.

línea basal En la gráfica de amplificación, línea ajustada a los niveles de fluorescencia de un rango

de ciclos definido. Si se utiliza una opción de análisis de línea basal manual, Applied

Biosystems recomienda seleccionar los primeros ciclos de la PCR para determinar la línea

basal.

línea basal

automática Opción de análisis en la que el software calcula los ciclos inicial y final de la línea basal

para la gráfica de amplificación. El software utiliza la línea basal y el umbral para calcular

el ciclo umbral (CT).

línea basal manual Opción de análisis en la que se introducen los ciclos inicial y final de la línea basal para

la gráfica de amplificación. El software utiliza la línea basal y el umbral para calcular

valores CT

línea de regresión En los experimentos de curva estándar y curva estándar relativa, la línea que mejor se

ajusta a partir de la curva estándar. Fórmula de la línea de regresión:

CT = m [registro (Cant)] + b

donde m es la pendiente, b es el punto de intersección y, y Cant es la cantidad estándar.

Véase también coeficientes de regresión.

método CT

comparativos

(∆∆CT)

Método de cuantificación para experimentos de cuantificación. Con el método CT

comparativos (∆∆CT), se utilizan los resultados de una muestra de referencia y un control

endógeno para determinar cantidades relativas de un gen diana en las muestras.

Glosario

221

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

método de

cuantificación En los experimentos de cuantificación, el método que se utiliza para determinar la

cantidad de gen diana en las muestras. En los experimentos de cuantificación, hay tres

tipos de métodos de cuantificación disponibles: curva estándar, CT comparativos (∆∆CT)

y curva estándar relativa.

método de curva

estándar Método de cuantificación para experimentos de cuantificación. Con el método de curva

estándar, los resultados de los estándares se utilizan para determinar cantidades absolutas

de un gen diana en las muestras.

método de la curva

estándar relativa Método de cuantificación para experimentos de cuantificación. Con el método de la curva

estándar relativa, se utilizan los resultados de los estándares, una muestra de referencia y

un control endógeno para determinar las cantidades relativas de un gen diana en las

muestras.

mezcla de cebador Componente de reacción de PCR que contiene el cebador directo y el cebador reverso

diseñados para amplificar el gen diana.

mezcla de

cebador/sonda Componente de reacción de PCR que consta de cebadores diseñados para amplificar el

gen diana y una sonda TaqMan® diseñada para detectar la amplificación del gen diana.

mezcla de reacción Solución que contiene todos los componentes necesarios para procesar la reacción de

PCR, excepto el molde (de muestra, estándar o de control).

mezcla de sondas Componente de reacción de PCR que contiene una sonda TaqMan® diseñada para detectar

la amplificación del gen diana.

molde Tipo de ácido nucleico que se añade a la reacción de PCR. El molde recomendado varía

en función del tipo de experimento.

monitorización

remota Función del software que permite ver el estado de un instrumento en red, enviar

experimentos al instrumento y descargar experimentos del instrumento en el ordenador.

muestra El molde que se está amplificando.

muestra de

referencia En experimentos de curva estándar relativa y CT comparativos (∆∆CT), la muestra a la que

se refieren los resultados cuantitativos relativos. También se denomina calibrador.

Muestra estándar

(10✕)Componente de reacción que se muestra en la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos

de la muestra de reacción) de la pantalla Reaction Setup (Configuración de la reacción).

El software asume que la muestra o el estándar que se añade a la mezcla de reacción está

en una concentración del 10✕. Por ejemplo, si el volumen de la reacción es de 20 µL, el

volumen calculado de la muestra o estándar de la reacción 1 es 2 µL.

nombre de

experimento Introducido durante la configuración del experimento, es el nombre que se utiliza para

identificar el experimento. Los nombres de los experimentos no pueden superar los 100

caracteres y no pueden incluir ninguno de los siguientes caracteres: barra inclinada hacia

delante (/), barra inclinada hacia atrás (\), signo mayor que (>), signo menor que (<),

asterisco (*), signo de interrogación (?), comillas ("), línea vertical (|), dos puntos (:) o

punto y coma (;).

notificador Fluorocromo fluorescente que se utiliza para detectar la amplificación. Si se utilizan

reactivos TaqMan®, el fluorocromo del notificador se une al extremo de 5′. Si se utilizan

reactivos SYBR® Green, el fluorocromo del notificador es SYBR® Green.

Glosario

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

222

notificador

derivado (−Rn′)Se muestra en el eje y de la curva de disociación. La señal del notificador derivado es el

opuesto de la primera derivada de la fluorescencia normalizada del notificador.

notificador

normalizado (Rn) Señal de fluorescencia que emite el fluorocromo del notificador normalizado a la señal

de fluorescencia de la referencia pasiva.

notificador

normalizado con

línea basal

corregida (∆Rn)

La magnitud de la señal de fluorescencia normalizada que genera el notificador durante

la amplificación de la PCR.

∆Rn = Rn (punto final) − Rn (línea basal), donde Rn = notificador normalizado.

número rs Véase identificador refSNP.

omitir pocillo Acción que se realiza después del análisis para omitir uno o varios pocillos de todos los

análisis antes de volver a analizar los datos.

pantalla táctil Visor del instrumento que se toca para controlarlo.

paso Componente del perfil térmico. Los pasos se definen por la temperatura, el tiempo, la

rampa y el estado de recogida de datos. En los ciclos, los pasos también se definen por

medio del estado Auto∆.

PCR a tiempo real Proceso de recogida de datos de fluorescencia durante la amplificación de la PCR. Los

datos de la PCR a tiempo real sirven para calcular los resultados de los experimentos de

cuantificación o para solucionar los problemas de los resultados de los experimentos de

genotipado o presencia/ausencia.

pendiente Coeficiente de regresión calculado a partir de la línea de regresión de la curva estándar.

La pendiente indica la eficiencia de la amplificación de la PCR para el ensayo. Una

pendiente de −3,3 indica una eficiencia de amplificación del 100%. Véase también

eficiencia de amplificación (EFF%).

perfil térmico Parte de un protocolo de termociclado que especifica la temperatura, el tiempo, la rampa

y los puntos de recogida de datos de todos los pasos y fases del proceso del instrumento.

pocillos de IPC de

control negativo En los experimentos de presencia/ausencia, pocillos que contienen un molde de IPC y un

tampón o agua en lugar de una muestra en la reacción de PCR. El molde de IPC es lo único

que se debería amplificar en los pocillos de IPC de control negativo, porque la reacción

no contiene ninguna muestra. Véase también IPC+.

pocillos de IPC de

control negativo

bloqueado

En los experimentos de presencia/ausencia, pocillos que contienen un agente de bloqueo

del IPC en lugar de una muestra en la reacción de PCR. No se debería producir ninguna

amplificación en los pocillos de IPC de control negativo bloqueado, porque la reacción no

contiene ninguna muestra y la amplificación del IPC está bloqueada. También se

denomina "sin control de amplificación” (NAC).

protocolo de

termociclado Definición del volumen de reacción y el perfil térmico del proceso del instrumento.

punto Un estándar en una curva estándar. La cantidad estándar de cada punto de la curva

estándar se calcula en base a la cantidad inicial y el factor de dilución.

Glosario

223

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

QuickStart (Inicio

rápido) Función del sistema StepOne™ que permite realizar el experimento sin introducir la

información de configuración de la placa.

química Véase reactivos.

rampa La velocidad a la que cambia la temperatura durante el proceso del instrumento. Excepto

en el caso del paso de la curva de disociación, la rampa se define como un porcentaje. En

el caso del paso de la curva de disociación, la rampa se define como un incremento de la

temperatura. En el gráfico del perfil térmico, la rampa se indica por medio de una línea

diagonal.

reacción de la

muestra/diana Combinación de la muestra y el ensayo diana en una reacción de PCR. En el asistente de

diseño, cada reacción de PCR sólo puede contener una muestra y un ensayo diana.

reacción del ensayo

SNP/muestra Combinación de la muestra y el ensayo SNP en una reacción de PCR. Cada reacción de

PCR sólo puede contener una muestra y un ensayo SNP.

reactivos Los componentes de la reacción de PCR que se está utilizando para amplificar el gen

diana y detectar la amplificación. Tipos de reactivos utilizados en el sistema StepOne™:

• Reactivos TaqMan®

• Reactivos SYBR® Green

• Otros reactivos

reactivos SYBR®

Green Componente de reacción de PCR que consta de dos cebadores que están diseñados para

amplificar el gen diana y el fluorocromo SYBR® Green para detectar DNA de doble

cadena.

reactivos TaqMan®Componentes de reacción de PCR que constan de cebadores diseñados para amplificar el

gen diana y una sonda TaqMan® diseñada para detectar la amplificación del gen diana.

rechazar pocillo Acción que realiza el software durante el análisis para quitar uno o varios pocillos de un

análisis posterior si se aplica un aviso específico al pocillo.

recogida de datos Proceso durante la utilización del instrumento en el que un componente del instrumento

detecta datos de fluorescencia en cada pocillo de la placa de reacción. El instrumento

transforma la señal en datos electrónicos y los datos se guardan en el archivo del

experimento. Los puntos de recogida de datos se indican por medio de un icono en el

perfil térmico:

• Recogida de datos activada:

• Recogida de datos desactivada:

referencia pasiva Fluorocromo que produce una señal de fluorescencia. Dado que la señal de referencia

pasiva debería ser uniforme en todos los posillos, se utiliza para normalizar la señal del

fluorocromo del notificador para justificar las fluctuaciones de fluorescencias causadas

por diferencias menores entre pocillos en concentraciones o en volumen. La

normalización de la señal de referencia pasiva permite obtener datos de gran precisión.

réplicas Número total de reacciones idénticas que contienen componentes idénticos y volúmenes

idénticos.

Glosario

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

224

retrotranscriptasa Componente de reacción de PCR que convierte el RNA en cDNA. La retrotranscriptasa

se añade a la reacción de PCR para realizar un RT-PCR de 1 paso.

RnAbreviatura de notificador normalizado (Normalized Reporter).

serie Véase dilución seriada.

sin control de

amplificación (NAC) Véase también pocillos de IPC de control negativo bloqueado.

sin control de

molde (NTC) Véase control negativo (NTC).

SNP Abreviatura de polimorfismo de nucleótido único (Single Nucleotide Polymorphism). El

SNP puede constar de una diferencia base o una indel (inserción/deleción).

tarea Tipo de reacción realizada en el pocillo para el gen diana o el ensayo SNP. Tareas

disponibles en los experimentos del sistema StepOne™:

• Desconocida

• Control negativo

• Estándar (experimentos de curvas estándar y curvas estándar relativas)

• Control positivo (experimentos de genotipado)

• IPC (experimentos de presencia/ausencia)

• IPC bloqueado (experimentos de presencia/ausencia)

temperatura de

desnaturalización

(Tm)

Punto en la curva de disociación en el que se produce un pico en los niveles de

fluorescencia que sirve para indicar que el DNA de doble cadena amplificado se disocia

en DNA de cadena sencilla.

tipo de experimento El tipo de experimento que se realiza con el sistema StepOne™:

• Curva estándar

•C

T comparativos (∆∆CT)

• Curva estándar relativa

• Curva de disociación (no disponible en el asistente de diseño)

• Genotipado

•Presencia/ausencia

El tipo de experimento que seleccione afecta a las pantallas de configuración, perfil de

reacción y análisis.

Tm Abreviatura de temperatura de desnaturalización (Tm o Melting Temperature).

umbral Nivel de fluorescencia por encima de la línea basal y dentro de la región de crecimiento

exponencial de la gráfica de amplificación. El umbral se puede determinar

automáticamente (véase CT automático) o se puede ajustar manualmente (véase CT

manual).

umbral del ciclo Véase ciclo umbral (CT).

Glosario

225

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

valor atípico Para un conjunto de datos, un punto de dato que es significativamente más pequeño o

grande que los demás.

valor R2Coeficiente de regresión calculado a partir de la línea de regresión de la curva estándar.

El valor R2 indica la proximidad del ajuste entre la línea de regresión de la curva estándar

y los puntos de datos CT individuales de las reacciones estándar. El valor 1,00 indica un

ajuste perfecto entre la línea de regresión y los puntos de datos.

velocidad de la

rampa Velocidad a la que se produce la rampa de temperatura durante el proceso del instrumento.

Las velocidades de rampa disponibles son rápida y estándar.

Glosario

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

226

227

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

Índice

ADVERTENCIA, descripción xi

analizar experimento

analizar 94, 176

directrices 95, 102, 107, 110, 115, 118, 119, 122,

123, 177, 184, 189, 195, 197, 199, 202, 204

flujo de trabajo 92, 174

omitir pocillos 118, 197

para obtener más información 103, 108, 110, 115,

118, 120, 122, 123, 184, 190, 195, 197,

200, 202, 204

publicar los datos 111, 191

ver opciones de análisis 114, 194

ver pantalla Amplification Plot (Gráfica de

amplificación) 103, 185

ver pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de

expresión de genes) 108, 182

ver pantalla Multicomponent Plot (Gráfica

multicomponente) 120, 200

ver pantalla Multiple Plots

(Múltiples gráficas) 99, 180

ver pantalla QC Summary (Resumen QC) 116, 196

ver pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos

brutos) 122, 203

ver pantalla Standard Curve (Curva estándar) 100

ver tabla de pocillos 108, 182

Applied Biosystems

asistencia técnica x

comentarios del cliente acerca de la

documentación ix

contacto x

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System.

Véase sistema StepOne.

asistencia técnica, contacto x

ayuda en línea. Consulte Sistema de ayuda

biblioteca 34, 142

biblioteca Run Method (Método de proceso) 34, 142

cargar placa de reacción 70, 170

categoría de instalación xx

categoría de sobretensión (potencia) xx

comentarios del cliente, acerca de los documentos de

Applied Biosystems ix

consejos de desplazamiento

seleccionar pocillos 98, 179

ver múltiples gráficas 99, 180

consumibles 21, 130

admitidos 3

Véase también materiales necesarios. 3

control endógeno

componente de experimento 5

pantalla Relative Quantification Settings (Opciones

de cuantificación relativa) 32, 140

seleccionar 27, 136

control negativo, componente de experimento 5, 6

convenciones utilizadas en esta guía vii

crear nuevo experimento 17, 127

datos

acerca de la recopilación de datos 2

experimento de ejemplo 9, 12, 94, 176

publicar 111, 191

transferir 87

descargar placa de reacción 87

Design Wizard (Asistente de diseño)

elementos del software 127

finalizar 46, 152

pantalla Experiment Properties (Propiedades de

experimento) 20, 129

pantalla Materials List (Lista de materiales) 43, 148

pantalla Methods & Materials (Métodos y

materiales) 22, 131

pantalla Reaction Setup (Configuración de

reacción) 35, 142

pantalla Relative Quantification Settings (Opciones

cuantificación relativa) 140

pantalla Relative Quantification Settings (Opciones

de cuantificación relativa) 32

pantalla Run Method (Método de proceso) 33, 141

pantalla Samples (Muestras) 30, 137

pantalla Standards (Estándares) 28

pantalla Targets (Dianas) 25, 135

dianas

configurar 25, 135

directrices de diseño 26, 136

dilución seriada de estándar

componente de experimento 5

preparar 55

volúmenes calculados 36, 39

diluciones de muestras

preparar 53, 158

volúmenes calculados 40, 53, 146, 159

Índice

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

228

directrices

análisis 95, 102, 107, 110, 115, 118, 119, 122, 123,

177, 184, 189, 195, 197, 199, 202, 204

diseño 21, 23, 26, 29, 32, 33, 34, 41, 45, 48, 130,

132, 136, 139, 140, 142, 147, 150, 154

eliminación de residuos químicos xix

preparación 54, 58, 60, 64, 158, 160, 162, 165

proceso 72

seguridad de residuos químicos xix

seguridad química xvii

diseñar experimento

configurar dianas 25, 135

configurar estándares 28

configurar método de proceso 33, 141

configurar muestras 30, 137

configurar opciones cuantificación relativa 140

configurar opciones de cuantificación relativa 32

crear nuevo 17, 127

definir métodos y materiales 22, 131

definir propiedades del experimento 20, 129

directrices 21, 23, 26, 29, 32, 33, 34, 41, 45, 48,

130, 132, 136, 139, 140, 142, 147, 150, 154

elementos del software 127

finalizar flujo de trabajo del asistente de diseño 46,

152

flujo de trabajo 16, 126

para obtener más información 22, 24, 27, 30, 32, 33,

34, 42, 45, 48, 131, 134, 137, 139, 141,

142, 148, 151, 154

revisar configuración de reacción 35, 142

solicitar materiales 43, 148

disposición conectada

inicio 73

supervisión 77

transferir datos 88

distribución autónoma

inicio 74

supervisión 86

supervisión remota 83

transferencia de datos remota 88

transferir datos 89

documentación, relacionada viii

eficiencia de amplificación 29, 30, 102, 103

elementos del software

Design Wizard (Asistente de diseño) 127

pantallas de análisis 96, 178

eliminación de residuos, directrices xx

ensayos en inventario 41, 147

ensayos fabricados bajo pedido 41, 147

ensayos personalizados 41, 147

ergonomía, seguridad xxii

estación de trabajo xxii

estándares

casilla de verificación Set Up Standards (Configurar

estándares) 25, 26

componente de experimento 5

configurar 28

diluir 55

directrices de diseño 29

EMC xxiii

reacciones estándar 62

seguridad xxiii

estándares de compatibilidad electromagnética.

ConsulteEstándares EMC

estándares de seguridad xxiii

estándares EMC xxiii

etiquetas de seguridad, en instrumentos xiv

experimento de CT comparativo de ejemplo

analizar 174

datos 12

descripción 11

diseño 126

flujo de trabajo 13

nombre 129

preparar 156

proceso 168

experimento de curva estándar relativa de ejemplo

analizar 92

datos 12

descripción 10

diseño 16

flujo de trabajo 13

nombre 20

preparar 50

proceso 68

experimento de DDCT. Véase experimento de CT

comparativo

experimentos de CT comparativo

acerca de 5

comparados con experimentos de curva estándar

relativa 6

experimentos de curva estándar relativa

acerca de 4

comparados con experimentos de CT comparativo 6

flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración

avanzada) 9, 10, 24, 48, 64, 133, 154, 165,

206

flujo de trabajo de exportación/importación 10, 209

flujo de trabajo de inicio rápido 10, 207

flujo de trabajo de plantilla 10, 208

flujos de trabajo

Advanced Setup (Configuración avanzada) 206

experimento de ejemplo 13

Exportación/importación 10, 209

Plantilla 10, 208

QuickStart (Inicio rápido) 10, 207

flujos de trabajo alternativos del experimento. Véase

flujos de trabajo.

formación, información acerca de x

Índice

229

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

gráfica de amplificación, típica 107, 189

High-Capacity cDNA Reverse Transcription

Kits 51, 157

iconos de peligro. Consulte símbolos de peligro, en

instrumentos

imprimir instrucciones de la configuración de la

reacción 40, 146

indicador BADROX 117, 197

indicador NOAMP 117, 197

indicador NOISE 117, 197

indicador NOSIGNAL 117, 197

indicador OFFSCALE 117, 197

indicador OUTLIERRG 117, 197

indicador SPIKE 117, 197

indicador THOLDFAIL 117, 197

iniciar proceso

disposición conectada 73

distribución autónoma 74

línea basal

ajustar manualmente 115, 195

valores correctos 107, 189

marcador AMPNC 117, 197

marcador BLFAIL 117, 197

marcador CTFAIL 117, 197

marcador EXPFAIL 117, 197

marcador HIGHSD 117, 197

marcadores

en experimentos de CT comparativo 197

en experimentos de curva estándar relativa 117

opciones de análisis 115, 195

materiales necesarios 51, 53, 55, 59, 61, 157, 159, 161,

163

mezcla de reacción

volúmenes 59, 161

volúmenes calculados 36, 38, 143, 145

movimiento repetitivo, seguridad xxii

movimiento y levantamiento, seguridad xvi

MSDS

descripción xvii

obtención xviii

MSDS, obtener x

muestra de referencia

componente de experimento 5

pantalla Relative Quantification Settings (Opciones

de cuantificación relativa) 32, 140

muestras

componente de experimento 4, 5

configurar 30, 137

diluciones 53, 158

directrices de diseño 32, 139

preparar plantilla 51, 157

reacciones de muestras (desconocidas) 64, 164

omitir pocillos 118, 197

opciones de análisis

avanzadas 115, 195

CT 115, 195

cuantificación relativa 115, 195

línea basal 115, 195

marcador 115, 195

umbral 115, 195

ver 114, 194

opciones de notificación 71

otros reactivos basados en fluorescencia 9

palabras de aviso para el usuario, descripción viii

pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación)

supervisión durante un proceso 78

ver después de proceso 103, 185

pantalla Experiment Properties (Propiedades de

experimento) 20, 129

pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión de

genes) 108, 182

pantalla Materials List (Lista de materiales) 43, 148

pantalla Methods & Materials (Métodos y

materiales) 22, 131

pantalla Multicomponent Plot (Gráfica

multicomponente) 120, 200

pantalla Multiple Plots (Múltiples gráficas) 99, 180

pantalla QC Summary (Resumen QC) 116, 196

pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos) 122,

203

pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción) 35,

142

pantalla Relative Quantification Settings (Opciones

cuantificación relativa) 140

pantalla Relative Quantification Settings (Opciones de

cuantificación relativa) 32

pantalla Run Method (Método de proceso) 33, 141

supervisión durante un proceso 81

pantalla Samples (Muestras) 30, 137

pantalla Standards (Estándares) 28

pantalla Targets (Dianas) 25, 135

pantalla Temperature Plot (Gráfica de temperatura) 80

Índice

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

230

pantallas de análisis

consejos de desplazamiento 98, 179

elementos del software 96, 178

pantalla Amplification Plot (Gráfica de

amplificación) 103, 185

pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión

de genes) 108, 182

pantalla Multicomponent Plot (Gráfica

multicomponente) 120, 200

pantalla Multiple Plots (Múltiples gráficas) 99, 180

pantalla QC Summary (Resumen QC) 116, 196

pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos

brutos) 122, 203

pantalla Standard Curve (Curva estándar) 100

tabla de pocillos 108, 182

PCR multiplexada 7, 25, 134

PCR uniplexada 7, 25, 134

Peligro xxi

PELIGRO, descripción xi

peligros. Consulte seguridad

perfiles de residuos, descripción xx

placa de reacción

cargar 70, 170

descargar 87

disposición 46, 152

preparar 61, 163

plantilla. Véase muestras.

pocillos

control negativo 31, 46, 61, 138, 152, 163

desconocidos 31, 46, 61, 138, 152, 163

estándar 31, 46, 61, 138, 152, 163

omitir 118, 197

seleccionar 98, 179

PRECAUCIÓN, descripción xi

preparar el proceso 69, 169

preparar experimento

dilución seriada de estándar 55

diluciones de muestras 53, 158

directrices 54, 58, 60, 64, 158, 160, 162, 165

flujo de trabajo 50, 156

mezcla de reacción

preparar 58, 160

para obtener más información 52, 54, 60, 65, 158,

160, 162, 165

placa de reacción 61, 163

plantilla 51, 157

publicar datos 111, 191

reactivos

otros basados en fluorescencia 9

SYBR Green 8

TaqMan 8

reactivos SYBR Green 8, 23, 24, 27, 41, 123, 132, 134,

136, 147, 204

reactivos TaqMan 8, 23, 24, 27, 41, 123, 132, 134, 136,

147, 204

realizar experimento

activar opciones de notificaciones 71

alertas 82

directrices 72

flujo de trabajo 68

iniciar 73

para obtener más información 71, 82, 84

preparar 69, 169

supervisar 76

transferir datos 87

réplica, componente de experimento 5, 6

residuos biológicos peligrosos, manipulación xx

residuos radioactivos, manipulación xx

resultados, interpretar 93, 175

RT-PCR de 1 pasos 7, 24, 25, 34, 41, 133, 134, 142,

147

RT-PCR de 2 pasos 7, 11, 12, 24, 25, 133, 134

seguridad

antes de usar el instrumento xvi

convenciones xi

directrices xvii, xix, xx

eléctrica xx

ergonomía xxii

estación de trabajo xxii

estándares xxiii

mover y levantar el instrumento xvi

mover/levantar xvi

movimiento repetitivo xxii

peligros biológicos xxi

química xvii

residuo químico

residuos químicos xix

uso del instrumento xvi

seguridad de residuos químicos xix

seguridad eléctrica xx

seguridad química xvii

seleccionar pocillos 98, 179

símbolos de peligro. Consulte símbolos de peligro, en

instrumentos

símbolos de peligro. Consulte símbolos de seguridad, en

instrumentos

símbolos de seguridad, en instrumentos xiii

símbolos, seguridad xiii

sistema de ayuda, acceso ix

sistema StepOne

consumibles 3

distribuciones 73, 76, 88

filtros 123, 204

reactivos 8

recopilación de datos 2

solicitar materiales 43, 148

Índice

231

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

solución de problemas

ajustar línea basal 115, 195

ajustar umbral 115, 195

marcadores 117, 197

omitir pocillos 118, 197

ver opciones de análisis 114, 194

ver pantalla Multicomponent Plot (Gráfica

multicomponente) 120, 200

ver pantalla QC Summary (Resumen QC) 116, 196

ver pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos

brutos) 122, 203

supervisar proceso

disposición conectada 77

distribución autónoma 86

distribución autónoma (remota) 83

pantalla Amplification Plot (Gráfica de

amplificación) 78

pantalla Run Method (Método de proceso) 81

pantalla Temperature Plot (Gráfica de

temperatura) 80

suposiciones de uso de esta guía vii

tabla de pocillos 108, 182

transferir datos 87

umbral

ajustar manualmente 115, 195

valores correctos 107, 189

usar esta guía

como tutorial 9

con sus propios experimentos 9

uso del instrumento, seguridad xvi

valores atípicos. Véase omitir pocillos.

velocidad de la rampa 22, 24, 131, 133

Índice

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de

cuantificación relativa

232

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06/2010

Número de referencia 4377742 Rev. B

Transcripción de documentos

Guía de introducción Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Experimentos de cuantificación relativa y CT comparativos Guía de introducción Introducción Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Diseño del experimento de curva estándar relativa Experimentos de cuantificación relativa Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa Realización del experimento de curva estándar relativa Análisis del experimento de curva estándar relativa Diseño del experimento de CT comparativos Preparación de las reacciones de CT comparativos Realización del experimento de CT comparativos Análisis del experimento de CT comparativos © Copyright 2006, 2010 Applied Biosystems. All rights reserved. Information in this document is subject to change without notice. Applied Biosystems assumes no responsibility for any errors that may appear in this document. APPLIED BIOSYSTEMS DISCLAIMS ALL WARRANTIES WITH RESPECT TO THIS DOCUMENT, EXPRESSED OR IMPLIED, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THOSE OF MERCHANTABILITY OR FITNESS FOR A PARTICULAR PURPOSE. IN NO EVENT SHALL APPLIED BIOSYSTEMS BE LIABLE, WHETHER IN CONTRACT, TORT, WARRANTY, OR UNDER ANY STATUTE OR ON ANY OTHER BASIS FOR SPECIAL, INCIDENTAL, INDIRECT, PUNITIVE, MULTIPLE OR CONSEQUENTIAL DAMAGES IN CONNECTION WITH OR ARISING FROM THIS DOCUMENT, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THE USE THEREOF. NOTICE TO PURCHASER: Label License The StepOne™ Real-Time PCR System is covered by US patents and corresponding claims in their non-US counterparts, owned by Applied Biosystems. No right is conveyed expressly, by implication, or by estoppel under any other patent claim, such as claims to apparatus, reagents, kits, or methods such as 5′ nuclease methods. Further information on purchasing licenses may be obtained by contacting the Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA. TRADEMARKS: Applera, Applied Biosystems, AB (Design), MicroAmp, Primer Express, and VIC are registered trademarks, and FAM, JOE, ROX, StepOne, and TAMRA are trademarks of Applied Biosystems o sus subsidiarias en EE.UU. y/o en algunos otros países. AmpErase, AmpliTaq Gold, and TaqMan are registered trademarks of Roche Molecular Systems, Inc. SYBR is a registered trademark of Molecular Probes, Inc. Macintosh is a registered trademark of Apple Computer, Inc. Microsoft and Windows are registered trademarks of Microsoft Corporation. All other trademarks are the sole property of their respective owners. Número de referencia 4377742 Rev. B 06/2010 Contenido Prólogo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii Cómo utilizar esta guía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii Cómo obtener más información . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . viii Cómo obtener asistencia técnica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x Convenciones de seguridad utilizadas en este documento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xi Símbolos en los instrumentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xiii Etiquetas de seguridad en los instrumentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xiv Seguridad general del instrumento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xvi Seguridad química . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xvii Seguridad de residuos químicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xix Seguridad eléctrica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xx Seguridad de los LED . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxi Seguridad biológica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxi Seguridad de la estación de trabajo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxii Estándares de seguridad y compatibilidad electromagnética (EMC) . . . . . . . . . . . xxiii Capítulo 1 Introducción. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Acerca del sistema StepOne™ ...........................................2 Acerca de los experimentos de cuantificación relativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Cómo utilizar esta guía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 Acerca del experimento de ejemplo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 Flujo de trabajo del experimento de ejemplo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa . 15 Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 Creación de un nuevo experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 Definición de las propiedades del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 Definición de los métodos y materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 Configuración de los genes diana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 Configuración de los estándares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 Configuración de las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 Configuración de las opciones de cuantificación relativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 Configuración del protocolo de termociclado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 Revisión de la configuración de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 Solicitud de materiales para el experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa iii Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 Preparación del molde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 Preparación de las diluciones de las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 Preparación de la dilución seriada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 Preparación de la mezcla de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58 Preparación de la placa de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68 Preparación de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 (Opcional) Activación de las notificaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 Inicio de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 Monitorización de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 Descarga de la placa de reacción y transferencia de datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92 Sección 5.1: Revisión de los resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 Análisis del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94 Visualización de la curva estándar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 Revisión de la gráfica de amplificación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos . . . . . . . . . . . . . . . 108 Presentación de los datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111 Sección 5.2: Solución de problemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 Revisión de las opciones de análisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 Revisión del resumen QC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116 Omisión de pocillos para el análisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118 Revisión de la gráfica multicomponente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120 Revisión de la gráfica de datos brutos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122 iv Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos . . . . . 125 Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126 Creación de un nuevo experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127 Definición de las propiedades del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129 Definición de los métodos y materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131 Configuración de los genes diana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135 Configuración de las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137 Configuración de las opciones de cuantificación relativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140 Configuración del protocolo de termociclado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 Revisión de la configuración de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142 Solicitud de materiales para el experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148 Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152 Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155 Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156 Preparación del molde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157 Preparación de las diluciones de las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158 Preparación de la mezcla de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 160 Preparación de la placa de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163 Capítulo 8 Realización del experimento de CT comparativos. . 167 Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168 Preparación de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169 Realización del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos . . . . . 173 Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174 Sección 9.1: Revisión de los resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175 Análisis del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176 Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos . . . . . . . . . . . . . . . 182 Revisión de la gráfica de amplificación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185 Presentación de los datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191 Sección 9.2: Solución de problemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193 Revisión de las opciones de análisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194 Revisión del resumen QC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196 Omisión de pocillos para el análisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197 Revisión de la gráfica multicomponente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200 Revisión de la gráfica de datos brutos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa v Apéndice A Flujos de trabajo alternativos para el experimento . . . . 205 Flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 206 Flujo de trabajo QuickStart (Inicio rápido) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207 Flujo de trabajo de molde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 208 Flujo de trabajo de exportación/importación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209 Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211 Glosario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213 Índice. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 227 vi Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Prólogo Cómo utilizar esta guía Finalidad de esta guía En esta guía, se explica cómo realizar experimentos de curva estándar relativa y CT (∆∆CT) en Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System (sistema StepOne™). Esta guía sirve de: • Tutorial, utilizando los datos de los experimentos de ejemplo que se incluyen en Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Software (software StepOne™). • Guía para realizar sus propios experimentos. Público Suposiciones Esta guía está destinada al personal de laboratorio y a los investigadores que realizan experimentos de cuantificación relativa con el sistema StepOne. En esta guía, se asume que el usuario: • • • • • Convenciones del texto Está familiarizado con el sistema operativo Microsoft Windows® XP. Está familiarizado con Internet y los navegadores de Internet. Sabe cómo manejar muestras de DNA y/o RNA y prepararlas para la PCR. Sabe almacenar datos, transferir archivos y copiar y pegar. Tiene experiencia con redes si tiene pensado integrar el sistema StepOne en el flujo de datos existente de su laboratorio. En esta guía, se utilizan las siguientes convenciones: • El texto en negrita indica una acción del usuario. Por ejemplo: Escriba 0 y, a continuación, pulse Intro en cada uno de los campos restantes. • El texto en cursiva señala palabras nuevas o importantes y también se utiliza para enfatizar algo. Por ejemplo: Antes de realizar el análisis, prepare siempre una matriz fresca. • El símbolo de la flecha que apunta a la derecha () separa los comandos sucesivos que se seleccionan en un menú desplegable o un menú de acceso directo. Por ejemplo: Seleccione File (Archivo)Open (Abrir). Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa vii Prólogo Cómo obtener más información Palabras de aviso para el usuario En la documentación de Applied Biosystems, aparecen dos palabras de aviso para el usuario. Cada palabra implica un nivel concreto de observación o acción, tal y como se describe a continuación: Nota: Proporciona información que puede ser interesante o útil, pero no es esencial para el uso del producto. ¡IMPORTANTE! Proporciona información que es necesaria para poder utilizar el instrumento correctamente, para poder utilizar un kit de reactivos con precisión o para poder utilizar un producto químico de manera segura. A continuación, se muestran algunos ejemplos de palabras de aviso para el usuario: Nota: La función de calibración también está disponible en la consola de control. ¡IMPORTANTE! Para comprobar la conexión del cliente, necesita un identificador de usuario válido. Palabras de aviso de seguridad En la documentación del usuario, también aparecen palabras de aviso de seguridad. Para obtener más información, consulte “Palabras de aviso de seguridad” en la página xi. Cómo obtener más información Documentación relacionada El sistema StepOne incluye la siguiente documentación: Núm. ref. inglés Núm. ref. español Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting Started Guide for Genotyping Experiments 4376786 4377729 Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting Started Guide for Presence/Absence Experiments 4376787 Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting Started Guide for Relative Standard Curve and Comparative CT Experiments 4376785 Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting Started Guide for Standard Curve Experiments 4376784 4377736 Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Installation, Maintenance, and Networking Guide 4376782 4377798 Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Installation Quick Reference Card 4376783 4377792 Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Site Preparation Guide 4376768 4378359 — — Documento Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Software Help viii — 4377742 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Prólogo Cómo obtener más información Applied Biosystems puede proporcionarle la siguiente documentación auxiliar: Documento Número de referencia Amplification Efficiency of TaqMan® Gene Expression Assays Application Note 127AP05 Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol 4375575 Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Installation Performance Verification Protocol 4376791 Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Installation QualificationOperation Qualification Protocol 4376790 Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Planned Maintenance Protocol 4376788 Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol 4334429 Primer Express® Software Version 3.0 Getting Started Guide 4362460 TaqMan® 4333458 Gene Expression Assays Protocol User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression 4303859 Nota: Para obtener más documentación, consulte “Cómo obtener asistencia técnica” en la página x. Obtención de información de la ayuda del software La ayuda del software StepOne describe cómo se utiliza cada función de la interfaz de usuario. Para acceder a la ayuda desde el software StepOne, realice una de las siguientes acciones: • Pulse F1. • Haga clic en en la barra de herramientas. • Seleccione Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne). Para buscar temas de interés en la ayuda: • Consulte el índice de contenido. • Busque un tema específico. • Busque en un índice alfabético. Envíenos sus comentarios Applied Biosystems agradece sus comentarios y sugerencias para mejorar sus documentos de usuario. Puede enviar sus comentarios a la dirección de correo electrónico: [email protected] ¡IMPORTANTE! Esta dirección sólo sirve para enviar comentarios y sugerencias en relación con la documentación. Para solicitar documentos, descargar archivos PDF u obtener ayuda sobre una cuestión técnica, vaya a www.appliedbiosystems.com y, a continuación, haga clic en el vínculo Support (Asistencia técnica). (Consulte “Cómo obtener asistencia técnica” más adelante). Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa ix Prólogo Cómo obtener asistencia técnica Cómo obtener asistencia técnica Para acceder a los servicios más recientes y obtener información acerca de la asistencia técnica, vaya a www.appliedbiosystems.com y, a continuación, haga clic en el vínculo Support (Asistencia técnica). En la página Support (Asistencia técnica), puede: • Buscar las preguntas más frecuentes (FAQ) • Enviar una pregunta directamente al Servicio de asistencia técnica • Solicitar a Applied Biosystems documentos de usuario, fichas técnicas de solicitud de materiales (MSDS), certificados de análisis y otros documentos relacionados • Descargar documentos PDF • Obtener información acerca de la formación del cliente • Descargar actualizaciones y parches de software Asimismo, en la página Support (Asistencia técnica) podrá acceder a los números de teléfono y fax para ponerse en contacto con el Servicio de asistencia técnica y las instalaciones de venta de Applied Biosystems en todo el mundo. ¡IMPORTANTE! Cuando se le solicite que lo haga en esta guía o cuando tenga que programar el mantenimiento del instrumento StepOne™ (por ejemplo, el mantenimiento anual planificado o la verificación/calibración de la temperatura), póngase en contacto con el Centro de atención al cliente de Applied Biosystems. Para obtener un número de teléfono o enviar un mensaje de correo electrónico al centro, visite http://www.appliedbiosystems.com/support/contact. x Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Prólogo Convenciones de seguridad utilizadas en este documento Convenciones de seguridad utilizadas en este documento Palabras de aviso de seguridad En la documentación del usuario de Applied Biosystems, aparecen cuatro palabras de aviso de seguridad en los puntos del documento en los que debe conocer la existencia de peligros importantes. Cada palabra de aviso (IMPORTANTE, PRECAUCIÓN, ADVERTENCIA, PELIGRO) implica un nivel de observación o acción particular, tal y como se explica a continuación. Definiciones ¡IMPORTANTE! Proporciona información que es necesaria para poder utilizar el instrumento correctamente, para poder utilizar un kit de reactivos con precisión o para poder utilizar un producto químico de manera segura. Indica una situación potencialmente peligrosa que, de no evitarse, podría causar lesiones leves o moderadas. También puede utilizarse para alertar de prácticas no seguras. Indica una situación potencialmente peligrosa que, de no evitarse, podría causar lesiones graves o mortales. Indica una situación inminentemente peligrosa que, de no evitarse, tendrá como resultado lesiones graves o mortales. Esta palabra de aviso se limita a las situaciones más extremas. A excepción de los avisos IMPORTANTE, todas las palabras de aviso de seguridad de un documento de Applied Biosystems aparecen con la figura de un triángulo abierto que contiene un símbolo de peligro. Estos símbolos de peligro son idénticos a los que se incorporan en los instrumentos de Applied Biosystems (consulte “Símbolos de seguridad” en la página xiii). Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa xi Prólogo Convenciones de seguridad utilizadas en este documento Ejemplos ¡IMPORTANTE! Debe crear una hoja de cálculo de entradas de las muestras diferente para cada placa de 96 pocillos. PELIGRO QUÍMICO. TaqMan® Universal PCR Master Mix puede causar irritaciones en la piel y los ojos. Puede provocar molestias si se ingiere o se inhala. Consulte la ficha técnica de seguridad (MSDS) y siga las instrucciones de manipulación indicadas. Use protectores oculares, vestimenta protectora y guantes apropiados. PELIGRO DE LESIONES FÍSICAS. Durante el uso de los instrumentos, la cubierta caliente y el bloque, se pueden alcanzar temperaturas superiores a 100 °C. PELIGRO ELÉCTRICO. La continuidad del circuito de toma a tierra es vital para la seguridad. Jamás utilice el sistema con el conductor de toma de tierra desconectado. xii Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Prólogo Símbolos en los instrumentos Símbolos en los instrumentos Electricidad Símbolos en los instrumentos En la siguiente tabla, se describen los símbolos eléctricos que pueden aparecer en los instrumentos de Applied Biosystems. Símbolo Descripción Símbolo Descripción Indica un terminal que puede estar conectado a la referencia del retorno de tierra del circuito de señal de otro instrumento. No es un terminal de tierra protegido. Indica la posición On (Encendido) del interruptor de encendido principal. Indica la posición Off (Apagado) del interruptor de encendido principal. Este símbolo indica que se debe conectar a tierra un terminal de toma a tierra de protección antes de realizar ninguna otra conexión eléctrica en el instrumento. Indica un interruptor de espera por medio del cual se activa la posición Standby (Espera) en el instrumento. Si este interruptor está en la posición de espera, puede haber peligro de tensión. Indica que un terminal puede recibir o suministrar tensión o corriente alterna. Indica que un terminal puede recibir o suministrar tensión o corriente alterna o continua. Indica la posición On/Off (Encendido/Apagado) de un interruptor de encendido principal de contrafase. Símbolos de seguridad En la siguiente tabla, se describen los símbolos de seguridad que pueden aparecer en los instrumentos de Applied Biosystems. Estos símbolos pueden aparecer en solitario o con un texto que explique el peligro correspondiente (consulte “Etiquetas de seguridad en los instrumentos” en la página xiv). Estos símbolos de seguridad también pueden aparecer junto a PELIGROS, ADVERTENCIAS y PRECAUCIONES que se incluyen en el texto de este o de otros documentos de ayuda de productos. Símbolo Descripción Indica que debería consultar el manual para obtener más información y proceder con el cuidado correspondiente. Indica la presencia de una superficie caliente u otro peligro debido a altas temperaturas y recomienda proceder con el cuidado correspondiente. Símbolo Descripción Indica la presencia de piezas móviles y recomienda proceder con el cuidado correspondiente. Indica la presencia de un peligro de descarga eléctrica y recomienda proceder con el cuidado correspondiente. Indica la presencia de un láser en el interior del instrumento y recomienda proceder con el cuidado correspondiente. Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa xiii Prólogo Etiquetas de seguridad en los instrumentos Medio ambiente Símbolos en los instrumentos El siguiente símbolo se aplica a todos los productos eléctricos y electrónicos de Applied Biosystems que salieron al mercado europeo después del 13 de agosto de 2005. Símbolo Descripción No tire este producto a la basura municipal normal. Cumpla las ordenanzas municipales sobre residuos correspondientes para reducir el impacto medioambiental de los residuos de equipos eléctricos y electrónicos (WEEE). Clientes de la Unión Europea: Llame a la oficina de atención al cliente local de Applied Biosystems para informarse sobre la recogida de equipos y el reciclaje. Consulte en http://www.appliedbiosystems.com un listado de oficinas de atención al cliente de la Unión Europea. Etiquetas de seguridad en los instrumentos Los siguientes símbolos de PRECAUCIÓN, ADVERTENCIA y PELIGRO pueden aparecer en los instrumentos de Applied Biosystems en combinación con los símbolos de seguridad que se han descrito en la sección anterior. xiv Inglés Francés CAUTION Hazardous chemicals. Read the Material Safety Data Sheets (MSDSs) before handling. ATTENTION Produits chimiques dangeureux. Lire les fiches techniques de sûreté de matériels avant la manipulation des produits. CAUTION Hazardous waste. Refer to MSDS(s) and local regulations for handling and disposal. ATTENTION Déchets dangereux. Lire les fiches techniques de sûreté de matériels et la régulation locale associées à la manipulation et l'élimination des déchets. CAUTION Hot surface. ATTENTION Surface brûlante. DANGER High voltage. DANGER Haute tension. WARNING To reduce the chance of electrical shock, do not remove covers that require tool access. No user-serviceable parts are inside. Refer servicing to Applied Biosystems qualified service personnel. AVERTISSEMENT Pour éviter les risques d'électrocution, ne pas retirer les capots dont l'ouverture nécessite l'utilisation d'outils. L’instrument ne contient aucune pièce réparable par l’utilisateur. Toute intervention doit être effectuée par le personnel de service qualifié de Applied Biosystems. CAUTION Moving parts. ATTENTION Parties mobiles. DANGER Class 3B (III) visible and/or invisible LED radiation present when open and interlocks defeated. Avoid exposure to beam. DANGER Rayonnement visible ou invisible d’un faisceau LED de Classe 3B (III) en cas d’ouverture et de neutralisation des dispositifs de sécurité. Evitez toute exposition au faisceau. Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Prólogo Etiquetas de seguridad en los instrumentos Ubicaciones de los símbolos de advertencia El sistema StepOne contiene una advertencia en el lugar que se indica a continuación: Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa xv Prólogo Seguridad general del instrumento Seguridad general del instrumento PELIGRO DE LESIONES FÍSICAS. Si el instrumento se utiliza de alguna forma que no especifica Applied Biosystems, se pueden producir lesiones personales o daños en el instrumento. Movimiento y levantamiento del instrumento PELIGRO DE LESIONES FÍSICAS. El instrumento sólo puede moverlo y colocarlo el personal o el distribuidor que se especifique en la guía de preparación del emplazamiento correspondiente. Si decide levantar o mover el instrumento después de instalarlo, no intente hacerlo sin la ayuda de otras personas, el equipo de traslado adecuado y las técnicas de elevación correctas. El levantamiento inapropiado puede causar dolorosas lesiones dorsales, que pueden resultar permanentes. Dependiendo del peso, se podrían necesitar dos personas para mover o levantar un instrumento. Movimiento y levantamiento de ordenadores y monitores autónomos No intente levantar o mover el ordenador ni el monitor sin la ayuda de otras personas. Dependiendo del peso del ordenador y/o el monitor, se podrían necesitar dos o más personas para moverlos. Aspectos a tener en cuenta antes de levantar el ordenador y/o el monitor: • Asegúrese de sujetar el ordenador o el monitor de un lugar seguro y cómodo para levantarlos. • Asegúrese de que no hay ningún obstáculo entre el lugar en el que se encuentra el objeto y su lugar de destino. • No levante un objeto a la vez que gira el torso. • Mantenga la columna espinal en una posición neutral mientras levanta el objeto con las piernas. • Los participantes deben coordinar las labores de levantamiento y movimiento antes de realizarlas. • En lugar de levantar el objeto desde la caja del embalaje, incline cuidadosamente la caja hacia un lado y manténgala fija mientras alguien desliza su contenido hacia fuera. Uso del instrumento Limpieza o descontaminación del instrumento xvi Asegúrese de que todas las personas que utilicen el instrumento: • Han recibido instrucciones sobre prácticas de seguridad generales para laboratorios y prácticas de seguridad generales para el instrumento. • Lea y comprenda todas las fichas técnicas de seguridad de los materiales (MSDS) aplicables. Consulte “Acerca de las fichas técnicas de seguridad de los materiales (MSDS)” en la página xvii. Antes de utilizar un método de limpieza o descontaminación que no sea el que recomienda el fabricante, consulte al fabricante para comprobar que el método propuesto no va a dañar el equipo. Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Prólogo Seguridad química Seguridad química Advertencia de peligro químico PELIGRO QUÍMICO. Antes de manejar algún producto químico, consulte la ficha técnica de seguridad de los materiales (MSDS) que suministra el fabricante y observe todas las precauciones relevantes. PELIGRO DE ALMACENAMIENTO QUÍMICO. No recoja ni almacene nunca los residuos en un envase de cristal, pues corre el riesgo de que se rompa o se resquebraje. Las botellas de reactivos y de residuos pueden agrietarse y presentar fugas. Cada botella de residuos deberá asegurarse en un recipiente de seguridad de polietileno de baja densidad con la tapa fija y las asas bloqueadas en posición vertical. Utilice la protección ocular, la vestimenta y los guantes adecuados cuando manipule botellas de reactivos o de residuos. Directrices de seguridad química Acerca de las fichas técnicas de seguridad de los materiales (MSDS) Para reducir al mínimo el peligro de los productos químicos: • Lea y comprenda las fichas técnicas de seguridad de los materiales (MSDS) que proporciona el fabricante de los productos químicos antes de almacenar, manipular o trabajar con cualquier producto químico o material peligroso. (Consulte “Acerca de las fichas técnicas de seguridad de los materiales (MSDS)” en la página xvii.) • Minimice el contacto con productos químicos. Utilice un equipo adecuado de protección personal durante la manipulación de productos químicos (por ejemplo, protectores oculares, guantes o vestimenta protectora). Puede encontrar más normas de seguridad en las MSDS. • Minimice la inhalación de productos químicos. No deje abiertos los recipientes de productos químicos. Utilícelos únicamente con la ventilación adecuada (por ejemplo, una campana extractora). Puede encontrar más normas de seguridad en las MSDS. • Compruebe periódicamente la ausencia de fugas o salpicaduras. Si se produce una fuga o un derrame, siga los procedimientos de limpieza del fabricante, tal y como se recomienda en la MSDS. • Cumpla todas las leyes y normativas locales, estatales/provinciales o nacionales en materia de almacenamiento, manipulación y eliminación de productos químicos. Los fabricantes de productos químicos incluyen fichas técnicas de seguridad de los materiales (MSDS) con los productos químicos peligrosos que envían a sus clientes nuevos. También incluyen MSDS con el primer envío de un producto químico peligroso a un cliente después de que esa MSDS se haya actualizado. En las MSDS, encontrará la información de seguridad necesaria para almacenar, manipular, transportar y desechar los productos químicos de forma segura. Cada vez que reciba una MSDS nueva con un producto químico peligroso, no se olvide de reemplazar la MSDS correspondiente en sus archivos. Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa xvii Prólogo Seguridad química Obtención de MSDS Las MSDS de cualquier producto químico de Applied Biosystems están a su disposición de manera gratuita las 24 horas del día. Para obtener MSDS: 1. Vaya a https://docs.appliedbiosystems.com/msdssearch.html 2. En el campo de búsqueda de la página de búsqueda de MSDS: a. Escriba el nombre del producto químico, el número de serie u otra información de interés que espere que aparezca en la MSDS. b. Seleccione el idioma que desee. c. Haga clic en Search (Buscar). 3. Para ver, descargar o imprimir el documento que le interesa: a. Haga clic con el botón derecho en el título del documento. b. Seleccione: • Open (Abrir): para ver el documento. • Save Target As (Guardar destino como): para descargar una versión PDF del documento en el destino que seleccione. • Print Target (Imprimir destino): para imprimir el documento. 4. Para enviar una copia de una MSDS por fax o correo electrónico, en la página de resultados de la búsqueda: a. Seleccione Fax o Email bajo el título del documento. b. Haga clic en RETRIEVE DOCUMENTS (Recuperar documentos) al final de la lista de documentos. c. Introduzca la información requerida. d. Haga clic en View/Deliver Selected Documents Now (Ver/enviar ahora los documentos seleccionados). Nota: Para obtener las MSDS de productos químicos que no distribuye Applied Biosystems, póngase en contacto con el fabricante del producto químico. xviii Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Prólogo Seguridad de residuos químicos Seguridad de residuos químicos Peligro de residuos químicos RESIDUOS PELIGROSOS. Para obtener información acerca de su manipulación y eliminación, consulte las fichas técnicas de seguridad de los materiales y las normativas locales. PELIGRO DE RESIDUOS QUÍMICOS. Los residuos producidos por los instrumentos de Applied Biosystems son potencialmente peligrosos y pueden causar lesiones, enfermedades o la muerte. PELIGRO DE ALMACENAMIENTO QUÍMICO. No recoja ni almacene nunca los residuos en un envase de cristal, pues corre el riesgo de que se rompa o se resquebraje. Las botellas de reactivos y de residuos pueden agrietarse y presentar fugas. Cada botella de residuos deberá asegurarse en un recipiente de seguridad de polietileno de baja densidad con la tapa fija y las asas bloqueadas en posición vertical. Utilice la protección ocular, la vestimenta y los guantes adecuados cuando manipule botellas de reactivos o de residuos. Directrices de seguridad de residuos químicos Para reducir al mínimo el peligro de los residuos químicos: • Lea y comprenda las fichas técnicas de seguridad de los materiales (MSDS) proporcionadas por los fabricantes de los productos químicos en el recipiente de residuos antes de almacenar, manipular o eliminar los residuos químicos. • Disponga de contenedores de residuos principales y secundarios. (Los contenedores principales contienen los residuos inmediatos. Los contenedores secundarios contienen cualquier derrame o fuga del contenedor principal. Ambos contenedores deben ser compatibles con el material de residuo y deben cumplir los requisitos federales, estatales y locales sobre el almacenamiento en contenedores). • Minimice el contacto con productos químicos. Utilice un equipo adecuado de protección personal durante la manipulación de productos químicos (por ejemplo, protectores oculares, guantes o vestimenta protectora). Puede encontrar más normas de seguridad en las MSDS. • Minimice la inhalación de productos químicos. No deje abiertos los recipientes de productos químicos. Utilícelos únicamente con la ventilación adecuada (por ejemplo, una campana extractora). Puede encontrar más normas de seguridad en las MSDS. • Manipule los residuos químicos bajo una campana extractora. • Después de vaciar el recipiente de residuos, ciérrelo bien con la tapa suministrada. • Elimine el contenido de la bandeja de residuos y de la botella de residuos conforme a las buenas prácticas de laboratorio y a la normativa local, estatal/provincial o nacional en materia de medio ambiente y salud. Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa xix Prólogo Seguridad eléctrica Eliminación de residuos Si se generan residuos potencialmente peligrosos al utilizar el instrumento, debe: • Identificar (mediante análisis, si es necesario) los residuos generados por las aplicaciones, los reactivos y los sustratos utilizados en su laboratorio. • Garantizar la salud y la seguridad de todo el personal de su laboratorio. • Garantizar que los residuos producidos por el instrumento se almacenan, transfieren, transportan y eliminan de acuerdo con todas las normativas locales, estatales/provinciales y/o nacionales. ¡IMPORTANTE! Los materiales radiactivos o que impliquen un peligro biológico pueden requerir una manipulación especial, pudiéndose aplicar limitaciones en materia de eliminación. Seguridad eléctrica PELIGRO DE DESCARGA ELÉCTRICA. Se puede producir una descarga eléctrica grave si se utiliza el sistema StepOne sin haber colocado los paneles del instrumento. No quite los paneles del instrumentos. Los contactos de alta tensión quedan expuestos al quitar estos paneles del instrumento. Fusibles PELIGRO DE INCENDIO. El uso de fusibles o de una fuente de alimentación de alta tensión incorrectos puede dañar el sistema de cableado del instrumento y provocar un incendio. Antes de encender el instrumento, compruebe que los fusibles están bien instalados y que la tensión del instrumento se corresponde con la fuente de alimentación del laboratorio. PELIGRO DE INCENDIO. Para protegerse contra el riesgo de incendio, sólo cambie los fusibles por otros que sean del tipo y la potencia que se especifica para el instrumento. Alimentación eléctrica PELIGRO ELÉCTRICO. La continuidad del circuito de toma de tierra es vital para la seguridad del equipo. Jamás utilice el equipo con el conductor de toma de tierra desconectado. PELIGRO ELÉCTRICO. Utilice cordones eléctricos certificados y bien configurados para el suministro eléctrico de la instalación. PELIGRO ELÉCTRICO. Enchufe el sistema a una toma eléctrica que tenga una toma de tierra adecuada y la capacidad de corriente apropiada. Potencia de sobretensión xx El sistema StepOne se incluye en la categoría II (de sobretensión) de las instalaciones y está clasificado como un equipo portátil. Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Prólogo Seguridad de los LED Seguridad de los LED Para garantizar un funcionamiento seguro de los LED: • Un representante de Applied Biosystems debe realizar el mantenimiento del sistema. • Todos los paneles del instrumentos deben estar colocados en el instrumento mientras éste está en funcionamiento. Cuando todos los paneles están instalados, no se detecta ninguna radiación. Si se quita algún panel cuando el LED está en funcionamiento (durante una reparación con los interbloqueos de seguridad desactivados), podría exponerse a emisiones LED superiores a la potencia de la clase 3B. • No quite las etiquetas de seguridad ni desactive los interbloqueos de seguridad. Seguridad biológica Peligro biológico general PELIGRO BIOLÓGICO. Las muestras biológicas como, por ejemplo, de tejidos, fluidos corporales, agentes infecciosos y sangre humana o de otros animales, pueden transmitir enfermedades infecciosas. Siga todas las normativas locales, estatales/provinciales y/o nacionales aplicables. Lleve el equipo de protección adecuado, lo que incluye, entre otras cosas: protección ocular, protección facial, vestimenta/bata de laboratorio y guantes. Todo el trabajo se debe realizar en instalaciones que dispongan del equipamiento adecuado y con el equipo de seguridad apropiado (por ejemplo, dispositivos de contención física). Los trabajadores deberían recibir formación de acuerdo con los requisitos de la institución o empresa y los requisitos legales aplicables antes de trabajar con materiales potencialmente infecciosos. Lea y siga las directrices y/o los requisitos legales aplicables en: • Las directrices del Departamento de Salud y Servicios Humanos (Department of Health and Human Services) de EE.UU. publicadas en Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (nº 017-040-00547-4; http://bmbl.od.nih.gov) • Occupational Safety and Health Standards, Bloodborne Pathogens (29 CFR§1910.1030; http://www.access.gpo.gov/ nara/cfr/waisidx_01/ 29cfr1910a_01.html). • Los protocolos del programa de seguridad biológica de su empresa o institución para trabajar o manipular materiales potencialmente infecciosos. Puede encontrar más información acerca de las directrices sobre peligros biológicos en: http://www.cdc.gov Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa xxi Prólogo Seguridad de la estación de trabajo Seguridad de la estación de trabajo Si configura correctamente la ergonomía de su estación de trabajo, puede reducir o evitar problemas de fatiga, dolor y tensión. Para minimizar o eliminar estos problemas, configure la estación de trabajo para adoptar posiciones neutrales o relajadas cuando esté trabajando. PELIGRO MUSCULOESQUELÉTICO Y POR MOVIMIENTOS REPETITIVOS. Estos peligros están causados por posibles factores de riesgo, incluidos, entre otros, movimientos repetitivos, posturas incómodas, esfuerzos, mantenimiento de posturas estáticas poco saludables, presión por contacto y otros factores medioambientales de la estación de trabajo. Para minimizar los riesgos musculoesqueléticos y por movimientos repetitivos: • Utilice equipos en los que pueda colocarse cómodamente en posiciones neutrales y que permitan acceder de manera adecuada al teclado, el monitor y el ratón. • Coloque el teclado, el ratón y el monitor de forma que pueda adoptar una postura relajada de la cabeza y el cuerpo. xxii Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Prólogo Estándares de seguridad y compatibilidad electromagnética (EMC) Estándares de seguridad y compatibilidad electromagnética (EMC) Estándares de seguridad de EE.UU. y Canadá El sistema StepOne ha sido probado y cumple el estándar: UL 61010A-1/CAN/CSA C22.2 No. 1010.1-92, “Requisitos de seguridad de equipos eléctricos para la medición, el control y el uso en laboratorios, Primera parte: Requisitos Generales”. UL 61010A-2-010/CAN/CSA 1010.2.010, “Requisitos particulares de equipos de laboratorio para el calentamiento de materiales”. “Estándar de rendimiento 21 CFR 1040.10 y 1040.11 de la Ley de control de radiaciones para la salud y la seguridad de 1968” de la FDA, de la forma que sea aplicable. Estándar EMC canadiense Estándares de seguridad y EMC europeos Este instrumento ha sido probado y cumple la edición 3 del estándar ICES-001: “Generadores de frecuencias de radio industriales, científicas y médicas”. Seguridad Este instrumento cumple los requisitos de seguridad europeos (Directiva de baja tensión 73/23/EEC). Este instrumento ha sido probado y cumple los estándares EN 610101:2001, “Requisitos de seguridad de equipos eléctricos para la medición, el control y el uso en laboratorios, Primera parte: Requisitos Generales”. EN 61010-2-010, “Requisitos particulares de equipos de laboratorio para el calentamiento de materiales”. EN 61010-2-081, “Requisitos particulares para equipos de laboratorio automáticos y semiautomáticos para análisis y otras finalidades”. EN 60825-1, “Seguridad frente a las radiaciones de los productos láser, clasificación de los equipos, requisitos y guía del usuario”. EMC Este instrumento cumple los requisitos de emisiones e inmunidad europeos (Directiva EMC 89/336/EEC). Este instrumento ha sido probado y cumple los estándares EN 61326 (Grupo 1, Clase B) “Equipos eléctricos para la medición, el control y el uso en laboratorios: requisitos EMC”. Estándares EMC australianos Este instrumento ha sido probado y cumple el estándar AS/NZS 2064, “Medición de límites y métodos de características de perturbaciones electromagnéticas de equipos de radiofrecuencia industriales, científicos y médicos (ISM)”. Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa xxiii Prólogo Estándares de seguridad y compatibilidad electromagnética (EMC) xxiv Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 1 Introducción Este capítulo cubre los siguientes temas: ■ Acerca del sistema StepOne™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 ■ Acerca de los experimentos de cuantificación relativa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 ■ Cómo utilizar esta guía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 ■ Acerca del experimento de ejemplo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 ■ Flujo de trabajo del experimento de ejemplo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 Nota: Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o seleccionando Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne). Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 1 Capítulo 1 Introducción Acerca del sistema StepOne™ Acerca del sistema StepOne™ Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System (sistema StepOne™) utiliza reactivos de reacción en cadena de polimerasa (PCR) basados en fluorescencias para proporcionar: • Detección cuantitativa de las secuencias de ácidos nucléicos de interés (dianas) mediante análisis a tiempo real. • Detección cualitativa de secuencias de ácidos nucléicos de interés (dianas) mediante análisis de punto final y curva de disociación. Acerca de la recogida de datos El sistema StepOne recoge datos de fluorescencia brutos en diferentes puntos de una PCR, dependiendo del tipo de reacción que realice: Tipo de proceso Procesos a tiempo real Curva estándar Punto de recogida de datos El instrumento recoge datos después de cada paso de extensión de la PCR. Curva estándar relativa CT comparativos (∆∆CT) Procesos a punto final Genotipado El instrumento recoge datos antes y después de la PCR. En los experimentos de genotipado, el software StepOne™ también puede recoger datos durante la reacción (tiempo real), que pueden resultar de ayuda para solucionar problemas. Presencia/ausencia El instrumento recoge datos antes y después de la PCR. Con independencia del tipo de reacción que se realice, un punto de recogida de datos o una lectura consta de tres fases: 1. Excitación: el instrumento StepOne™ ilumina todos los pocillos de la placa de reacción para excitar los fluorocromos correspondientes. 2. Emisión: la óptica del instrumento StepOne recoge la fluorescencia residual emitida en todos los pocillos de la placa de reacción. La imagen resultante captada por el dispositivo sólo consta de la luz emitida en un estrecho rango de longitudes de onda. 3. Recogida: el instrumento StepOne crea una representación digital de la fluorescencia residual recogida en un intervalo fijo de tiempo. El software StepOne almacena el dato bruto de la imagen fluorescente para analizarlo. Si fuera necesario, el software realizaría lecturas adicionales si lo requirieran los reactivos fluorescentes utilizados en el experimento. Después de una reacción, el software StepOne utiliza datos de calibración (espacial, espectral y de ruido de fondo) para determinar la ubicación y la intensidad de las señales fluorescentes en cada lectura, el fluorocromo asociado a cada señal fluorescente y el significado de la señal. Notas 2 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 1 Introducción Acerca del sistema StepOne™ Consumibles admitidos El sistema StepOne admite los consumibles que se enumeran a continuación. Estos consumibles se utilizan tanto para reacciones en modo estándar como en modo rápido. Número de referencia Consumible • MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plates • MicroAmp™ Optical 48-Well Adhesive Film • 4375816 • 4375323 • MicroAmp™ Fast 8-Tube Strips • MicroAmp™ Optical 8-Cap Strips • 4358293 • 4323032 • MicroAmp® Fast Reaction Tubes with Caps • 4358297 • MicroAmp™ Fast 48-Well Trays • MicroAmp™ 48-Well Base Adaptor • MicroAmp™ Splash Free 96-Well Base • 4375282 • 4375284 • 4312063 D F G A E B B A C # C C Consumible A MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate B MicroAmp™ Fast 48-Well Tray C MicroAmp™ Splash Free 96-Well Base D MicroAmp™ Optical 8-Cap Strip E MicroAmp™ Fast 8-Tube Strip F MicroAmp® Fast Reaction Tubes with Caps G MicroAmp Optical 48-Well Adhesive Film Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 3 Capítulo 1 Introducción Acerca de los experimentos de cuantificación relativa Para obtener más información Para obtener más información acerca de: • El sistema StepOne, consulte Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Software Help. Nota: Para acceder a la ayuda, seleccione Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne) desde el software StepOne. • Experimentos de cuantificación absoluta, consulte Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de curva estándar. • Experimentos de genotipado, consulte Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de genotipado. • Experimentos de presencia/ausencia, consulte Applied Biosystems StepOne™ RealTime PCR System Getting Started Guide for Presence/Absence Experiments. Acerca de los experimentos de cuantificación relativa Experimentos de PCR a tiempo real Los experimentos de cuantificación relativa son experimentos de PCR a tiempo real. En los experimentos de PCR a tiempo real: • El instrumento monitoriza el progreso de la PCR mientras se produce (Kwok y Higuchi, 1989). • Se recogen datos durante la reacción de PCR. • Las reacciones se caracterizan por el ciclo en el que se detecta por primera vez la amplificación de un gen diana (Saiki et al., 1985). Nota: En esta guía, el término experimento se refiere a todo el proceso del experimento, desde su diseño hasta el análisis de los datos. Acerca de los experimentos de curva estándar relativa Los experimentos de curva estándar relativa determinan el cambio de expresión de un gen diana en una muestra en relación con el mismo gen en una muestra de referencia. Para conseguir los resultados, se utiliza una curva estándar construida a partir de una dilución seriada de una muestra de concentración conocida. Los experimentos de curva estándar relativa se suelen utilizar para: • Comparar niveles de expresión de un gen en diferentes tejidos. • Comparar los niveles de expresión de un gen en una muestra tratada y en una muestra no tratada. • Comparar los niveles de expresión de alelos de tipo salvaje y alelos mutados. Componentes Estos son los componentes que se necesitan para preparar las reacciones de PCR para los experimentos de curva estándar relativa: • Muestra: la muestra en la que la cantidad del gen diana es desconocida. Notas 4 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 1 Introducción Acerca de los experimentos de cuantificación relativa • Muestra de referencia: la muestra utilizada como referencia para los resultados de la comparación. Por ejemplo, en un estudio sobre los efectos de las drogas en la expresión génica, un control no tratado sería una muestra de referencia apropiada. • Estándar: una muestra de concentración conocida. • Dilución seriada: un conjunto de diluciones del estándar (por ejemplo, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32) que se utilizan para construir una curva estándar. En todas las muestras, la cantidad del gen diana se determina realizando una interpolación a partir de la curva estándar y luego dividiendo por la cantidad del gen diana de la muestra de referencia. Dado que la muestra de referencia es la muestra 1✕, todas las demás cantidades se expresan como una diferencia multiplicada por n relativa a ella. Asimismo, la unidad de la curva estándar se cancela porque la cantidad de muestra se divide por la cantidad de muestra de referencia. Por consiguiente, lo único que se necesita de los estándares es conocer sus diluciones relativas. Por lo tanto, se puede utilizar cualquier cDNA, RNA o DNA de la solución de partida que contenga el gen diana apropiado para preparar los estándares. • Control endógeno: un gen presente en un nivel de expresión uniforme en todas las muestras. El control endógeno sirve para normalizar posibles variaciones de la cantidad de cDNA que se añade a cada reacción que se producen a consecuencia de imprecisiones en el pipeteo. • Réplicas: reacciones idénticas que contienen componentes y volúmenes idénticos. • Controles negativos: muestras que contienen agua o tampón en lugar de un molde. En los controles negativos no debería haber amplificación. Acerca de los experimentos de CT comparativos Los experimentos de CT comparativos (∆∆CT) determinan el cambio de expresión de un gen diana en una muestra en relación con el mismo gen en una muestra de referencia. Para obtener los resultados, se utilizan fórmulas aritméticas. Los experimentos de CT comparativos se suelen utilizar para: • Comparar niveles de expresión de un gen en diferentes tejidos. • Comparar los niveles de expresión de un gen en una muestra tratada y en una muestra no tratada. • Comparar los niveles de expresión de alelos de tipo salvaje y alelos mutados. Componentes Estos son los componentes que se necesitan para preparar las reacciones de PCR para los experimentos de CT comparativos: • Muestra: la muestra en la que la cantidad del gen diana es desconocida. • Muestra de referencia: la muestra utilizada como referencia para los resultados de la comparación. Por ejemplo, en un estudio sobre los efectos de las drogas en la expresión de los genes, un control no tratado sería una muestra de referencia apropiada. • Control endógeno: un gen presente en un nivel de expresión uniforme en todas las muestras. El control endógeno sirve para normalizar posibles variaciones de la cantidad de cDNA que se añade a cada reacción que se producen a consecuencia de imprecisiones en el pipeteo. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 5 Capítulo 1 Introducción Acerca de los experimentos de cuantificación relativa • Réplicas: reacciones idénticas que contienen componentes y volúmenes idénticos. • Controles negativos: muestras que contienen agua o tampón en lugar de un molde. En los controles negativos no debería haber amplificación. Experimentos de curva estándar relativa y experimentos de CT comparativos Tipo de experimento Tenga en cuenta lo siguiente a la hora de elegir entre experimentos de curva estándar relativa y experimentos de CT comparativos: Descripción Ventaja Limitación Curva estándar relativa Se utiliza una curva estándar para determinar el cambio de expresión de un gen diana en una muestra en relación con el mismo gen diana en una muestra de referencia. Es ideal para los ensayos que tienen una eficiencia de PCR por debajo de la óptima. Es el experimento que requiere menos validación, porque las eficiencias de PCR del gen diana y el control endógeno no tienen que ser equivalentes. Se debe crear una curva estándar para cada gen diana, lo que exige más reactivos y más espacio en la placa de reacción. CT comparativos (∆∆CT) Se utilizan fórmulas aritméticas para determinar el cambio de expresión de un gen diana en una muestra en relación con el mismo gen diana en una muestra de referencia. Es ideal para analizar la expresión relativa de muchos genes de interés en un gran número de muestras. • Los niveles relativos de expresión de un gen diana en las muestras se pueden determinar sin utilizar una curva estándar, siempre que las eficiencias de PCR del gen diana y el control endógeno sean relativamente equivalentes. • Menor uso de reactivos. • Más espacio disponible en la placa de reacción. • Los ensayos que no son óptimos (con una eficiencia de PCR baja) pueden producir resultados imprecisos. • Antes de utilizar el método de CT comparativos, Applied Biosystems recomienda determinar si las eficiencias de PCR del ensayo diana y el ensayo de control endógeno son aproximadamente iguales. Opciones de la PCR Al realizar una PCR a tiempo real, puede elegir entre: • PCR en singleplex y en multiplex (más abajo) y • RT-PCR de 1 y 2 pasos (página 7) Notas 6 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 1 Introducción Acerca de los experimentos de cuantificación relativa PCR en singleplex y PCR en multiplex Se puede realizar una reacción de PCR como una: • Reacción en singleplex, donde sólo hay un ensayo en el tubo de reacción o pocillo. Sólo se puede amplificar un gen diana o un control endógeno por reacción. o • Reacción en multiplex, donde hay dos o más ensayos en el tubo de reacción o pocillo. Cada conjunto amplifica un gen diana o un control endógeno específicos. ¡IMPORTANTE! No se pueden utilizar reactivos SYBR® Green para las reacciones en multiplex. Conjunto de cebadores de gen diana Conjunto de cebadores de control endógeno PCR en singleplex PCR en multiplex cDNA GR2331 RT-PCR de 1 y de 2 pasos Se puede realizar una retrotranscripción (RT) y una PCR en una sola reacción (1 paso) o en reacciones distintas (2 pasos). Los reactivos que se utilicen dependerán de si va a realizar una RT-PCR de 1 o de 2 pasos: • En las RT-PCR de 1 paso, la RT y la PCR se producen en un sistema de tampón, que permite disponer de un solo tubo para la amplificación de la RT y la PCR. Sin embargo, no se puede utilizar una mezcla maestra de PCR rápida ni la enzima de prevención de contaminación cruzada, AmpErase® UNG (uracil-N-glucosilasa), para realizar la RT-PCR de 1 paso. • La RT-PCR de 2 pasos se realiza en dos reacciones distintas: En primer lugar, el RNA total se retrotranscribe a cDNA y, a continuación, el cDNA se amplifica por medio de la PCR. Este método es útil para generar un pool de cDNAs o para almacenar alícuotas de cDNA y utilizarlas posteriormente. La enzima AmpErase® UNG se puede utilizar para evitar la contaminación cruzada. Nota: Para obtener más información acerca de AmpErase® UNG, consulte la Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 7 Capítulo 1 Introducción Acerca de los experimentos de cuantificación relativa Reactivos Reactivos TaqMan® y SYBR® Green Applied Biosystems ofrece reactivos TaqMan® y SYBR® Green para utilizarlos en el sistema StepOne. Ambos tipos de reactivos se describen brevemente en la siguiente tabla. Tipo de reactivo Reactivos o kits TaqMan® Proceso PCR y detección de cDNA a. Componentes del ensayo Descripción MGB Cebador reverso Sonda Los reactivos TaqMan utilizan una sonda fluorogénica para permitir la detección de un producto de PCR específico cuando se acumula durante los ciclos de PCR. Ventajas F Cebador directo 3' Q 5' Molde de cDNA cDNA 3' 5' Leyenda b. Molde desnaturalizado e hibridación de los componentes del ensayo • Aumenta la especificidad con una sonda. La hibridación específica entre la sonda y el gen diana genera una señal de fluorescencia. • Permite el trabajo en multiplex. • Hay disponibles ensayos optimizados. • Permite realizar ensayos de 5′ nucleasas durante la PCR. • Se puede utilizar para la RT-PCR de 1 o 2 pasos. 3' 5' Cebador reverso MGB Sonda F 3' 5' Apantallador MGB Ligando de unión al surco menor AmpliTaq Gold ® DNA Polymerase 3' 5' Sonda Cebador reverso Cebador F Cebador directo MGB 5' Q 3' 3' 5' Molde Cebador extendido Paso 1: Configuración de la reacción El fluorocromo SYBR® Green I emite una fluorescencia cuando se une a DNA de doble cadena. Los reactivos SYBR Green utilizan el fluorocromo SYBR® Green I, que se une a DNA de doble cadena y permite detectar productos de PCR cuando se acumulan durante los ciclos de la reacción. Paso 2: Desnaturalización Cuando el DNA se desnaturaliza, se libera el fluorocromo SYBR® Green I y la fluorescencia disminuye considerablemente. Ventajas Se une de manera no específica a todas las secuencias de DNA de doble cadena. Para evitar señales positivas falsas, compruebe la formación de un producto no específico utilizando un gel de agarosa o las curvas de fusión. Fluorocromo FAM™ Q c. Generación de señal Descripción Limitaciones Cebador aleatorio F Q Cebador directo Reactivos SYBR® Green • Económico (no se necesita una sonda). • Permite que los análisis de curvas de fusión midan la Tm de todos los productos de PCR. • Se puede utilizar para la RT-PCR de 1 o 2 pasos. RP CEBADOR DIRECTO Paso 3: Polimerización Durante la extensión, los cebadores se hibridan y se genera el producto de PCR. CEBADOR REVERSO Paso 4: Polimerización completada El fluorocromo SYBR® Green I se une al producto bicatenario, lo que produce un aumento neto de la fluorescencia que detecta el instrumento. ¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso de fluorocromo TAMRA™ como notificador o apantallador en el sistema StepOne™. Notas 8 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 1 Introducción Cómo utilizar esta guía Otros reactivos Se pueden utilizar otros reactivos basados en fluorescencia en el sistema StepOne, pero se debe tener en cuenta lo siguiente: • El software StepOne calcula automáticamente los volúmenes de reacción de los reactivos TaqMan y SYBR Green, pero no lo hace con otros reactivos. • Se debe diseñar el experimento con el flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada), en lugar de con el asistente de diseño. (Consulte “Flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada)” en la página 206.) Para obtener más información Para obtener más información acerca de los experimentos de PCR a tiempo real, las opciones de PCR y los reactivos, consulte la Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System. Cómo utilizar esta guía Esta guía sirve a la vez de tutorial y de guía para realizar sus propios experimentos. Uso de esta guía como tutorial Si emplea los datos de los experimentos de ejemplo que se incluyen con el software StepOne, esta guía le puede servir de tutorial para realizar un experimento de curva estándar relativa o CT comparativos en el sistema StepOne. Siga los procedimientos que se indican en los capítulos correspondientes: Capítulo Procedimiento Curva estándar relativa CT comparativos 2 6 Diseñe el experimento con el asistente de diseño del software StepOne. 3 7 Prepare el experimento con los reactivos y los volúmenes que ha calculado el asistente de diseño en el capítulo 2 (experimento de curva estándar relativa) o en el capítulo 6 (experimento de CT comparativos). 4 8 Realice el experimento en el instrumento StepOne (disposición autónoma o conectada). 5 9 Analice los resultados. Para obtener más información, consulte “Acerca del experimento de ejemplo” en la página 10. Uso de esta guía con sus propios experimentos Después de realizar los ejercicios del tutorial de los capítulos 2 a 9, esta guía le puede servir para guiarle por el flujo de trabajo del asistente de diseño para realizar sus propios experimentos de curva estándar relativa o CT comparativos. Cada uno de los procedimientos de los capítulos 2 - 9 contiene un conjunto de directrices que ofrecen información acerca de cómo realizar sus propios experimentos. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 9 Capítulo 1 Introducción Acerca del experimento de ejemplo Asimismo, puede utilizar cualquiera de los otros flujos de trabajo que se incluyen en el software StepOne para realizar sus experimentos. En la siguiente tabla, se ofrece un resumen de todos los flujos de trabajo disponibles en el software StepOne. Flujo de trabajo Descripción Véase... Design Wizard (Asistente de diseño) Escriba los parámetros del experimento mientras el asistente le guía por los procedimientos óptimos. Capítulo 2 o Capítulo 6 Advanced Setup (Configuración avanzada) Configure un experimento nuevo basándose en su propio criterio. Da flexibilidad de diseño a los usuarios experimentados. página 206 QuickStart (Inicio rápido) Realice un experimento nuevo sin introducir información de la configuración de la placa. página 207 Molde Configure un experimento nuevo utilizando la información de configuración de un molde anterior. página 208 Exportación/ importación Importe diseños de experimentos desde archivos de texto ASCII que contienen información de configuración de los experimentos. página 209 Acerca del experimento de ejemplo Para ilustrar cómo se realizan los experimentos de curva estándar relativa y CT comparativos, esta guía le conduce a través del proceso de diseño, preparación, procesamiento y análisis de un experimento de ejemplo. El experimento de ejemplo representa una configuración típica que puede utilizar para familiarizarse rápidamente con el sistema StepOne. Descripción del experimento de curva estándar relativa de ejemplo El objetivo del experimento de curva estándar relativa de ejemplo es comparar la expresión del factor de transcripción c-myc (una oncoproteína que activa la transcripción de los genes asociados al crecimiento) en los tejidos de hígado y riñón. En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo: • Las muestras son cDNA preparados a partir de RNA total aislado de hígado y riñón. • El gen diana es el gen c-myc humano. • El control endógeno es la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) humano. • La muestra de referencia es RNA aislado de riñón. • Se configura una curva estándar para el gen c-myc (diana). El estándar que se utiliza para la dilución seriada es una muestra de cDNA de una muestra de concentración conocida preparada a partir de RNA aislado de pulmón. • Se configura una curva estándar para el GAPDH (control endógeno). El estándar que se utiliza para la dilución seriada es una muestra de cDNA de una muestra de concentración conocida preparada a partir de RNA aislado de pulmón. Notas 10 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 1 Introducción Acerca del experimento de ejemplo • El experimento está diseñado para una PCR en singleplex, donde los ensayos de gen diana (c-myc) y control endógeno (GAPDH) se amplifican en diferentes pocillos. • Las reacciones están preparadas para una RT-PCR de 2 pasos. Se utiliza HighCapacity cDNA Reverse Transcription Kit para la retrotranscripción y TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix para la PCR. • Se seleccionan ensayos de la línea de productos Applied Biosystems TaqMan® Gene Expression Assays: – Para el ensayo diana (c-myc), el identificador del ensayo es Hs00153408_m1 (RefSeq NM_002467.3). – Para el ensayo de control endógeno (GAPDH), el identificador del ensayo es Hs99999905_m1 (RefSeq NM_002046.2). Disposición de la placa de reacción A continuación, se muestra la disposición de la placa de reacción del experimento de curva estándar relativa de ejemplo. Descripción del experimento de CT comparativos de ejemplo El objetivo del experimento de CT comparativos de ejemplo es comparar la expresión de TP53 (un factor de transcripción que regula otros genes) en tejidos de hígado, riñón y cerebro. En el experimento de CT comparativos de ejemplo: • Las muestras son cDNA preparados a partir de RNA total aislado de hígado, riñón y cerebro. • El gen diana es TP53. • La muestra de referencia es del cerebro. • El control endógeno es GAPDH humano. • El experimento está diseñado para una PCR en singleplex, donde los ensayos de gen diana (c-myc) y control endógeno (GAPDH) se amplifican en diferentes pocillos. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 11 Capítulo 1 Introducción Flujo de trabajo del experimento de ejemplo • Las reacciones están preparadas para una RT-PCR de 2 pasos. Se utiliza HighCapacity cDNA Reverse Transcription Kit para la retrotranscripción y TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix para la PCR. • Se seleccionan ensayos de la línea de productos Applied Biosystems TaqMan® Gene Expression Assays: – Para el ensayo diana (TP53), el identificador del ensayo es Hs00153340_m1 (RefSeq NM_000546.2). – Para el ensayo de control endógeno (GAPDH), se utiliza el kit de control endógeno GAPD (GAPDH) humano (PN 4333764T). Disposición de la placa de reacción A continuación, se muestra la disposición de la placa de reacción del experimento de CT comparativos de ejemplo. Acerca de los datos del experimento de ejemplo Los archivos de datos de los experimentos de ejemplo se instalan con el software StepOne. Encontrará los archivos de los experimentos de ejemplo en su ordenador: <unidad>:\Applied Biosystems\StepOne System\experiments\examples donde <unidad> es la unidad del disco duro del ordenador en la que está instalado el software StepOne. La unidad de instalación predeterminada del software es la unidad C. Flujo de trabajo del experimento de ejemplo La figura de la página 13 muestra el flujo de trabajo de los experimentos de curva estándar relativa y CT comparativos. Notas 12 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 1 Introducción Flujo de trabajo del experimento de ejemplo Experimento de curva estándar relativa Inicio del experimento Experimento de CT comparativos (∆∆CT) Inicio del experimento Diseño del experimento (Capítulo 6) Diseño del experimento (Capítulo 2) 1. Cree un nuevo experimento. 2. Defina las propiedades del experimento. 3. Defina los métodos y los materiales. 4. Configure los genes diana. 5. Configure los estándares. 6. Configure las muestras. 7. Configure la cuantificación relativa. 8. Configure el protocolo de termociclado. 9. Revise la configuración de la reacción. 10.Solicite materiales para el experimento. 11.Finalice el flujo de trabajo del asistente de diseño. 1. Cree un nuevo experimento. 2. Defina las propiedades del experimento. 3. Defina los métodos y los materiales. 4. Configure los genes diana. 5. Configure las muestras. 6. Configure la cuantificación relativa. 7. Configure el protocolo de termociclado. 8. Revise la configuración de la reacción. 9. Solicite materiales para el experimento. 10.Finalice el flujo de trabajo del asistente de diseño. Preparación de las reacciones (Capítulo 7) Preparación de las reacciones (Capítulo 3) 1. 2. 3. 4. 5. Prepare el molde. Prepare las diluciones de las muestras. Prepare la dilución seriada. Prepare la mezcla de reacción para cada ensayo diana. Prepare la placa de reacción. Realización del experimento (Capítulo 4) 1. 2. 3. 4. 5. Prepare la reacción. Active las opciones de notificación. Inicie la reacción. Monitorice la reacción. Descargue el instrumento y transfiera los datos. Análisis del experimento (Capítulo 5) Sección 1. Revisión de los resultados: 1. Analice. 2. Revise la pantalla Standard Curve (Curva estándar). 3. Revise la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación). 4. Revise la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica) o la tabla de pocillos. 5. Presente los datos. Sección 2. Solución de problemas: 1. Revise las opciones de análisis; ajuste la línea basal y el umbral. 2. Revise la pantalla QC Summary (Resumen QC). 3. Omita pocillos. 4. Revise la pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente). 5. Revise la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos). Fin del experimento 1. Prepare el molde. 2. Prepare las diluciones de las muestras. 3. Prepare la mezcla de reacción para cada ensayo diana. 4. Prepare la placa de reacción. Realización del experimento (Capítulo 8) 1. 2. 3. 4. 5. Prepare la reacción. Active las opciones de notificación. Inicie la reacción. Monitorice la reacción. Descargue el instrumento y transfiera los datos. Análisis del experimento (Capítulo 9) Sección 1. Revisión de los resultados: 1. Analice. 2. Revise la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica) o la tabla de pocillos. 3. Revise la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación). 4. Presente los datos. Sección 2. Solución de problemas: 1. Revise las opciones de análisis; ajuste la línea basal y el umbral. 2. Revise la pantalla QC Summary (Resumen QC). 3. Omita pocillos. 4. Revise la pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente). 5. Revise la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos). Fin del experimento Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 13 Capítulo 1 Introducción Flujo de trabajo del experimento de ejemplo Notas 14 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Este capítulo cubre los siguientes temas: ■ Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 ■ Creación de un nuevo experimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 ■ Definición de las propiedades del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 ■ Definición de los métodos y materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 ■ Configuración de los genes diana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 ■ Configuración de los estándares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 ■ Configuración de las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 ■ Configuración de las opciones de cuantificación relativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 ■ Configuración del protocolo de termociclado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 ■ Revisión de la configuración de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 ■ Solicitud de materiales para el experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 ■ Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 Nota: Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o seleccionando Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne). Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 15 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Resumen del capítulo Resumen del capítulo En este capítulo, se explica cómo utilizar el asistente de diseño en el software StepOne™ para configurar el experimento de curva estándar relativa de ejemplo. El asistente de diseño le guiará por los procedimientos óptimos recomendados por Applied Biosystems a medida que vaya introduciendo los parámetros de diseño del experimento de ejemplo. Flujo de trabajo del experimento de ejemplo A continuación, se muestra el flujo de trabajo para diseñar el experimento de ejemplo que se incluye en esta guía de introducción. Nota: Diseñe el experimento de ejemplo con el flujo de trabajo del asistente de diseño del software StepOne. Cuando diseñe sus propios experimentos, puede seleccionar flujos de trabajo alternativos (consulte “Uso de esta guía con sus propios experimentos” en la página 9). Experimento de curva estándar relativa Inicio del experimento Diseño del experimento (Capítulo 2) 1. Cree un nuevo experimento. 2. Defina las propiedades del experimento. 3. Defina los métodos y los materiales. 4. Configure los genes diana. 5. Configure los estándares. 6. Configure las muestras. 7. Configure la cuantificación relativa. 8. Configure el protocolo de termociclado. 9. Revise la configuración de la reacción. 10. Solicite materiales para el experimento. 11. Finalice el flujo de trabajo del asistente de diseño. Preparación de las reacciones (Capítulo 3) Realización del experimento (Capítulo 4) Análisis del experimento (Capítulo 5) Fin del experimento Notas 16 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Creación de un nuevo experimento Creación de un nuevo experimento Cree un experimento nuevo con el asistente de diseño del software StepOne. Creación de un experimento 1. Haga doble clic en (acceso directo al software StepOne) o seleccione Start (Inicio)All Programs (Todos los programas)Applied BiosystemsStepOneStepOne v2.0. 2. En la pantalla Home (Inicio), haga clic en diseño) para abrir el asistente de diseño. Design Wizard (Asistente de 2 3. Consulte “Elementos del software” más adelante para obtener información acerca de la navegación por el asistente de diseño. Elementos del software A continuación, se ilustran los elementos del software StepOne para el asistente de diseño. 1. Barra de menús: muestra los menús disponibles en el software: • File (Archivo) • Edit (Edición) • Instrument (Instrumento) • Analysis (Análisis) • Tools (Herramientas) • Help (Ayuda) Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 17 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Creación de un nuevo experimento 2. Barra de herramientas: muestra las herramientas disponibles en el software: • New Experiment (Experimento nuevo) • Open (Abrir) • Close (Cerrar) • Send Experiment to Instrument (Enviar experimento al instrumento) • Download Experiment from Instrument (Descargar experimento del instrumento) 3. Cabecera del experimento: indica el nombre del experimento, el tipo de experimento y los reactivos del experimento abierto. 4. Panel de navegación: ofrece enlaces a todas las pantallas del asistente de diseño: • Experiment Properties (Propiedades del experimento) • Methods & Materials (Métodos y materiales) • Targets (Dianas) • Opciones de cuantificación relativa • Standards (Estándares) • Samples (Muestras) • Run Method (Protocolo de termociclado) • Reaction Setup (Configuración de la reacción) • Materials List (Lista de materiales) Nota: Inicialmente, el asistente de diseño muestra el tipo de experimento Quantitation - Standard Curve (Cuantificación: curva estándar). Las pantallas disponibles de este asistente pueden cambiar si se selecciona otro tipo de experimento. Por ejemplo, la pantalla Relative Quantitation Settings (Opciones de cuantificación relativa) no aparece hasta que se selecciona el tipo de experimento de curva estándar o CT comparativos (∆∆CT). Notas 18 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Creación de un nuevo experimento 5. Fichas del experimento: muestra una ficha por cada experimento abierto. 1 2 3 4 5 Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 19 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Definición de las propiedades del experimento Definición de las propiedades del experimento En la pantalla Experiment Properties (Propiedades de experimento), escriba la información de identificación del experimento y, a continuación, seleccione el tipo de experimento que desea diseñar. Acerca del experimento de ejemplo Pantalla Experiment Properties (Propiedades de experimento) En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo: • El experimento se identifica como un ejemplo. • Se utiliza una MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate. • El tipo de experimento es de cuantificación. 1. Haga clic en el campo Experiment Name (Nombre de experimento) y, a continuación, escriba Relative Standard Curve Example (Ejemplo de curva estándar relativa). Nota: La cabecera del experimento se actualiza con el nombre del experimento que acaba de escribir. 2. Haga clic en el campo Barcode (Código de barras) y, a continuación, escriba el código de barras que aparece en la placa de reacción de PCR, si es que dispone de uno. 3. Haga clic en el campo User Name (Nombre de usuario) y, a continuación, escriba Example User (Usuario de ejemplo). 4. Haga clic en el campo Comments (Comentarios) y, a continuación, escriba Relative Standard Curve Getting Started Guide Example (Ejemplo de la guía de introducción de las curvas estándar relativas). 5. Seleccione Quantitation (Cuantificación) en el tipo de experimento. 6. Haga clic en Next (Siguiente) >. Notas 20 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Definición de las propiedades del experimento 1 2 3 4 5 Directrices de diseño Cuando diseñe su propio experimento de curva estándar relativa: • Escriba un nombre para el experimento que sea descriptivo y fácil de recordar. El nombre del experimento se utiliza como nombre de archivo predeterminado del experimento. Puede introducir hasta 100 caracteres en el campo Experiment Name (Nombre de experimento). Nota: No se pueden utilizar los siguientes caracteres en en campo Experiment Name (Nombre de experimento): barra inclinada hacia delante (/), barra inclinada hacia atrás (\), signo mayor que (>), signo menor que (<), asterisco (*), signo de interrogación (?), comillas ("), línea vertical (|), dos puntos (:) o punto y coma (;). • Utilice MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plates, MicroAmp™ Fast 8-Tube Strips o MicroAmp® Fast Reaction Tubes with Caps. Los consumibles tipo rápido se pueden utilizar tanto con reactivos de modo rápido como de modo estándar. • (Opcional) Introduzca el código de barras de la placa de reacción de PCR, si es que lo tiene. Puede introducir hasta 100 caracteres en el campo Barcode (Código de barras). • (Opcional) Escriba un nombre de usuario para identificar al propietario del experimento. Puede introducir hasta 100 caracteres en el campo User Name (Nombre de usuario). • (Opcional) Escriba comentarios para describir el experimento. Puede introducir hasta 1000 caracteres en el campo Comments (Comentarios). • Seleccione Quantitation (Cuantificación) en el tipo de experimento. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 21 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Definición de los métodos y materiales Para obtener más información Para obtener más información acerca de: • La pantalla Experiment Properties (Propiedades de experimento), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. • Consumibles, consulte “Consumibles admitidos” en la página 3. • Experimentos de cuantificación, consulte la Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System. Definición de los métodos y materiales En la pantalla Methods & Materials (Métodos y materiales), seleccione el método de cuantificación, los reactivos, la velocidad de rampa y el tipo de molde que se van a utilizar en el experimento. Acerca del experimento de ejemplo Pantalla Methods & Materials (Métodos y materiales) En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo: • • • • Se utiliza el método de cuantificación de curva estándar relativa. Se utilizan reactivos TaqMan®. Se utiliza la velocidad de rampa rápida en el protocolo de termociclado. cDNA (preparado a partir de RNA total aislado de hígado y riñón) es el tipo de molde. Para obtener el molde de cDNA, primero hay que realizar una retrotranscripción de RNA para convertir el RNA en cDNA (consulte “Preparación del molde” en la página 51). 1. Seleccione Relative Standard Curve (Curva estándar relativa) como método de cuantificación. 2. Seleccione ensayos TaqMan® para los reactivos. 3. Seleccione Fast (~40 minutes to complete a run) (Rápido (40 minutos aproximadamente para completar una reacción)) para la velocidad de la rampa. 4. Seleccione cDNA (complementary DNA) (cDNA (DNA complementario)) para el tipo de molde. 5. Haga clic en Next (Siguiente) >. Notas 22 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Definición de los métodos y materiales 1 2 3 4 Directrices de diseño Cuando diseñe su propio experimento de curva estándar relativa: • Seleccione Relative Standard Curve (Curva estándar relativa) como método de cuantificación. Los experimentos de curva estándar relativa determinan el cambio de expresión de un gen diana en una muestra en relación con el mismo gen diana de una muestra de referencia. Para conseguir los resultados, se utiliza una curva estándar construida a partir de una dilución seriada de cantidad conocida. Para configurar la placa de reacción, el método de curva estándar relativa requiere dianas, estándares, muestras, una muestra de referencia y un control endógeno. • Seleccione los reactivos que desea utilizar: – Seleccione Reagents TaqMan® (ensayos TaqMan®) si desea utilizar estos reactivos para detectar la amplificación y cuantificar la cantidad de gen diana en las muestras. Los reactivos TaqMan se componen de dos cebadores y una sonda TaqMan®. Los cebadores están diseñados para amplificar el gen diana. La sonda TaqMan está diseñada para hibridar en el gen diana y generar una señal de fluorescencia cuando se amplifica el gen diana. ¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo TAMRA™ como notificador o apantallador en el sistema StepOne™. – Seleccione SYBR® Green Reagents (reactivos SYBR® Green) si desea utilizar estos reactivos para detectar la amplificación y cuantificar la cantidad de gen diana en las muestras. Los reactivos SYBR Green se componen de dos cebadores y un fluorocromo SYBR Green. Los cebadores están diseñados para amplificar el Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 23 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Definición de los métodos y materiales gen diana. El fluorocromo SYBR Green genera señal de fluorescencia cuando se une a DNA de doble cadena. El fluorocromo SYBR Green suele formar parte de la mezcla maestra SYBR Green que se añade a la reacción. Si utiliza el fluorocromo SYBR Green: Active la casilla de verificación Include Melt Curve (Incluir curva de disociación) para realizar un análisis de curva de disociación del gen diana amplificado. Seleccione Standard (Estándar) para la velocidad de la rampa. Applied Biosystems no dispone de una mezcla maestra que funcione en modo rápido para reactivos SYBR Green. Nota: Se pueden utilizar otros reactivos basados en fluorescencia en el sistema StepOne; sin embargo, debe diseñar su experimento con el flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) en lugar de con el asistente de diseño. Consulte “Flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada)” en la página 206. • Seleccione la velocidad de rampa apropiada para el protocolo de termociclado: – Seleccione Fast (~40 Minutes to Complete a Run) (Rápido (aproximadamente 40 minutos para completar una reacción)) si utiliza reactivos tipo rápido para las reacciones de PCR. – Seleccione Standard (~2 Hours to Complete a Run) (Estándar (aproximadamente 2 horas para completar una reacción)) si utiliza reactivos estándar para las reacciones de PCR (incluidos reactivos SYBR Green y reactivos TaqMan estándar). • Seleccione el molde para la PCR apropiado: – Seleccione cDNA (complementary DNA) (cDNA (DNA complementario)) si va a realizar una RT-PCR de 2 pasos y ya ha realizado la retrotranscripción para convertir el RNA en cDNA. Se añade DNA complementario a las reacciones de PCR. – Seleccione RNA si va a realizar una RT-PCR de 1 paso. Se añade el RNA o mRNA total a las reacciones de PCR. – Seleccione gDNA (genomic DNA) (gDNA (DNA genómico)) si ya ha extraído el gDNA de un tejido o una muestra. Se añade DNA genómico purificado a las reacciones de PCR. Para obtener más información Para obtener más información acerca de: • La pantalla Methods & Materials (Métodos y materiales), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. • El uso del método de cuantificación de CT comparativos, consulte los capítulos 6 -9 de esta guía. • El uso del método de cuantificación de curva estándar, consulte la Guía de introducción a StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de curva estándar. • Los reactivos TaqMan y SYBR Green, consulte la Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System. Notas 24 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Configuración de los genes diana • La PCR, incluida la PCR en singleplex y en multiplex, y la RT - PCR de 1 y de 2 pasos, consulte la Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System. Configuración de los genes diana En la pantalla Targets (Dianas), escriba el número de genes diana que desea cuantificar en la placa de reacción de PCR y, a continuación, configure el ensayo para cada gen diana. Acerca del experimento de ejemplo Pantalla Targets (Dianas) En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo: • Se cuantifican dos dianas en la placa de reacción. • Se activa la casilla de verificación Set Up Standards (Configurar estándares). Cuando se activa esta casilla de verificación, el software muestra automáticamente la pantalla Standards (Estándares) después de completar la pantalla Targets (Dianas). En la pantalla Standards (Estándares), se puede configurar una curva estándar para cada ensayo diana (consulte “Configuración de los estándares” en la página 28). • El ensayo Target 1 (Diana 1) está configurado para el gen diana que se está estudiando. En el experimento de ejemplo, se trata del gen c-myc humano (una oncoproteína que activa la transcripción de los genes asociados al crecimiento). • El ensayo Target 2 (Diana 2) se configura para el control endógeno. Para el experimento de ejemplo, se trata de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) humano. El GAPDH se utiliza como control endógeno, porque sus niveles de expresión suelen ser relativamente estables. 1. Haga clic en el campo How many targets do you want to quantify in the reaction plate? (¿Cuántas dianas desea cuantificar en la placa de reacción?) y, a continuación, escriba 2. Nota: El número de filas de la tabla de ensayos diana se actualiza con el número que escriba. 2. Active la casilla de verificación Set Up Standards (Configurar estándares) para configurar estándares para ambos ensayos diana. Nota: La casilla de verificación Set Up Standards (Configurar estándares) está activada de manera predeterminada. 3. Configure el ensayo Target 1 (Diana 1): a. Haga clic en la celda Enter Target Name (Escriba nombre de gen diana) y, a continuación, escriba c-myc. b. En el menú desplegable Reporter (Notificador), seleccione FAM (predeterminado). Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 25 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Configuración de los genes diana c. En el menú desplegable Quencher (Apantallador), seleccione NFQ-MGB (predeterminado). d. Deje la opción predeterminada en el campo Color. 4. Configure el ensayo Target 2 (Diana 2): a. Haga clic en la celda Enter Target Name (Escriba nombre de gen diana) y, a continuación, escriba GAPDH. b. En el menú desplegable Reporter (Notificador), seleccione FAM (predeterminado). c. En el menú desplegable Quencher (Apantallador), seleccione NFQ-MGB (predeterminado). d. Deje la opción predeterminada en el campo Color. 5. Haga clic en Next (Siguiente) >. Nota: En todos los genes diana, deje en blanco el campo (Optional) Enter Gene Name ((Opcional) Escriba el nombre del gen). Puede buscar el identificador del gen/ensayo para solicitar los materiales (consulte “Solicitud de materiales para el experimento” en la página 43). 1 3 4 2 Directrices de diseño Cuando diseñe su propio experimento de CT comparativos: • Active la casilla de verificación Set Up Standards (Configurar estándares). Applied Biosystems recomienda configurar una curva estándar para cada ensayo diana en la placa de reacción. • Identifique cada ensayo diana con un nombre y un color únicos. Puede introducir hasta 100 caracteres en el campo Target Name (Nombre de gen diana). Notas 26 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Configuración de los genes diana • Seleccione un control endógeno para cada muestra. El control endógeno es un gen diana que está presente en todas las muestras que se están investigando. Se debería expresar por igual en todos los tipos de muestras, con independencia del tratamiento o el origen del tejido (ejemplos de controles endógenos: β-actina, GAPDH y RNA ribosomal 18S [rRNA 18S]). El control endógeno se utiliza para normalizar los resultados de la PCR, ya que corrige las variaciones en la cantidad de molde, la eficiencia de extracción del ácido nucleico, la eficiencia de la retrotranscripción y los errores de calibración de las pipetas. Tenga en cuenta que: – Cada tipo de muestra (por ejemplo, cada tejido de un estudio en el que se comparan múltiples tejidos) requiere un control endógeno. – Si las muestras están distribuidas en múltiples placas, cada placa debe tener un control endógeno. Asimismo, cada placa debe incluir un control endógeno para cada tipo de muestra de la placa. • Seleccione el fluorocromo del notificador utilizado en el ensayo diana: – Seleccione FAM si el fluorocromo FAM™ está unido al extremo de 5′ de la sonda TaqMan que se utiliza para detectar el gen diana. – Seleccione JOE si el fluorocromo JOE™ está unido al extremo de 5′ de la sonda TaqMan que se utiliza para detectar el gen diana. – Seleccione VIC si el fluorocromo VIC® está unido al extremo de 5′ de la sonda TaqMan que se utiliza para detectar el gen diana. – Seleccione SYBR si utiliza fluorocromo SYBR® Green para detectar DNA de doble cadena. • Seleccione el apantallador utilizado en el ensayo diana: – Seleccione NFQ-MGB si en el extremo 3′ de a sonda TaqMan que está utilizando para detectar el gen diana hay unido un apantallador no fluorescente de unión al surco menor de la doble cadena de DNA. – Seleccione None (Ninguno) si se utiliza el fluorocromo SYBR Green. ¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso de fluorocromo TAMRA™ como notificador o apantallador en el sistema StepOne™. Para obtener más información Para obtener más información acerca de: • La pantalla Targets (Dianas), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. • La selección de un control endógeno, consulte la nota de aplicación Using TaqMan® Endogenous Control Assays to Select an Endogenous Control for Experimental Studies. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 27 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Configuración de los estándares Configuración de los estándares En la pantalla Standards (Estándares), escriba el número de puntos y réplicas de todas las curvas estándar de la placa de reacción. Para cada curva estándar, escriba la cantidad inicial y seleccione el factor de dilución. Acerca del experimento de ejemplo Pantalla Standards (Estándares) En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo: • Se configura una curva estándar para el gen diana (c-myc). El estándar que se utiliza para la dilución seriada es una muestra de cDNA de una muestra de concentración conocida preparada a partir de RNA aislado de pulmón. • Se configura una curva estándar para el control endógeno (GAPDH). El estándar que se utiliza para la dilución seriada es una muestra de cDNA de una muestra de concentración conocida preparada a partir de RNA aislado de pulmón. • Para cada curva estándar: – Se utilizan cinco puntos en la curva estándar. – Se utilizan tres réplicas para cada punto. Las réplicas son reacciones idénticas que contienen componentes y volúmenes idénticos. – La cantidad inicial es 200 ng y el factor de dilución es 1:10. 1. Haga clic en el campo How many points do you need for each standard curve? (¿Cuántos puntos necesita por cada curva estándar?) y, a continuación, escriba 5. 2. Haga clic en el campo How many replicates do you need for each point? (¿Cuántas réplicas necesita para cada punto?) y, a continuación, escriba 3. 3. Defina el rango de cantidades estándar para el ensayo de c-myc: a. Haga clic en el campo Enter Starting Quantity (Escriba cantidad inicial) y, a continuación, escriba 200. b. En el menú desplegable Select Serial Factor (Seleccionar factor de dilución), seleccione 1:10. 4. Defina el rango de cantidades estándar para el ensayo de GAPDH: a. Haga clic en el campo Enter Starting Quantity (Escriba cantidad inicial) y, a continuación, escriba 200. b. En el menú desplegable Select Serial Factor (Seleccionar factor de dilución), seleccione 1:10. 5. Revise el panel Standard Curve Preview (Vista previa de la curva estándar) para cada ensayo. La curva estándar tiene los siguientes puntos: 200, 20, 2, 0,2 y 0,02. 6. Haga clic en Next (Siguiente) >. Notas 28 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Configuración de los estándares 1 2 3a 3b 5 Si es necesario, utilice la barra de desplazamiento para ver el GAPDH y, a continuación, realice los pasos 4a y 4b. Directrices de diseño Cuando diseñe su propio experimento de curva estándar relativa: • Configure una curva estándar para cada gen diana de la placa de reacción. Los genes diana se definen previamente en la pantalla Targets (Dianas) (“Configuración de los genes diana” en la página 25). • Escriba el número de puntos para cada curva estándar de la placa de reacción. Applied Biosystems recomienda al menos cinco puntos de dilución por cada curva estándar. • Escriba el número de reacciones idénticas (réplicas) para cada punto de la curva estándar. Applied Biosystems recomienda tres réplicas para cada punto. • Dado que el rango de cantidades estándar afecta al cálculo de la eficiencia de la amplificación, estudie cuidadosamente el rango de cantidades estándar apropiado para su ensayo: – Para obtener medidas más precisas de la eficiencia de la amplificación, utilice un amplio rango de cantidades estándar, de entre 5 y 6 órdenes de magnitud. Si especifica un amplio rango de cantidades para los estándares, debe utilizar un producto de PCR o un molde muy concentrado como, por ejemplo, un cDNA clonado. – Si tiene una cantidad limitada de molde de cDNA y/o si el gen diana es un tránscrito de bajo número de copias, o se sabe que está en un rango determinado, puede que sea necesario un rango menor de cantidades estándar. • El factor de dilución sirve para calcular las cantidades de todos los puntos de la curva estándar. Si la cantidad inicial es la cantidad más alta, seleccione un factor de dilución como, por ejemplo, 1:2, 1:3, etc. Si la cantidad inicial es la cantidad menor, seleccione un factor de concentración como, por ejemplo, 2✕, 3✕, etc. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 29 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Configuración de las muestras Para obtener más información Para obtener más información acerca de: • La pantalla Standards (Estándares), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. • La eficiencia de la amplificación, consulte Amplification Efficiency of TaqMan® Gene Expression Assays Application Note. Configuración de las muestras En la pantalla Samples (Muestras), escriba el número de muestras, réplicas y controles negativos que va a incluir en la placa de reacción, escriba los nombres de las muestras y, a continuación, seleccione las reacciones de muestra/diana que va a configurar. Acerca del experimento de ejemplo Pantalla Samples (Muestras) En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo: • Se utilizan dos muestras: cDNA preparado a partir de RNA total aislado de hígado y riñón. Las muestras contienen cantidades desconocidas del gen c-myc (diana) y del gen GAPDH (control endógeno). • Se utilizan tres réplicas. Las réplicas son reacciones idénticas que contienen componentes y volúmenes idénticos. • Se utilizan tres controles negativos. Las reacciones de control negativo contienen agua en lugar de la muestra y no se deberían amplificar. 1. Haga clic en el campo How many samples do you want to test in the reaction plate? (Cuántas muestras desea probar en la placa de reacción?) y, a continuación, escriba 2. Nota: El número de filas de la tabla de las muestras se actualiza con el número que escriba. 2. Haga clic en el campo How many replicates do you need? (¿Cuántas réplicas necesita?) y, a continuación, escriba 3. 3. Haga clic en el campo How many negative controls do you need for each target assay? (¿Cuántos controles negativos necesita para cada ensayo diana?) y, a continuación, escriba 3. 4. Configure la muestra 1: a. Haga clic en el campo Enter Sample Name (Escriba nombre de muestra) y, a continuación, escriba Liver (Hígado). b. Deje la opción predeterminada en el campo Color. 5. Configure la muestra 2: a. Haga clic en el campo Enter Sample Name (Escriba nombre de muestra) y, a continuación, escriba Kidney (Riñón). b. Deje la opción predeterminada en el campo Color. Notas 30 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Configuración de las muestras 6. Seleccione All Sample/Target Reactions (Todas las reacciones de muestra/diana) para configurar todos los genes diana de todas las muestras. 7. En el panel Well Count (Número de pocillos), confirme que hay: • 12 pocillos desconocidos • 30 pocillos estándar • 6 pocillos de control negativo • 0 pocillos vacíos 8. En la ficha View Plate Layout (Ver disposición de placa): a. En el menú desplegable Arrange Plate by (Ordenar placa por), seleccione Rows (Filas) (predeterminado). b. En el menú desplegable Place Negative Controls (Colocar controles negativos), seleccione Upper Left (Superior izquierda) (predeterminado). 9. Haga clic en Next (Siguiente) >. 8a 1 2 3 8b 4 5 6 7 Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 31 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Configuración de las opciones de cuantificación relativa Directrices de diseño Cuando diseñe su propio experimento de curva estándar relativa: • Identifique cada muestra con un nombre y un color únicos. Puede introducir hasta 100 caracteres en el campo Sample Name (Nombre de muestra). • Escriba el número de reacciones idénticas (réplicas) que desea configurar. Applied Biosystems recomienda tres réplicas para cada reacción de muestra. • Escriba el número de reacciones de control negativo que desea configurar. Applied Biosystems recomienda tres reacciones de control negativo por cada ensayo diana. • Seleccione la combinación de reacciones de muestra/diana deseada: – Seleccione All Sample/Target Reactions (Todas las reacciones de muestra/diana) para configurar todos los genes diana de todas las muestras. – Seleccione Specify Sample/Target Reactions (Especifique reacciones de muestra/diana) para configurar de uno en uno los genes diana que se van a amplificar en cada muestra. Nota: En el asistente de diseño, cada reacción de PCR sólo puede contener una muestra y un ensayo diana. Para obtener más información Para obtener más información acerca de la pantalla Samples (Muestras) , acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. Configuración de las opciones de cuantificación relativa En la pantalla Relative Quantitation Settings (Opciones de cuantificación relativa), seleccione la muestra de referencia y el control endógeno para realizar la cuantificación relativa. Acerca del experimento de ejemplo Pantalla Relative Quantitation Settings (Opciones de cuantificación relativa) En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo: • El tejido del riñón se utiliza como muestra de referencia. • GAPDH se utiliza como control endógeno. 1. En el menú desplegable Which sample do you want to use as the reference sample? (¿Qué muestra desea utilizar como muestra de referencia?), seleccione Kidney (Riñón). 2. En el menú desplegable Which target do you want to use as the endogenous control? (¿Qué diana desea utilizar como control endógeno?), seleccione GAPDH. 3. Haga clic en Next (Siguiente) >. Notas 32 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Configuración del protocolo de termociclado 1 2 Directrices de diseño Para obtener más información Cuando diseñe su propio experimento de curva estándar relativa: • Seleccione una muestra de referencia entre las muestras creadas anteriormente (“Configuración de las muestras” en la página 30). Los resultados de la amplificación de las muestras se comparan con los resultados de la amplificación de la muestra de referencia para determinar la expresión relativa. • Seleccione un control endógeno en los ensayos diana creados previamente (“Configuración de los genes diana” en la página 25). Los resultados de la amplificación del control endógeno se utilizan para normalizar los resultados de la amplificación de el gen diana para corregir las diferencias en la cantidad de molde añadida a cada reacción. Para obtener más información acerca de: • La pantalla Relative Quantitation Settings (Opciones de cuantificación relativa), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. • Muestras de referencia (también denominadas calibradores) y controles endógenos, consulte User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression. Configuración del protocolo de termociclado En la pantalla Run Method (Protocolo de termociclado), revise el volumen de la reacción y el perfil térmico del protocolo de termociclado predeterminado. Si es necesario, puede editar el protocolo de termociclado predeterminado o sustituirlo por otro de la biblioteca Run Method (Protocolo de termociclado). Acerca del experimento de ejemplo En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, se utiliza el protocolo de termociclado predeterminado sin modificaciones. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 33 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Configuración del protocolo de termociclado Revisión de la pantalla Run Method (Protocolo de termociclado) 1. Haga clic en la ficha Graphical View (Vista gráfica) (predeterminada) o Tabular View (Vista tabular). 2. Asegúrese de que en el campo Reaction Volume Per Well (Volumen de reacción por pocillo) aparece 20 µL. 3. Asegúrese de que en el perfil térmico aparecen las etapas y los ciclos que se indican a continuación. 4. Haga clic en Next (Siguiente) >. 1 2 3 Directrices de diseño Para obtener más información Cuando diseñe su propio experimento de curva estándar relativa: • Escriba un número entre 10 y 30 para el volumen de reacción/pocillo. El sistema StepOne admite volúmenes de reacción de entre 10 y 30 µL. • Revise el perfil térmico: – Asegúrese de que el perfil térmico es apropiado para los reactivos. – Si va a realizar una RT-PCR de 1 paso, incluya un paso de retrotranscripción. Si el experimento necesita un perfil térmico diferente, modifique el perfil térmico o cambie el protocolo de termociclado por otro de la biblioteca Run Method (Protocolo de termociclado). La biblioteca Run Method (Protocolo de termociclado) está incluida en el software StepOne. Para obtener más información acerca de la biblioteca Run Method (Protocolo de termociclado) o acerca de la pantalla Run Method (Protocolo de termociclado), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. Notas 34 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Revisión de la configuración de la reacción Revisión de la configuración de la reacción En la pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción), seleccione el tipo de ensayo (si utiliza reactivos TaqMan) y, a continuación, revise los volúmenes calculados para preparar las reacciones de PCR, las series de dilución estándar y las diluciones de las muestras. Si es necesario, puede editar el volumen de reacción, el volumen de reacción de exceso, las concentraciones de los reactivos, la concentración del estándar y/o la concentración de la muestra diluida. ¡IMPORTANTE! Realice estos pasos para cada ensayo diana de la placa de reacción. Acerca del experimento de ejemplo Pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción) En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo: Se utilizan Applied Biosystems TaqMan® Gene Expression Assays. El volumen de reacción por pocillo es 20 µL. El volumen de reacción de exceso es del 10%. Los componentes de la reacción son: – TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕) – Ensayo de c-myc (20✕) – Ensayo de GAPDH (20✕) – Muestra o estándar – Agua • La concentración del estándar en la solución de partida es de 200 ng/µL. • La concentración de la muestra diluida es de 5,0 ng/µL. • La concentración de la solución de partida de la muestra es de 100 ng/µL. • • • • Complete la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción) para el ensayo de c-myc 1. Seleccione la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción) (predeterminada). 2. En el panel Select Target (Seleccionar diana), seleccione c-myc. 3. En el menú desplegable Assay Type (Tipo de ensayo), seleccione Inventoried/Made to Order (En inventario/Fabricado bajo pedido). 4. Asegúrese de que en el campo Reaction Volume Per Well (Volumen de reacción por pocillo) aparece 20 µL. 5. Asegúrese de que en el campo Excess Reaction Volume (Volumen de reacción en exceso) muestra 10%. 6. En el panel Reactions for c-myc (Reacciones para c-myc): a. Asegúrese de que en el campo Master Mix Concentration (Concentración de mezcla maestra) aparece 2✕. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 35 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Revisión de la configuración de la reacción b. Asegúrese de que en el campo Assay Mix Concentration (Concentración de ensayo) aparece 20✕. c. Revise los componentes y los volúmenes calculados para las reacciones de PCR: Componente Volumen (µL) para 1 reacción Mezcla maestra (2✕) 10,0 Ensayo (20✕) 1,0 Muestra (10✕) o estándar 2,0 ‡ H2O 7,0 Volumen total 20,0 ‡ El volumen de la muestra o estándar se limita al 10% del volumen total de la reacción. 3 4 5 1 2 6a 6b 6c 7. En el panel Standard Dilution Series for c-myc (Dilución seriada estándar para c-myc): a. Haga clic en el campo Standard Concentration in Stock (Concentración del estándar en la solución de partida) y, a continuación, escriba 200. b. En el campo de las unidades, seleccione ng per µL (ng por L) (predeterminado) en el menú desplegable. c. Revise los volúmenes calculados para preparar la dilución seriada: Notas 36 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Revisión de la configuración de la reacción Dilución Solución origen Volumen de solución origen (µL) Volumen de disolvente (µL) Volumen total (µL) Concentración del estándar (ng/µL) 1 [200] Solución origen 5,0 5,0 10,0 100,0 2 [20] Dilución 1 1,0 9,0 10,0 10,0 3 [2] Dilución 2 1,0 9,0 10,0 1,0 4 [0,2] Dilución 3 1,0 9,0 10,0 0,1 5 [0,02] Dilución 4 1,0 9,0 10,0 0,01 7a 7b 7c Complete la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción) para el ensayo de GAPDH 1. Seleccione la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción) (predeterminada). 2. En el panel Select Target (Seleccionar diana), seleccione GAPDH. 3. En el menú desplegable Assay Type (Tipo de ensayo), seleccione Inventoried/Made to Order (En inventario/Fabricado bajo pedido). 4. Asegúrese de que en el campo Reaction Volume Per Well (Volumen de reacción por pocillo) aparece 20 µL. 5. Asegúrese de que en el campo Excess Reaction Volume (Volumen de reacción en exceso) muestra 10%. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 37 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Revisión de la configuración de la reacción 6. En el panel Reactions for GAPDH (Reacciones para GAPDH): a. Asegúrese de que en el campo Master Mix Concentration (Concentración de mezcla maestra) aparece 2✕. b. Asegúrese de que en el campo Assay Mix Concentration (Concentración de ensayo) aparece 20✕. c. Revise los componentes y los volúmenes calculados para las reacciones de PCR: Componente Volumen (µL) para 1 reacción Mezcla maestra (2✕) 10,0 Ensayo (20✕) 1,0 Muestra (10✕) o estándar 2,0 ‡ H2O 7,0 Volumen total 20,0 ‡ El volumen de la muestra o estándar se limita al 10% del volumen total de la reacción. 3 4 5 1 2 6a 6b 6c 7. En el panel Standard Dilution Series for GAPDH (Dilución seriada estándar para GAPDH): a. Haga clic en el campo Standard Concentration in Stock (Concentración del estándar en solución de partida) y, a continuación, escriba 200. b. En el campo de las unidades, seleccione ng per µL (ng por L) (predeterminado) en el menú desplegable. Notas 38 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Revisión de la configuración de la reacción c. Revise los volúmenes calculados para preparar la dilución seriada: Dilución Solución origen Volumen de solución origen (µL) Volumen de disolvente (µL) Volumen total (µL) Concentración del estándar (ng/µL) 1 [200] Solución origen 5,0 5,0 10,0 100,0 2 [20] Dilución 1 1,0 9,0 10,0 10,0 3 [2] Dilución 2 1,0 9,0 10,0 1,0 4 [0,2] Dilución 3 1,0 9,0 10,0 0,1 5 [0,02] Dilución 4 1,0 9,0 10,0 0,01 7a 7b 7c Complete la ficha Sample Dilution Calculations (Cálculos de la dilución de muestra) 1. Seleccione la ficha Sample Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de muestra). 2. Haga clic en el campo Diluted Sample Concentration (10✕ for Reaction Mix) (Concentración de muestra diluida (10X por mezcla de reacción)) y, a continuación, escriba 5,0. 3. En el menú desplegable de la unidad, seleccione ng/µL (predeterminado). Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 39 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Revisión de la configuración de la reacción 4. Revise los volúmenes calculados para las diluciones de las muestras: Concentración de la solución origen (ng/µL) Volumen de muestra (µL) Volumen de disolvente (µL) Volumen total de muestra diluida (µL) Hígado 100,0 1,0 19,0 20,0 Riñón 100,0 1,0 19,0 20,0 Nombre de la muestra 1 2 3 4 Imprima las instrucciones de la configuración de la reacción Imprima las instrucciones detalladas de la configuración de la reacción y, a continuación, guárdelas para el Capítulo 3, “Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa.” 1. Haga clic en Print Reaction Setup (Imprimir configuración de reacción). 1 2. En el cuadro de diálogo, seleccione: • Detailed Reaction Setup Instructions (Instrucciones detalladas de la configuración de la reacción) • Include Plate Layout (Incluir disposición de la placa) • Use sample color (Utilizar color de muestra) Notas 40 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Revisión de la configuración de la reacción 3. Haga clic en Print (Imprimir). 2 3 4. En el cuadro de diálogo Print (Imprimir), seleccione la impresora y las opciones de impresión y, a continuación, haga clic en OK (Aceptar). 5. Haga clic en Next (Siguiente) >. Directrices de diseño Cuando diseñe su propio experimento de curva estándar relativa: • Si utiliza reactivos TaqMan, seleccione el tipo de ensayo que va a utilizar: – Seleccione Inventoried/Made to Order (En inventario/Fabricado bajo pedido) si utiliza Applied Biosystems TaqMan® Gene Expression Assays (en inventario o fabricados bajo pedido) o Applied Biosystems Custom TaqMan® Gene Expression Assays. – Seleccione Custom (Personalizado) si va a diseñar sus propios ensayos con el software Primer Express®. • Escriba un número entre 10 y 30 para el volumen de reacción/pocillo. El sistema StepOne admite volúmenes de reacción de entre 10 y 30 µL. • Incluya el volumen de reacción en exceso para contabilizar la pérdida que se produce durante el pipeteo. Applied Biosystems recomienda un volumen de reacción en exceso de al menos el 10%. • Revise las concentraciones de la mezcla de reacción para cada gen diana. Si es necesario: – Para los reactivos TaqMan, modifique las concentraciones de la mezcla maestra y del ensayo. – Para los reactivos SYBR Green, modifique las concentraciones de la mezcla maestra, el cebador directo y el cebador reverso. – Para la RT-PCR de 1 paso, modifique la concentración de retrotranscripción. • Revise los componentes de la mezcla de reacción para cada gen diana: – Si va a trabajar de modo rápido, asegúrese de utilizar una mezcla maestra rápida en las reacciones de PCR. – Si va a realizar reacciones de PCR en modo estándar, asegúrese de utilizar una mezcla maestra tipo estándar en las reacciones de PCR. – En la RT-PCR de 1 paso, asegúrese de incluir retrotranscriptasa en las reacciones de PCR y de utilizar un tampón específico. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 41 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Revisión de la configuración de la reacción • Revise los cálculos de diluciones seriadas para cada gen diana. Si es necesario, modifique la concentración del estándar en la solución de partida (incluidas las unidades). Nota: En el campo de las unidades de Standard Concentration in Stock (Concentración del estándar de la solución de partida), puede seleccionar ng o µg en el menú desplegable o introducir otra unidad en el campo (por ejemplo, copies (copias), IU [unidades internacionales], nmol, pg, etc). La tabla se actualiza de la manera correspondiente. • Revise los cálculos de la dilución de las muestras para cada muestra. Si es necesario, modifique la concentración de muestra diluida (incluidas las unidades) y la concentración de la solución de partida. Para obtener más información Para obtener más información acerca de: • La pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. • Los ensayos de Applied Biosystems se refieren a: – TaqMan® Gene Expression Assays Protocol – Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol Notas 42 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Solicitud de materiales para el experimento Solicitud de materiales para el experimento En la pantalla Materials List (Lista de materiales), revise la lista de materiales que se recomiendan para preparar para la placa de reacción de PCR. Opcionalmente, puede solicitar los materiales recomendados a la tienda en línea de Applied Biosystems. Cree una cesta de la compra, añada productos a la cesta de compra y, a continuación, inicie la sesión para enviar su pedido. Para acceder a la tienda en línea de Applied Biosystems, debe tener una conexión a Internet ilimitada. Nota: El software StepOne recomienda los materiales que debe solicitar de acuerdo con el diseño del experimento. Se da por hecho que se va a diseñar el experimento, solicitar los materiales y luego preparar (Capítulo 3) y procesar (Capítulo 4) la placa de reacción cuando reciba los materiales. Acerca del experimento de ejemplo Pantalla Ordering Materials (Solicitud de materiales) En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, los materiales recomendados son: • • • • • MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate MicroAmp™ Optical 48-Well Adhesive Film TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase® UNG Ensayo de c-myc: Hs00153408_m1 (RefSeq NM_002467.3) Ensayo de GAPDH: Hs99999905_m1 (RefSeq NM_002046.2) 1. Busque el ensayo diana en la tienda en línea de Applied Biosystems: a. Asegúrese de que el ordenador está conectado a Internet. b. Haga clic en el campo Enter Gene Name (Escriba el nombre del gen), escriba c-myc y, a continuación, haga clic en Find Assay (Buscar ensayo). c. En el cuadro de diálogo Find Assay Results (Buscar resultados de ensayo), seleccione la fila Hs00153408_m1. d. Haga clic en el campo Enter Gene Name (Escriba el nombre del gen), escriba GAPDH y, a continuación, haga clic en Find Assay (Buscar ensayo). e. En el cuadro de diálogo Find Assay Results (Buscar resultados de ensayo), seleccione la fila Hs99999905_m1. f. Haga clic en Apply Assay Selection (Aplicar selección de ensayo). 2. Complete el panel Experiment Materials List (Lista de materiales del experimento): a. En el menú desplegable Display (Visualización), seleccione All Items (Todos los elementos) (predeterminada) y, a continuación, revise los materiales recomendados. Si es necesario, utilice la barra de desplazamiento situada a la derecha para ver todos los elementos. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 43 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Solicitud de materiales para el experimento b. Active la casilla de verificación junto a cada uno de los siguientes elementos: • • • • • MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate MicroAmp™ Optical 48-Well Adhesive Film TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase® UNG Ensayo de c-myc: Hs00153408_m1 (RefSeq NM_002467.3) Ensayo de GAPDH: Hs99999905_m1 (RefSeq NM_002046.2) Nota: Para obtener más información acerca de un elemento específico, haga clic en el vínculo del número de referencia para conectarse a la tienda en línea de Applied Biosystems. En la página de inicio, escriba el número de referencia en el campo Search (Búsqueda) y, a continuación, haga clic en Go (Ir). c. Haga clic en Add Selected Items to Shopping List (Añadir elementos seleccionados a la cesta de compra). 3. Compruebe si la cesta de compra del experimento contiene los materiales deseados y que las cantidades son correctas y, a continuación, haga clic en Order Materials in List (Solicitar materiales de la lista). 1b,1d 2a 2c 2b 3 4. En el cuadro de diálogo, Order Materials - Log In (Solicitar materiales – Inicio de sesión), escriba el nombre de usuario y la contraseña de la tienda en línea de Applied Biosystems y, a continuación, haga clic en Login and Submit (Iniciar la sesión y enviar). Nota: Si no tiene cuenta en la tienda en línea de Applied Biosystems, haga clic en Register Now (Registrarse ahora) para crear una cuenta. Notas 44 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Solicitud de materiales para el experimento 4 5. Después de realizar el pedido, haga clic en Finish Designing Experiment (Finalizar el diseño del experimento). Directrices de diseño Cuando diseñe su propio experimento de curva estándar relativa: • Confirme que el ordenador tiene una conexión a Internet ilimitada. • Applied Biosystems recomienda las siguientes versiones de navegadores y Adobe® Acrobat® Reader para utilizar el sitio web de Applied Biosystems: Sistema operativo del escritorio Netscape® Navigator Microsoft® Internet Explorer Adobe® Acrobat® Reader Windows® 98/NT/2000 v6.x o posterior v6.x o posterior v4.0 o posterior Macintosh® OS 9 o posterior v6.x o posterior v5.2 o posterior v4.0 o posterior Nota: Asegúrese de que se han activado las cookies y Java Script para que el sitio web funcione correctamente. • Seleccione todos los materiales que necesite para el experimento y añádalos a la cesta de compra. Para obtener más información Para obtener más información acerca de la pantalla Materials List (Lista de materiales), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 45 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño Para finalizar el flujo de trabajo del asistente de diseño, revise la disposición de la placa y, a continuación, seleccione una opción de salida. Acerca del experimento de ejemplo El software StepOne selecciona automáticamente ubicaciones para los pocillos en la placa de reacción. En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo: • Los pocillos se colocan tal y como se muestra a continuación. • El experimento se guarda tal y como está y se cierra. Nota: Para el experimento de ejemplo, no realice el proceso en este momento. Finalización del asistente de diseño 1. En la ventana Review Plate for Experiment (Revisar placa para el experimento), revise la disposición de la placa. Asegúrese de que hay: • 12 pocillos desconocidos • 30 pocillos estándar • 6 pocillos de control negativo • 0 pocillos vacíos Nota: Si la disposición de la placa es incorrecta, haga clic en Return to the Wizard (Volver al asistente) y compruebe los valores que ha introducido. 2. Haga clic en Save Experiment (Guardar experimento). Notas 46 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño 2 1 3. En el cuadro de diálogo Save Experiment (Guardar experimento), haga clic en Save (Guardar) para aceptar la ubicación y el nombre de archivo predeterminados. El experimento de ejemplo se guarda y se cierra, y regresa a la pantalla de inicio. Nota: De manera predeterminada, el experimento de ejemplo se guarda en la carpeta Applied Biosystems\StepOne System\experiments. 3 Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 47 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño Directrices de diseño Para obtener más información Cuando diseñe su propio experimento de curva estándar relativa: • En la ventana Review Plate for Experiment (Revisar placa para el experimento), seleccione la opción de salida apropiada: – Haga clic en Save Experiment (Guardar experimento) si desea guardar y cerrar el experimento sin realizar ningún otro cambio ni iniciar el proceso. – Haga clic en Start Run for This Experiment (Iniciar proceso para este experimento) si desea guardar el experimento e iniciar el proceso. Asegúrese de que la placa de reacción está cargada en el instrumento. – Haga clic en Edit Plate Layout (Editar disposición de placa) si desea utilizar el flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) para modificar la disposición de la placa. – Haga clic en Create Another Experiment Using the Design Wizard (Crear otro experimento con el asistente de diseño) si desea guardar y cerrar el experimento y, a continuación, crear otro experimento con el asistente de diseño. – Haga clic en Return to the Wizard (Regresar al asistente) si desea regresar al experimento para realizar cambios con el asistente de diseño. • De manera predeterminada, los experimentos se guardan en la carpeta Applied Biosystems\StepOne System\experiments. Para cambiar: – La ubicación en la que se guarda un experimento específico, desplácese a la ubicación deseada con el cuadro de diálogo Save Experiment (Guardar experimento). – La ubicación en la que se guardan los experimentos de manera predeterminada, seleccione Tools (Herramientas)Preferences (Preferencias) y, a continuación, seleccione la ficha General (predeterminada). En el campo Default Data Folder (Carpeta de datos predeterminada), desplácese a la ubicación deseada. Para obtener más información acerca del uso del flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada), consulte “Flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada)” en la página 206. Notas 48 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa Este capítulo cubre los siguientes temas: ■ Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 ■ Preparación del molde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 ■ Preparación de las diluciones de las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 ■ Preparación de la dilución seriada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 ■ Preparación de la mezcla de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58 ■ Preparación de la placa de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 Nota: Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o seleccionando Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne). Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 49 Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa Resumen del capítulo Resumen del capítulo En este capítulo, se explica cómo preparar las reacciones de PCR para el experimentode curva estándar relativa de ejemplo y se ofrecen directrices para preparar las reacciones de PCR para su propio experimento de curva estándar relativa. Flujo de trabajo del experimento de ejemplo A continuación, se muestra el flujo de trabajo para preparar las reacciones de PCR para el experimento de ejemplo que se incluye en esta guía de introducción. Experimento de curva estándar relativa Inicio del experimento Diseño del experimento (Capítulo 2) Preparación de las reacciones (Capítulo 3) 1. Prepare el molde. 2. Prepare las diluciones de las muestras. 3. Prepare la dilución seriada. 4. Prepare la mezcla de reacción para cada ensayo diana. 5. Prepare la placa de reacción. Realización del experimento (Capítulo 4) Análisis del experimento (Capítulo 5) Fin del experimento Notas 50 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa Preparación del molde Preparación del molde Prepare el molde para las reacciones de PCR (muestras y estándares) con el HighCapacity cDNA Reverse Transcription Kit. ¡IMPORTANTE! Applied Biosystems recomienda utilizar High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit para realizar una retrotranscripción del cDNA a partir de RNA total. Los TaqMan® Gene Expression Assays se han diseñado utilizando el High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit; no se han probado otros protocolos para los TaqMan Gene Expression Assays. Acerca del experimento de ejemplo Materiales necesarios Para el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, el molde para las reacciones de PCR es cDNA sintetizado a partir de las muestras de RNA total utilizando el HighCapacity cDNA Reverse Transcription Kit. • Para las muestras, RNA total aislado de hígado y riñón • Para los estándares, RNA total aislado de pulmón Nota: Procure preparar el molde para las muestras y los estándares. • Uno de los Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits: Kit Número de referencia High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (200 reacciones) 4368814 High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (1000 reacciones) 4368813 High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor (200 reacciones) 4374966 High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor (1000 reacciones) 4374967 Nota: El High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit se llamaba antiguamente High-Capacity cDNA Archive Kit. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 51 Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa Preparación del molde Preparación del molde Utilice el High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit para sintetizar cDNA de cadena sencilla a partir de las muestras de RNA total. Siga los procedimientos de Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol para: 1. Preparar la mezcla maestra de la reacción. PELIGRO QUÍMICO. El tampón de reacción 10X puede causar irritación de los ojos, la piel y las vías respiratorias. Consulte la ficha técnica de seguridad (MSDS) y siga las instrucciones de manipulación indicadas. Use protectores oculares, vestimenta protectora y guantes apropiados. 2. Prepare las reacciones de cDNA. 3. Realice la retrotranscripción en un termociclador. Directrices de preparación Para obtener más información Cuando prepare su propio experimento de curva estándar relativa: • Applied Biosystems recomienda extraer primero el DNA o RNA del tejido o muestra. • Applied Biosystems recomienda los siguientes moldes: – cDNA (cDNA) complementario: cDNA sintetizado a partir de las muestras de RNA total utilizando un High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit. – RNA: RNA o mRNA total purificado extraído de un tejido o una muestra. – DNA (gDNA) genómico: gDNA purificado ya extraído de un tejido o una muestra. Para obtener más información acerca de: • La preparación de moldes de cDNA, consulte Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol (PN 4375575). El protocolo no se incluye en los High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits. Puede descargarlo desde el sitio web Applied Biosystems Documents on Demand: http://docs.appliedbiosystems.com/search.taf • La preparación de moldes de RNA o gDNA, consulte el protocolo de los reactivos de purificación que haya seleccionado. Para localizar los reactivos de purificación de Applied Biosystems, visite el sitio web de Applied Biosystems: http://www.appliedbiosystems.com/ Notas 52 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa Preparación de las diluciones de las muestras Preparación de las diluciones de las muestras Realice diluciones de las muestras antes de añadir las muestras a la mezcla de reacción final. Diluya las muestras con los volúmenes que ha calculado el software StepOne™ (“Complete la ficha Sample Dilution Calculations (Cálculos de la dilución de muestra)” en la página 39). Acerca del experimento de ejemplo Para el experimento de curva estándar relativa de ejemplo: • Las diluciones de las muestras son necesarias porque el volumen de las muestras se limita al 10% del volumen total de la reacción en el software StepOne. El volumen total de la reacción es de 20 µL/reacción, por lo que el volumen de las muestras es de 2 µL/reacción. • La concentración de la solución de partida es de 100 ng/µL. Después de diluir la muestra de acuerdo con la tabla Sample Dilutions Calculations (Cálculos de diluciones de las muestras), la muestra tendrá una concentración de 5,0 ng/µL. Esto supone una concentración de 10✕ cuando se añaden 2 µL al volumen de mezcla de reacción final de 20 µL. Hay una concentración de 1✕ en la reacción final. • Los volúmenes calculados en el software son: Concentración de la solución origen (ng/µL) Volumen de muestra (µL) Volumen de disolvente (µL) Volumen total de muestra diluida (µL) Hígado 100,0 1,0 19,0 20,0 Riñón 100,0 1,0 19,0 20,0 Nombre de la muestra Materiales necesarios Preparación de las diluciones de las muestras • • • • • • • Agua para diluir la muestra Tubos de microcentrífuga Pipetas Puntas de pipeta Solución origen de las muestras Agitador Centrífuga 1. Etiquete un tubo de microcentrífuga diferente para cada muestra diluida: • Hígado • Riñón 2. Añada el volumen de agua requerido (disolvente) a cada tubo vacío: Tubo Nombre de la muestra Volumen de disolvente (µL) 1 Hígado 19,0 2 Riñón 19,0 Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 53 Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa Preparación de las diluciones de las muestras 3. Añada el volumen de solución de partida de las muestras requerido (muestra) a cada tubo vacío: Tubo Nombre de la muestra Volumen de muestra (µL) 1 Hígado 1,0 2 Riñón 1,0 4. Agite cada muestra diluida entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifugue brevemente los tubos. 5. Coloque las muestras diluidas en hielo hasta que prepare la placa de reacción. Directrices de preparación Para obtener más información Cuando prepare su propio experimento de curva estándar relativa: • Podría necesitar diluciones de las muestras porque el volumen de las muestras se limita al 10% del volumen total de la reacción en el software StepOne. Debe realizar diluciones de las muestras antes de añadir las muestras a la mezcla de reacción final. • Para conseguir un rendimiento óptimo de los TaqMan® Gene Expression Assays o los Custom TaqMan® Gene Expression Assays, utilice entre 10 y 100 ng de molde de cDNA por 20-µL de reacción. Para reactivos tipo rápido, Applied Biosystems recomienda 10 ng. • Utilice tampón TE o agua para diluir la muestra. Para obtener más información acerca de los ensayos de Applied Biosystems, consulte: • TaqMan® Gene Expression Assays Protocol • Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol Notas 54 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa Preparación de la dilución seriada Preparación de la dilución seriada Prepare la dilución seriada con los volúmenes que ha calculado el software StepOne (“Complete la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción) para el ensayo de c-myc” en la página 35 y “Complete la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción) para el ensayo de GAPDH” en la página 37): Acerca del experimento de ejemplo Para el experimento de curva estándar relativa de ejemplo: • La concentración del estándar en la solución de partida es de 200 ng/µL. • Los volúmenes calculados en el software para los ensayos de c-myc y GAPDH son: Dilución Materiales necesarios Preparación de la dilución seriada para el ensayo de c-myc • • • • • • • Solución origen Volumen de solución origen (µL) Volumen de disolvente (µL) Volumen total (µL) Concentración del estándar (ng/µL) 1 [200] Solución origen 5,0 5,0 10,0 100,0 2 [20] Dilución 1 1,0 9,0 10,0 10,0 3 [2] Dilución 2 1,0 9,0 10,0 1,0 4 [0.2] Dilución 3 1,0 9,0 10,0 0,1 5 [0.02] Dilución 4 1,0 9,0 10,0 0,01 Agua para diluir los estándares Tubos de microcentrífuga Pipetas Puntas de pipeta Solución de partida del estándar Agitador Centrífuga 1. Etiquete un tubo de microcentrífuga diferente para cada estándar: • c-myc Std. 1 • c-myc Std. 2 • c-myc Std. 3 • c-myc Std. 4 • c-myc Std. 5 Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 55 Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa Preparación de la dilución seriada 2. Añada el volumen de agua requerido (disolvente) a cada tubo vacío: Tubo Nombre de estándar Volumen de disolvente que se debe añadir (µL) 1 c-myc Std. 1 5,0 2 c-myc Std. 2 9,0 3 c-myc Std. 3 9,0 4 c-myc Std. 4 9,0 5 c-myc Std. 5 9,0 3. Prepare la dilución 1 en el tubo c-myc Std. 1: a. Agite la solución de partida entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifugue brevemente el tubo. b. Con una punta de pipeta nueva, añada 5,0 µL de solución de partida al tubo c-myc Std. 1. c. Agite el tubo Std. 1 entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifúguelo brevemente. 4. Prepare la dilución 2 en el tubo c-myc Std. 2: a. Con una punta de pipeta nueva, añada 1,0 µL de dilución al tubo c-myc Std. 2. b. Agite el tubo Std. 2 entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifúguelo brevemente. 5. Prepare la dilución 3 en el tubo c-myc Std. 3: a. Con una punta de pipeta nueva, añada 1,0 µL de dilución al tubo c-myc Std. 3. b. Agite el tubo Std. 3 entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifúguelo brevemente. 6. Prepare la dilución 4 en el tubo c-myc Std. 4: a. Con una punta de pipeta nueva, añada 1,0 µL de dilución al tubo c-myc Std. 4. b. Agite el tubo Std. 4 entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifúguelo brevemente. 7. Prepare la dilución 5 en el tubo c-myc Std. 5: a. Con una punta de pipeta nueva, añada 1,0 µL de dilución al tubo c-myc Std. 5. b. Agite el tubo Std. 5 entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifúguelo brevemente. 8. Coloque los estándares en hielo hasta que prepare la placa de reacción. Notas 56 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa Preparación de la dilución seriada Preparación de la dilución seriada para el ensayo de GAPDH 1. Etiquete un tubo de microcentrífuga diferente para cada estándar: • GAPDH Std. 1 • GAPDH Std. 2 • GAPDH Std. 3 • GAPDH Std. 4 • GAPDH Std. 5 2. Añada el volumen de agua requerido (disolvente) a cada tubo vacío: Tubo Nombre de estándar Volumen de disolvente que se debe añadir (µL) 1 GAPDH Std. 1 5,0 2 GAPDH Std. 2 9,0 3 GAPDH Std. 3 9,0 4 GAPDH Std. 4 9,0 5 GAPDH Std. 5 9,0 3. Prepare la dilución 1 en el tubo GAPDH Std. 1: a. Agite la solución de partida entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifugue brevemente el tubo. b. Con una punta de pipeta nueva, añada 5,0 µL de solución de partida al tubo GAPDH Std. 1. c. Agite el tubo Std. 1 entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifúguelo brevemente. 4. Prepare la dilución 2 en el tubo GAPDH Std. 2: a. Con una punta de pipeta nueva, añada 1,0 µL de dilución al tubo GAPDH Std. 2. b. Agite el tubo Std. 2 entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifúguelo brevemente. 5. Prepare la dilución 3 en el tubo GAPDH Std. 3: a. Con una punta de pipeta nueva, añada 1,0 µL de dilución 2 al tubo GAPDH Std. 3. b. Agite el tubo Std. 3 entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifúguelo brevemente. 6. Prepare la dilución 4 en el tubo GAPDH Std. 4: a. Con una punta de pipeta nueva, añada 1,0 µL de dilución 3 al tubo GAPDH Std. 4. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 57 Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa Preparación de la mezcla de reacción b. Agite el tubo Std. 4 entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifúguelo brevemente. 7. Prepare la dilución 5 en el tubo GAPDH Std. 5: a. Con una punta de pipeta nueva, añada 1,0 µL de dilución 4 al tubo GAPDH Std. 5. b. Agite el tubo Std. 5 entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifúguelo brevemente. 8. Coloque los estándares en hielo hasta que prepare la placa de reacción. Directrices de preparación Cuando prepare su propio experimento de curva estándar relativa: • Los estándares son esenciales para realizar un análisis preciso de los datos de la reacción. • Cualquier error o imprecisión a la hora de realizar las diluciones afecta directamente a la calidad de los resultados. • La calidad de pipetas y puntas, y el cuidado que se tenga a la hora de medir y mezclar las diluciones, afecta a la precisión. • Utilice tampón TE o agua para diluir el estándar. Preparación de la mezcla de reacción Prepare la mezcla de reacción con los componentes y volúmenes que ha calculado el software StepOne (“Complete la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción) para el ensayo de c-myc” en la página 35 y “Complete la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción) para el ensayo de GAPDH” en la página 37). Nota: El software calcula todos los componentes de las reacciones de PCR. Sin embargo, para preparar la mezcla de reacción de esta sección, incluya únicamente la mezcla maestra, el ensayo y agua. Añada la muestra o el estándar cuando prepare la placa de la reacción (consulte “Preparación de la placa de reacción” en la página 61). Acerca del experimento de ejemplo Para el experimento de curva estándar relativa de ejemplo: • Los componentes de la mezcla de reacción son: – TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕) – Ensayo de c-myc (20✕) – Ensayo de GAPDH (20✕) – Agua Notas 58 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa Preparación de la mezcla de reacción • Los volúmenes calculados en el software para ambos ensayos diana son: Componente Volumen (µL) para 1 reacción Mezcla maestra (2✕) 10,0 Ensayo (20✕) 1,0 H2O 7,0 Volumen total 18,0 Nota: En este momento, no se añade la muestra ni el estándar. Materiales necesarios Preparación de la mezcla de reacción • • • • • Tubos de microcentrífuga Pipetas Puntas de pipeta Componentes de la mezcla de reacción (enumerados arriba) Centrífuga ¡IMPORTANTE! Prepare la mezcla de reacción para cada ensayo diana por separado. 1. Etiquete un tubo del tamaño apropiado para cada mezcla de reacción: • Mezcla de reacción para c-myc • Mezcla de reacción para GAPDH 2. Para el ensayo de c-myc, añada los volúmenes requeridos de cada componente al tubo de la mezcla de reacción de c-myc: Volumen (µL) para 1 reacción Volumen (µL) para 24 reacciones (más un exceso del 10%) TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕) 10,0 264,0 Ensayo de c-myc (20✕) 1,0 26,4 Agua 7,0 184,8 Volumen total de la mezcla de reacción 18,0 475,2 Componente Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 59 Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa Preparación de la mezcla de reacción 3. Para el ensayo de GAPDH, añada los volúmenes requeridos de cada componente al tubo de la mezcla de reacción de GAPDH: Volumen (µL) para 1 reacción Volumen (µL) para 24 reacciones (más un exceso del 10%) TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕) 10,0 264,0 Ensayo de GAPDH (20✕) 1,0 26,4 Agua 7,0 184,8 Volumen total de la mezcla de reacción 18,0 475,2 Componente 4. Para mezclar la mezcla de reacción de cada tubo, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo y, a continuación, tápelos. 5. Centrifugue brevemente los tubos para quitar las burbujas de aire. 6. Coloque las mezclas de las reacciones en hielo hasta que prepare la placa de reacción. Directrices de preparación Para obtener más información Cuando prepare su propio experimento de curva estándar relativa: • Si el experimento incluye más de un ensayo diana, prepare la mezcla de reacción para cada ensayo diana de manera separada. • Incluya un volumen de exceso en los cálculos para compensar la pérdida que se produce durante las transferencias de reactivos. Applied Biosystems recomienda un volumen de exceso de al menos el 10%. • Incluya todos los componentes requeridos. • Prepare los reactivos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. • Mantenga los ensayos protegidos de la luz, en el refrigerador, hasta que esté listo para usarlos. Una exposición excesiva a la luz puede afectar a las sondas fluorescentes. • Antes de utilizarlo: – Dé vueltas al bote para mezclar bien la mezcla maestra. – Agite el ensayo para resuspenderlo y, a continuación, centrifugue brevemente el tubo. – Para descongelar las muestras congeladas, colóquelas en hielo. Una vez descongeladas, agite las muestras para resuspenderlas y, a continuación, centrifugue los tubos brevemente. Para obtener más información acerca de la preparación de la mezcla de reacción, consulte el protocolo apropiado para los reactivos que está utilizando en las reacciones de PCR: • TaqMan® Gene Expression Assays Protocol • Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol Notas 60 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa Preparación de la placa de reacción Preparación de la placa de reacción Prepare las reacciones para cada grupo de réplicas y, a continuación, transfiéralas a la placa de reacción. Utilice la disposición de la placa que se muestra en el software StepOne. Acerca del experimento de ejemplo Materiales necesarios Para el experimento de curva estándar relativa de ejemplo: • Se utiliza una MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate. • El volumen de la reacción es de 20 µL/pocillo. • La placa de reacción contiene: – 12 pocillos desconocidos – 30 pocillos estándar – 6 pocillos de control negativo – 0 pocillos vacíos • Se utiliza la disposición de la placa que genera automáticamente el software StepOne: • • • • • • • • • • • Tubos de microcentrífuga Pipetas Puntas de pipeta Mezcla de reacción para c-myc (página 59) Mezcla de reacción para GAPDH (página 59) Agua Estándares de c-myc (página 55) Estándares de GAPDH (página 57) Muestras (página 53) MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate MicroAmp™ Optical 48-Well Adhesive Film Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 61 Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa Preparación de la placa de reacción • Centrífuga Preparación de la placa de reacción 1. Para cada gen diana, prepare las reacciones de control negativo: a. A un tubo del tamaño apropiado, añada los volúmenes de la mezcla de reacción y de agua que se indican a continuación. Tubo Mezcla de reacción Volumen de la mezcla de reacción (µL) Volumen de agua (µL) 1 Mezcla de reacción para c-myc 59,4 6,6 2 Mezcla de reacción para GAPDH 59,4 6,6 b. Para mezclar la reacción, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo y, a continuación, tape el tubo. c. Centrifugue brevemente el tubo para quitar las burbujas de aire. d. Añada 20 µL de la reacción de control negativo a los pocillos apropiados de la placa de reacción. 2. Por cada grupo de réplicas, prepare las reacciones estándar: a. A tubos del tamaño adecuado, añada los volúmenes de la mezcla de reacción y de estándar que se indican a continuación. Volumen de la mezcla de reacción (µL) Estándar Volumen de estándar (µL) Mezcla de reacción para c-myc 59,4 c-myc Std 1 6,6 c-myc Std 2 Mezcla de reacción para c-myc 59,4 c-myc Std 2 6,6 3 c-myc Std 3 Mezcla de reacción para c-myc 59,4 c-myc Std 3 6,6 4 c-myc Std 4 Mezcla de reacción para c-myc 59,4 c-myc Std 4 6,6 5 c-myc Std 5 Mezcla de reacción para c-myc 59,4 c-myc Std 5 6,6 Tubo Reacción estándar Mezcla de reacción 1 c-myc Std 1 2 Notas 62 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa Preparación de la placa de reacción Tubo Reacción estándar Mezcla de reacción Volumen de la mezcla de reacción (µL) Estándar Volumen de estándar (µL) 6 GAPDH Std 1 Mezcla de reacción para GAPDH 59,4 GAPDH Std 1 6,6 7 GAPDH Std 2 Mezcla de reacción para GAPDH 59,4 GAPDH Std 2 6,6 8 GAPDH Std 3 Mezcla de reacción para GAPDH 59,4 GAPDH Std 3 6,6 9 GAPDH Std 4 Mezcla de reacción para GAPDH 59,4 GAPDH Std 4 6,6 10 GAPDH Std 5 Mezcla de reacción para GAPDH 59,4 GAPDH Std 5 6,6 b. Para mezclar las reacciones, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo y, a continuación, tape los tubos. c. Centrifugue brevemente los tubos para quitar las burbujas de aire. d. Añada 20 µL de la reacción estándar a los pocillos apropiados de la placa de reacción. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 63 Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa Preparación de la placa de reacción 3. Por cada grupo de réplicas, prepare las reacciones para los elementos desconocidos o muestras: a. A tubos del tamaño adecuado, añada los volúmenes de la mezcla de reacción y de las muestras que se indican a continuación. Volumen de la mezcla de reacción (µL) Volumen de muestra (µL) Reacción desconocida Mezcla de reacción 1 c-myc en hígado Mezcla de reacción para c-myc 59,4 Hígado 6,6 2 c-myc en riñón Mezcla de reacción para c-myc 59,4 Riñón 6,6 3 GAPDH en hígado Mezcla de reacción para GAPDH 59,4 Hígado 6,6 4 GAPDH en riñón Mezcla de reacción para GAPDH 59,4 Riñón 6,6 Tubo Muestra b. Para mezclar las reacciones, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo y, a continuación, tape los tubos. c. Centrifugue brevemente los tubos para quitar las burbujas de aire. d. Añada 20 µL de la mezcla de reacción desconocida (muestra) a los pocillos apropiados de la placa de reacción. 4. Selle la placa de reacción con película adhesiva óptica. 5. Centrifugue brevemente la placa de reacción para quitar las burbujas de aire. 6. Hasta que esté preparado para realizar la reacción, coloque la placa de reacción en hielo en un sitio oscuro. Directrices de preparación Cuando prepare su propio experimento de curva estándar relativa: • Procure utilizar los consumibles adecuados. • Asegúrese de que la colocación de las reacciones de PCR se corresponde con la disposición de la placa que se muestra en el software StepOne. Puede: – Aceptar la disposición de la placa que genera automáticamente el software. o – Utilizar el flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) para cambiar la disposición de la placa en el software. Notas 64 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa Preparación de la placa de reacción Para obtener más información Para obtener más información acerca de: • La preparación de la placa de reacción, consulte el protocolo apropiado para los reactivos que está utilizando en las reacciones de PCR: – TaqMan® Gene Expression Assays Protocol – Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol • Los consumibles, consulte “Consumibles admitidos” en la página 3. • El uso del flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) para cambiar la disposición de la placa, consulte “Flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada)” en la página 206. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 65 Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa Preparación de la placa de reacción Notas 66 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa Este capítulo cubre los siguientes temas: ■ Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68 ■ Preparación de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 ■ (Opcional) Activación de las notificaciones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 ■ Inicio de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 ■ Monitorización de la reacción. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 ■ Descarga de la placa de reacción y transferencia de datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87 Nota: Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o seleccionando Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne). Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 67 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa Resumen del capítulo Resumen del capítulo En este capítulo, se explica cómo realizar una reacción en Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System. Flujo de trabajo del experimento de ejemplo A continuación, se muestra el flujo de trabajo para realizar el experimento de ejemplo que se incluye en esta guía de introducción. Inicio del experimento Diseño del experimento (Capítulo 2) Preparación del experimento (Capítulo 3) Realización del experimento (Capítulo 4) 1. Prepare el proceso. 2. Active las opciones de notificación. 3. Inicie el proceso. 4. Monitorice el proceso. 5. Descargue el instrumento y transfiera los datos. Análisis del experimento (Capítulo 5) Fin del experimento Notas 68 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa Preparación de la reacción Preparación de la reacción Para preparar la reacción, abra el experimento y cargue la MicroAmp™ Fast Optical 48Well Reaction Plate en el instrumento StepOne™. Apertura del experimento de ejemplo 1. Si aún no se está ejecutando el software StepOne™, haga doble clic en (acceso directo al software StepOne) o seleccione Start (Inicio)All Programs (Todos los programas)Applied Biosystems StepOneStepOne v2.0. 2. En la pantalla Home (Inicio), haga clic en Open (Abrir). 3. En el cuadro de diálogo Open (Abrir), desplácese hasta la carpeta experiments (experimentos) (predeterminada). 4. Haga doble clic en Relative Standard Curve Example (Ejemplo de curva estándar relativa) para abrir el archivo del experimento de ejemplo que ha creado en el Capítulo 2. 2 3 4 Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 69 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa Preparación de la reacción Carga de la placa de reacción PELIGRO DE LESIONES FÍSICAS. Durante el uso del instrumento, la temperatura del bloque puede superar los 100 °C. Si el instrumento se ha utilizado recientemente, mantenga las manos alejadas de él hasta que el bloque alcance la temperatura ambiente. ¡IMPORTANTE! Lleve guantes sin polvo para manejar la placa de reacción. 1. Abra la bandeja del instrumento. 2. Coloque las reacciones en el bloque. La colocación de las reacciones depende del tipo de consumible que se utilice: • Si utiliza una placa de reacción, colóquela con el pocillo A1 en la esquina posterior izquierda. • Si utiliza tiras de tubos de reacción, colóquelas en el bloque directamente. A1 3. Cierre cuidadosamente la bandeja del instrumento. Notas 70 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa (Opcional) Activación de las notificaciones (Opcional) Activación de las notificaciones Active las opciones de notificación para que el software StepOne le avise por correo electrónico del momento en que el instrumento StepOne comienza y completa el proceso, o si se produce algún error en el proceso. La activación de la función de notificación es opcional y no afecta al rendimiento del sistema StepOne™ ni a la duración de la reacción. ¡IMPORTANTE! La función de notificación sólo está disponible si el ordenador donde desea recibir la notificación está controlando el instrumento StepOne y está conectado a una red Ethernet. Nota: El sistema de notificación también está disponible en los ordenadores que monitorizan un instrumento StepOne de manera remota. Para obtener más información acerca de la monitorización remota, consulte “Monitorización remota” en la página 83. Acerca del experimento de ejemplo Configuración de las opciones de notificación En el experimento de ejemplo, el software StepOne está configurado para enviar notificaciones a tres usuarios (científico, supervisor y técnico de mycompany.com) cuando el sistema StepOne termina el proceso y si encuentra algún error durante la operación. El servidor SMTP de ejemplo (www.mycompany.com) está configurado para el cifrado SSL (Secure Sockets Layer) y, para utilizarlo, se requiere autenticación. 1. En el software StepOne, haga clic en navegación. 2. Haga clic en Run (Proceso) en la columna de Notification Settings (Opciones de notificación). 3. Seleccione Enable Notifications (Activar notificaciones). 4. Seleccione los eventos que desencadenarán las notificaciones: a. Seleccione Instrument Error (Error del instrumento). b. Seleccione Run Completed (Proceso completado). 5. En el campo Enter e-mail addresses for notifications (Escriba las direcciones de correo electrónico para las notificaciones), escriba: [email protected], [email protected], [email protected]. 6. En el campo Outgoing Mail Server (SMTP) (Servidor de correo saliente (SMTP)), escriba smtp.mycompany.com. 7. Ajuste las opciones de autenticación: a. Seleccione No en Server requires authentication (El servidor requiere autenticación). b. En el campo User Name (Nombre de usuario), escriba supervisor. c. En el campo Password (Contraseña), escriba password. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 71 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa (Opcional) Activación de las notificaciones 3 4 5 6 7a 7b 7c Directrices de proceso Si configura el sistema StepOne para la notificación automática: • El sistema StepOne debe estar configurado para su uso en red. Consulte la Guía de instalación de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System. • Determine los eventos de los que quiere recibir una notificación: – Instrument Error (Error del instrumento): el sistema StepOne envía por correo electrónico a los destinatarios todos los errores que se producen en el instrumento StepOne durante cada proceso. – Run Started (Proceso iniciado): el proceso StepOne envía un correo electrónico a los destinatarios cada vez que el instrumento inicia una reacción. – Run Completed (Proceso completado): el proceso StepOne envía un correo electrónico a los destinatarios cada vez que el instrumento completa una reacción. • Obtenga las direcciones de correo electrónico en las que desea recibir notificaciones. ¡IMPORTANTE! Separe las direcciones con una coma ( , ). • Póngase en contacto con el administrador del sistema o con el departamento de tecnología de la información para obtener: – La dirección de red del servidor de protocolo de transferencia de correo simple (SMTP) en la LAN – Un nombre de usuario y contraseña para el servidor, si son necesarios para el acceso – La configuración de SSL (Secure Sockets Layer) del servidor (activada o desactivada) Notas 72 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa Inicio de la reacción Inicio de la reacción Inicie el proceso de acuerdo con la disposición del instrumento StepOne. La forma en la que hay que iniciar el proceso depende de la disposición del sistema StepOne: Disposición Inicio conectado Descripción Consulte… Conectada El cable amarillo del sistema StepOne conecta el ordenador al instrumento StepOne. Autónoma • El ordenador y el instrumento StepOne no están conectados, o • El ordenador y el instrumento StepOne están conectados a la misma red. “Inicio conectado” más abajo “Inicio autónomo” en la página 74 Realice este procedimiento si el ordenador está conectado directamente al instrumento StepOne por medio del cable del sistema StepOne. 1. En el software StepOne, haga clic en temperatura). Temperature Plot (Gráfica de 2. Haga clic en START RUN (Iniciar proceso) . 2 1 Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 73 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa Inicio de la reacción Inicio autónomo Realice este procedimiento si el ordenador y el instrumento StepOne no están directamente conectados por medio del cable amarillo del sistema StepOne. 1. Si el ordenador y el instrumento StepOne están conectados a la misma red, realice los pasos 1a a 1f. De lo contrario, vaya al paso 2. a. En el software StepOne, haga clic en Send Experiment to Instrument (Enviar experimento al instrumento). b. En el cuadro de diálogo Send Experiment to Instrument (Enviar experimento al instrumento), haga clic en Browse (Examinar), seleccione el archivo Relative Standard Curve Example.eds y, a continuación, haga clic en Open (Abrir). c. Seleccione el instrumento StepOne en el menú desplegable Select Instrument (Seleccionar instrumento). Si no aparece su instrumento StepOne, configúrelo para la monitorización, tal y como se explica en la Guía de instalación de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System. d. Haga clic en Send Experiment (Enviar experimento) para enviar el experimento al instrumento StepOne a través de la red. 1b 1c experiments\Relative Standard Curve Example.eds 1d e. Cuando se le solicite, haga clic en OK (Aceptar) para cerrar el mensaje de confirmación. f. Vaya al paso 6. 2. Si el instrumento StepOne no está conectado al ordenador, realice los pasos 2a a 2d para transferir el experimento utilizando una unidad USB. a. Conecte la unidad USB a uno de los puertos USB del ordenador. b. En el software StepOne, seleccione Save (Guardar)Save As (Guardar como). c. En el cuadro de diálogo Save (Guardar), desplácese a la unidad USB y, a continuación, haga clic en Save (Guardar). d. Extraiga la unidad USB del ordenador y, a continuación, conéctela al puerto USB del instrumento StepOne. Notas 74 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa Inicio de la reacción o 3. Toque la pantalla táctil del instrumento StepOne y, a continuación, toque . 4. En la pantalla del menú principal, toque Browse Experiments (Buscar experimentos). 5. En la pantalla Browse Methods (Métodos de búsqueda), toque (Carpetas). (Folders) 6. En la pantalla Choose an Experiment Category (Elija una categoría de experimento): • Toque USB si ha transferido el experimento a una unidad USB. • Toque Default (Predeterminado) si ha enviado el experimento a través de una conexión de red. 7. En la pantalla Browse USB/Default Experiments (Buscar USB/experimentos predeterminados): a. Toque Relative Standard Curve Example (Ejemplo de curva estándar relativa) para seleccionar el experimento. b. Toque Start Run (Iniciar proceso). 5 7a Ejemplo de curva estándar 7b 8. En la pantalla Run Parameters (Parámetros de proceso): a. Toque el campo Reaction Volume (Volumen de reacción), utilice el teclado para escribir 20 µL y, a continuación, toque Done (Finalizado). Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 75 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa Monitorización de la reacción b. Toque Start Run (Iniciar proceso). 8a 20 8b Monitorización de la reacción Monitorice el progreso desde un ordenador que ejecute el software StepOne o desde la pantalla táctil del instrumento StepOne. La forma en la que monitorice el proceso depende de la disposición del sistema StepOne: Disposición Descripción Conectada El cable del sistema StepOne conecta el ordenador al instrumento StepOne. Autónoma (en red) El ordenador y el instrumento StepOne están conectados a la misma red. Autónoma (básica) El ordenador y el instrumento StepOne no están conectados. Consulte… “Monitorización conectada” más abajo “Monitorización remota” en la página 83 “Monitorización autónoma” en la página 86 Notas 76 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa Monitorización de la reacción Monitorización conectada Si el ordenador está directamente conectado al instrumento StepOne por medio del cable del sistema StepOne, puede ver el progreso de la reacción a tiempo real de la forma que se describe a continuación. Durante el proceso, observe periódicamente las tres gráficas disponibles en el software StepOne para detectar posibles problemas. # A Para... Detener el proceso Acción 1. En el software StepOne, haga clic en STOP RUN (Detener proceso). 2. En el cuadro de diálogo Stop Run (Detener proceso), haga clic en una de las siguientes opciones: – Stop Immediately (Detener inmediatamente) para detener el proceso inmediatamente. – Stop after Current Cycle/Hold (Detener después de ciclo actual/espera) para detener el proceso después del ciclo o la espera actual. – Cancel (Cancelar) para continuar el proceso. B C D E Ver los datos de amplificación a tiempo real Seleccione Amplification Plot (Gráfica de amplificación). Ver los datos de la temperatura de la reacción a tiempo real Seleccione Ver el progreso de la reacción en la pantalla Run Method (Protocolo de termociclado) Seleccione Activar/desactivar las opciones de notificación Active o desactive la opción Enable Notifications (Activar notificaciones). Consulte “Acerca de la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación)” en la página 78. Temperature Plot (Gráfica de temperatura). Consulte “Acerca de la pantalla Temperature Plot (Gráfica de temperatura)” en la página 80. Run Method (Protocolo de termociclado). Consulte “Acerca de la pantalla Run Method (Protocolo de termociclado)” en la página 81. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 77 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa Monitorización de la reacción A E B C D Acerca de la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) La pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) permite ver la amplificación de las muestras a medida que el instrumento StepOne recoge datos de fluorescencia durante una reacción. Si se configura un protocolo de recogida de datos a tiempo real, en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) aparecen los datos de los pocillos seleccionados en la ficha View Plate Layout (Ver disposición de placa). La gráfica representa la fluorescencia de los distintos fluorocromos normalizados (∆Rn) y el número de ciclos. La siguiente figura muestra la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) durante el experimento de ejemplo. Notas 78 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa Monitorización de la reacción La pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) es útil para identificar y examinar amplificaciones anormales. Una amplificación anormal puede incluir lo siguiente: • Aumento de la fluorescencia en los pocillos de control negativo. • Ausencia de fluorescencia detectable en el ciclo esperable (determinada a partir de experimentos similares anteriores utilizando los mismos reactivos en las mismas condiciones). Si se observa una amplificación anormal o una completa ausencia de señal, solucione el error de la forma que se explica en la ayuda del software StepOne (haga clic en en la barra de herramientas o seleccione Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne)). Nota: Para ver los datos de la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación), seleccione los pocillos que desea ver en la ficha View Plate Layout (Ver disposición de placa). Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 79 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa Monitorización de la reacción Acerca de la pantalla Temperature Plot (Gráfica de temperatura) Durante una reacción, la pantalla Temperature Plot (Gráfica de temperatura) muestra las temperaturas del bloque, la cubierta caliente y las muestras (calculadas) a tiempo real. La siguiente figura muestra la pantalla Temperature Plot (Gráfica de temperatura) durante el experimento de ejemplo. Para... Acción A Añadir/quitar gráficas de temperatura Seleccione Sample (Muestra), Heated Cover (Cubierta caliente) o Sample Block (bloque) para cambiar la presencia de los datos asociados en la gráfica. B Cambiar el tiempo que se muestra por gráfica Seleccione View (Ver)(duración). C Restringir el eje Y de la gráfica Seleccione Fixed View (Vista fija). A B C La pantalla Temperature Plot (Gráfica de temperatura) puede ser útil para identificar averías del hardware. Al monitorizar la pantalla Temperature Plot (Gráfica de temperatura), observe las gráficas Sample (Muestra), Heated Cover (Cubierta caliente) y Sample Block (Bloque) para detectar algún comportamiento anormal. • En general, las gráficas Sample (Muestra) y Block (Bloque) deberían ser más o menos un espejo la una de la otra. Una desviación significativa de las gráficas puede indicar un problema. • La gráfica Heated Cover (Cubierta caliente) debería mantener la temperatura constante que se especifica en el protocolo de termociclado. Cualquier desviación de la temperatura puede indicar un problema. Notas 80 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa Monitorización de la reacción Si observa una gráfica de temperatura anormal, solucione el error de la forma que se explica en la ayuda del software StepOne (haga clic en en la barra de herramientas o seleccione Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne)). Nota: La temperatura de las muestras que se indica en el grupo Current Temperatures (Temperaturas actuales) es un valor estimado. Acerca de la pantalla Run Method (Protocolo de termociclado) Después de comenzar el proceso, el sistema StepOne muestra su progreso en la pantalla Run Method (Protocolo de termociclado). La vista informa del progreso de la reacción en referencia con el perfil térmico de la misma. La siguiente figura muestra la pantalla Run Method (Protocolo de termociclado) durante el experimento de ejemplo. Para... A Cambiar el protocolo de termociclado (añadir ciclos, una espera o una curva de disociación) Acción 1. En el panel de navegación, haga clic en (Protocolo de termociclado). Run Method 2. En la pantalla Run Method (Protocolo de termociclado), haga cualquiera de las siguientes acciones: – Escriba el número de ciclos que se van a aplicar a la fase cíclica. – Seleccione Add Melt Curve Stage to End (Añadir curva de disociación al final) si desea añadir una curva de disociación al final de la reacción. – Seleccione Add Holding Stage to End (Añadir fase de espera al final) si desea añadir una fase de espera al final de la reacción. 3. Haga clic en Send to Instrument (Enviar al instrumento). Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 81 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa Monitorización de la reacción A Nota: Si aparece una alerta, haga clic en el error para obtener más información y solucionar el problema tal y como se explica en la ayuda del software StepOne (haga clic en en la barra de herramientas o seleccione Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne)). Notas 82 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa Monitorización de la reacción Monitorización remota Si el instrumento StepOne está conectado a una red, puede utilizar la función de monitorización remota del software StepOne para ver el progreso de la reacción a tiempo real desde cualquier ordenador de la red. ¡IMPORTANTE! Los ordenadores en red no pueden controlar el instrumento StepOne, sólo monitorizarlo. # Para... A Ver los datos de amplificación a tiempo real Haga clic en Amplification Plot (Gráfica de amplificación). Ver los datos de la temperatura de la reacción a tiempo real Haga clic en Temperature Plot (Gráfica de temperatura). B C D Acción Consulte “Acerca de la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación)” en la página 78. Consulte “Acerca de la pantalla Temperature Plot (Gráfica de temperatura)” en la página 80. Ver el progreso de la reacción en la pantalla Run Method (Protocolo de termociclado) Haga clic en Run Method (Protocolo de termociclado). Activar/desactivar las opciones de notificación Active o desactive la opción Enable Notifications (Activar notificaciones). Consulte “Acerca de la pantalla Run Method (Protocolo de termociclado)” en la página 81. Consulte “(Opcional) Activación de las notificaciones” en la página 71. D A B C Para monitorizar el instrumento StepOne de manera remota: 1. En el software StepOne, seleccione Instrument (Instrumento)Remote Monitor (Supervisor remoto). 2. En la barra de navegación, seleccione el instrumento StepOne. Si en la barra de navegación no aparece el instrumento StepOne: Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 83 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa Monitorización de la reacción a. Haga clic en Add Instrument (Añadir instrumento). b. Haga clic en el campo Instrument Name (Nombre de instrumento) y, a continuación, escriba el nombre del instrumento. c. Haga clic en el campo Host Name (Nombre de host) y, a continuación, introduzca la dirección IP del instrumento. d. Haga clic en Save & Exit (Guardar y salir). 2b 2c 2d Nota: Para obtener más información acerca de la configuración del instrumento StepOne para el uso en red o la monitorización remota, consulte la Guía de instalación de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System. 3. Haga clic en (Start monitoring this instrument) (Comenzar a monitorizar este instrumento) de su instrumento. Notas 84 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa Monitorización de la reacción 1 2 3 Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 85 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa Monitorización de la reacción Monitorización autónoma Si ha comenzado la reacción desde el instrumento StepOne, puede ver el progreso de la misma desde la pantalla táctil. La pantalla Run Method (Protocolo de termociclado) muestra el método del experimento y resalta los pasos del perfil térmico a medida que el instrumento va realizándolos. # Para... Acción A Añadir una curva de disociación a la reacción Toque (Add Dissociation Curve) (Añadir curva de disociación) y, a continuación, toque OK (Aceptar). B Ver el tiempo que queda en el proceso Toque Display Method Time (Ver tiempo de método) y, a continuación, toque para regresar a la pantalla Run Method (Protocolo de termociclado). C Detener el proceso Toque Stop (Detener) y, a continuación, toque: • Stop (Detener) para detener el proceso después de que el instrumento StepOne complete el ciclo o la espera actual. • Abort (Abortar) para detener el proceso inmediatamente. • para continuar el proceso sin ningún cambio. D Ver información del experimento Toque View Method Information (Ver información del método) y, a continuación, toque para regresar a la pantalla Run Method (Protocolo de termociclado). E Ver el registro de errores Toque la barra de estado para ver el registro de errores. D B A C E Notas 86 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa Descarga de la placa de reacción y transferencia de datos Descarga de la placa de reacción y transferencia de datos Cuando el instrumento StepOne muestre la pantalla Run History (Historial de la reacción), descargue la placa de reacción del instrumento StepOne y transfiera los datos del experimento al ordenador para analizarlos. Descarga de la placa de reacción PELIGRO DE LESIONES FÍSICAS. Durante el uso del instrumento, la temperatura del bloque puede superar los 100 °C. Mantenga las manos alejadas hasta que la bandeja de las muestras alcance la temperatura ambiente. Nota: Cuando el instrumento StepOne complete una reacción, el sistema guardará los detalles en el historial de reacciones, que permanece en el sistema hasta que el sistema completa otro proceso. 1. Cuando aparezca la pantalla Run Report (Informe de proceso) en la pantalla táctil del instrumento StepOne, toque . 2. Abra la bandeja del instrumento. 3. Saque la placa de reacción del bloque. 4. Cierre con cuidado la bandeja del instrumento. ¡IMPORTANTE! No apague el instrumento StepOne después de una reacción. El instrumento activa automáticamente un modo de hibernación cuando no se está utilizando. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 87 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa Descarga de la placa de reacción y transferencia de datos Selección de un método de transferencia de datos Transfiera el experimento al ordenador para analizarlo, de acuerdo con la disposición del sistema StepOne: Disposición Descripción Consulte… Conectada El cable del sistema StepOne conecta el ordenador al instrumento StepOne. “Transferencia de datos conectada” más abajo Autónoma (en red) El ordenador y el instrumento StepOne están conectados a la misma red. “Transferencia de datos remota” en la página 88 Autónoma (básica) El ordenador y el instrumento StepOne no están conectados. “Transferencia de datos autónoma” en la página 89 Transferencia de datos conectada Si el ordenador está conectado directamente al instrumento StepOne por medio del cable del sistema StepOne, no hay que hacer nada. El software StepOne transfiere automáticamente los datos del experimento al instrumento StepOne después de la reacción. Transferencia de datos remota Si el ordenador y el instrumento StepOne están conectados a la misma red Ethernet, envíe el experimento al instrumento StepOne a través de la red: 1. En el software StepOne, haga clic en Download Experiment from Instrument (Descargar experimento del instrumento). 2. En el cuadro de diálogo Download Experiment from Instrument (Descargar experimento del instrumento), seleccione Select Instrument (Seleccionar instrumento)<su instrumento>. 3. Seleccione Experiment (Experimento)Relative Standard Curve Example (Ejemplo de curva estándar relativa). 4. En el campo Download File (Descargar archivo), haga clic en Browse (Examinar), seleccione una carpeta en la que recibir los datos del experimento y, a continuación, haga clic en Select (Seleccionar). 5. Haga clic en Download Experiment (Descargar experimento) para descargar el experimento desde el instrumento StepOne al ordenador a través de la red. 2 4 3 5 6. Cuando se le solicite, haga clic en OK (Aceptar) para cerrar el mensaje de confirmación. Notas 88 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa Descarga de la placa de reacción y transferencia de datos 6 Transferencia de datos autónoma Si el ordenador no está conectado al instrumento StepOne, utilice la unidad USB para transferir el experimento al instrumento: 1. Si aún no está conectada al instrumento, conecte una unidad USB al puerto USB. o 2. Toque la pantalla táctil del instrumento StepOne para activarla y, a continuación, toque . 3. En el menú principal, toque Collect Results (Recoger resultados) para guardar los datos en la unidad USB. Si el instrumento StepOne no encuentra la unidad USB, toque OK (Aceptar), espere 30 segundos y, a continuación, vuelva a tocar Collect Results (Recoger resultados). 4. Cuando aparezca un mensaje que le informa de que los datos se han transferido correctamente, toque OK (Aceptar). 5. Extraiga la unidad USB del instrumento StepOne y, a continuación, conéctela al puerto USB del ordenador. 6. En el escritorio del ordenador, utilice el explorador de Windows para abrir la unidad USB. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 89 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa Descarga de la placa de reacción y transferencia de datos 7. Copie el archivo Relative Standard Curve Example.eds en: <unidad>:\Applied Biosystems\StepOne System\experiments donde <unidad> es la unidad del disco duro del ordenador en la que está instalado el software de StepOne. La unidad de instalación predeterminada del software es la unidad C. Notas 90 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Este capítulo cubre los siguientes temas: ■ Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92 ■ Sección 5.1 Revisión de los resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 ■ Sección 5.2 Solución de problemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 Nota: Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o seleccionando Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne). Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 91 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Resumen del capítulo Resumen del capítulo El software StepOne™ analiza los datos mediante el método de cuantificación de curva estándar relativa. En la primera sección de este capítulo, se explica cómo revisar los datos analizados utilizando las pantallas de análisis y cómo presentar los datos. Si los resultados son cuestionables, en la Sección 2 de este capítulo se explican algunos pasos para solucionar los problemas. Nota: El experimento de curva estándar relativa de ejemplo incluye cuatro pocillos problemáticos que aparecen marcados con un aviso. Los avisos reflejan problemas comunes que se puede encontrar al realizar sus propios experimentos. Se incluyen procedimientos para ver los avisos y omitir uno de los pocillos. Flujo de trabajo del experimento de ejemplo A continuación, se muestra el flujo de trabajo para analizar el experimento de ejemplo que se incluye en esta guía de introducción. Experimento de curva estándar relativa Inicio del experimento Diseño del experimento (Capítulo 2) Preparación de las reacciones (Capítulo 3) Realización del experimento (Capítulo 4) Análisis del experimento (Capítulo 5) Sección 1. Revisión de los resultados: 1. Analice. 2. Revise la pantalla Standard Curve (Curva estándar). 3. Revise la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación). 4. Revise la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica) o la tabla de pocillos. 5. Presente los datos. Sección 2. Solución de problemas: 1. Revise las opciones de análisis; ajuste la línea basal y el umbral. 2. Revise la pantalla QC Summary (Resumen QC). 3. Omita pocillos. 4. Revise la pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente). 5. Revise la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos). Fin del experimento Notas 92 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Sección 5.1 Revisión de los resultados Sección 5.1 Revisión de los resultados Esta sección cubre los siguientes temas: ■ Análisis del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94 ■ Visualización de la curva estándar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 ■ Revisión de la gráfica de amplificación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 ■ Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos . . . . . . . . . . . . 108 ■ Presentación de los datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111 Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 93 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Análisis del experimento Análisis del experimento El software StepOne analiza el experimento y muestra los resultados en las pantallas de análisis (por ejemplo, en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación), QC Summary (Resumen QC), etc.) Acerca del experimento de ejemplo Para el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, utilice el archivo de datos que se instala con el software StepOne. Este archivo de datos se ha creado con los mismos parámetros de diseño que se indican en el Capítulo 2 y luego se ha procesado y analizado en un instrumento StepOne™. Encontrará el archivo de datos del experimento de ejemplo en su ordenador: <unidad>:\Applied Biosystems\StepOne System\experiments\examples donde <unidad> es la unidad del disco duro del ordenador en la que está instalado el software StepOne. La unidad de instalación predeterminada del software es la unidad C. Análisis del experimento de ejemplo 1. Si aún no se está ejecutando el software StepOne, haga doble clic en (acceso directo al software StepOne) o seleccione Start (Inicio)All Programs (Todos los programas)Applied BiosystemsStepOneStepOne v2.0. 2. En la pantalla Home (Inicio), haga clic en Open (Abrir). 3. En el cuadro de diálogo Open (Abrir), desplácese hasta la carpeta examples (ejemplos). 4. Haga doble clic en Relative Standard Curve Example (Ejemplo de curva estándar relativa) para abrir el archivo de datos del experimento de ejemplo. Notas 94 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Análisis del experimento 2 3 4 5. Haga clic en Analyze (Analizar). El software analiza los datos utilizando las opciones de análisis predeterminadas. 5 6. Consulte “Elementos del software” más adelante y “Consejos de desplazamiento” en la página 98 para obtener información acerca de cómo desplazarse por las pantallas de análisis. Directrices Cuando analice su propio experimento de curva estándar relativa: • Inmediatamente después de una reacción, el software StepOne analiza automáticamente los datos utilizando las opciones de análisis predeterminadas y, a continuación, muestra la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) en el ordenador. • Para volver a analizar los datos, seleccione todos los pocillos de la disposición de la placa y, a continuación, haga clic en Analyze (Analizar). Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 95 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Análisis del experimento Elementos del software A continuación, se ilustran los elementos del software StepOne de las pantallas de análisis. 1. Barra de menús: muestra los menús disponibles en el software: • File (Archivo) • Edit (Edición) • Instrument (Instrumento) • Analysis (Análisis) • Tools (Herramientas) • Help (Ayuda) 2. Barra de herramientas: muestra las herramientas disponibles en el software: • New Experiment (Experimento nuevo) • Open (Abrir) • Save (Guardar) • Close (Cerrar) • Send Experiment to Instrument (Enviar experimento al instrumento) • Download Experiment from Instrument (Descargar experimento del instrumento) • Export (Exportar) • Print Report (Imprimir informe) 3. Cabecera del experimento: indica el nombre del experimento, el tipo de experimento y los reactivos del experimento abierto. 4. Panel de menús del experimento: incluye vínculos a las siguientes pantallas del software: • Pantallas de configuración • Pantallas del perfil de reacción • Pantallas de análisis: –Amplification Plot (Gráfica de amplificación) –Standard Curve (Curva estándar) –Gene Expression (Expresión génica) –Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente) –Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos) –QC Summary (Resumen QC) –Multiple Plots View (Vista de múltiples gráficas) 5. Panel de gráficas: muestra la pantalla de análisis seleccionada para el experimento abierto. 6. Fichas de visualización: muestra la disposición de la placa o la tabla de pocillos del experimento abierto. Notas 96 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Análisis del experimento 7. Fichas del experimento: muestra una ficha por cada experimento abierto. 1 2 3 6 4 7 5 Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 97 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Análisis del experimento Consejos de desplazamiento Cómo seleccionar pocillos Para ver pocillos específicos en las pantallas de análisis, seleccione los pocillos en la ficha View Plate Layout (Ver disposición de placa) de la siguiente manera: 1. Para seleccionar pocillos de un tipo específico, utilice los menús desplegables Select Wells With (Seleccionar pocillos con): seleccione Sample (Muestra), Target (Diana) o Task (Tarea) y, a continuación, seleccione el nombre de la muestra, el gen diana o la tarea. 2. Para seleccionar un solo pocillo, haga clic en él en la disposición de la placa. 3. Para seleccionar varios pocillos, haga clic y arrastre el ratón por encima de los pocillos deseados, pulse CTRL+clic, o pulse Mayús+clic en la disposición de la placa. 4. Para seleccionar los 48 pocillos, haga clic en la esquina superior izquierda de la disposición de la placa. 1 4 Notas 98 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Análisis del experimento Cómo ver múltiples gráficas Utilice la vista Multiple Plots (Múltiples gráficas) para ver simultáneamente hasta cuatro gráficas. Para desplazarse por la vista Multiple Plots (Múltiples gráficas): 1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis (Análisis) Multiple Plots View (Vista de múltiples gráficas). 2. Para ver cuatro gráficas, haga clic en gráficas en una matriz de 2 X 2). 3. Para ver dos gráficas en filas, haga clic en en dos filas). Show plots in a 2 ✕ 2 matrix (Mostrar Show plots in two rows (Ver gráficas 4. Para ver dos gráficas en columnas, haga clic en (Ver gráficas en dos columnas). Show plots in two columns 5. Para ver una gráfica específica, seleccione la gráfica en el menú desplegable situado encima de la visualización de cada gráfica. 5 2 3 4 Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 99 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Visualización de la curva estándar Visualización de la curva estándar La pantalla Standard Curve (Curva estándar) muestra la curva estándar de las muestras designadas como estándares. El software StepOne calcula la cantidad de un gen diana desconocido a partir de la curva estándar. Acerca del experimento de ejemplo Visualización de la curva estándar En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, se pueden revisar los siguientes valores en la pantalla Standard Curve (Curva estándar): • Pendiente/eficiencia de amplificación • Valor R2 (coeficiente de correlación) • Valores CT 1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis (Análisis) Standard Curve (Curva estándar). Nota: Si en la pantalla Standard Curve (Curva estándar) no aparece ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar). 2. Para ver los 48 pocillos en la pantalla Standard Curve (Curva estándar), haga clic en la esquina superior izquierda de la disposición de la placa en la ficha View Plate Layout (Ver disposición de placa). 3. En el menú desplegable Target (Diana), seleccione All (Todas). 4. En el menú desplegable Plot Color (Color de gráfica), seleccione Default (Predeterminado). 5. Haga clic en gráfica). Show/Hide the plot legend (Mostrar/ocultar la leyenda de la 6. Observe los valores que se muestran bajo la curva estándar. En el experimento de ejemplo, los valores de cada gen diana se encuentran en los rangos aceptables: Diana Pendiente Valor R2 Eficiencia de amplificación (Eff%) GAPDH −3,438 1 95,363 c-myc −3,236 0,995 103,729 7. Compruebe si todas las muestras están dentro del rango de la curva estándar. En el experimento de ejemplo, todas las muestras (puntos azules) están dentro de la curva estándar (puntos rojos). Notas 100 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Visualización de la curva estándar 3 4 5 7 6 8. Compruebe los valores CT: a. Haga clic en la ficha View Well Table (Ver tabla de pocillos). b. En el menú desplegable Group By (Agrupar por), seleccione Replicate (Réplica). c. Fíjese en los valores de la columna CT. En el experimento de ejemplo, los valores CT están dentro del rango esperado (>8 y <35). Nota: Los valores CT de los pocillos D7, D8 y E1 son >35 debido a la poca cantidad de gen diana. No es necesario omitir los pocillos del análisis. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 101 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Visualización de la curva estándar 8a 8b 8c Directrices de análisis Cuando analice su propio experimento de curva estándar relativa, busque: • Valores de pendiente/eficiencia de amplificación: la eficiencia de la amplificación se calcula utilizando la pendiente de la línea de regresión de la curva estándar. Una pendiente próxima al −3,3 indica una eficiencia de amplificación de la PCR óptima, es decir, del 100%. Factores que afectan a la eficiencia de la amplificación: – Rango de cantidades estándar: para obtener medidas de la eficiencia más exactas, utilice un amplio rango de cantidades estándar, de 5 a 6 órdenes de magnitud. – Número de réplicas estándar: para obtener mediciones más precisas de la eficiencia, incluya réplicas para reducir los efectos de las imprecisiones del pipeteo. – Apantalladores de la PCR: los apantalladores de la PCR de la reacción pueden reducir la eficiencia de la amplificación. • Valores R2 (coeficiente de correlación): el valor R2 mide cuánto se ajusta la línea de regresión a los puntos de CT del estándar. El valor 1,00 indica un ajuste perfecto entre la línea de regresión y los puntos de datos. Es deseable que el valor R2 sea >0,99. • Valores CT: el ciclo umbral (CT) es el número de ciclo de PCR en el que la curva de amplificación corta el umbral. Es deseable que el valor CT sea >8 y <35. Si el valor CT es <8, eso indica que en la reacción hay demasiado molde. Si el valor CT es >35, eso indica que en la reacción hay poca cantidad de molde. Cuando los valores CT son >35, es de esperar que haya una desviación estándar mayor. Notas 102 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Revisión de la gráfica de amplificación Si el experimento no cumple las directrices anteriores, solucione los problemas de la siguiente forma: • Omita pocillos (consulte “Omisión de pocillos para el análisis” en la página 118). o • Vuelva a realizar el experimento. Para obtener más información Para obtener más información acerca de: • La pantalla Standard Curve (Curva estándar), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. • La eficiencia de la amplificación, consulte Amplification Efficiency of TaqMan® Gene Expression Assays Application Note. Revisión de la gráfica de amplificación En la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación), se muestra la amplificación de todas las muestras de los pocillos seleccionados. Hay disponibles tres gráficas: • ∆Rn vs Cycle (∆Rn vs ciclo): ∆Rn es la variación de la señal de fluorescencia normalizada generada en cada ciclo de la reacción de PCR y son los datos a partir de los cuales se calcula CT. En esta gráfica, ∆Rn se muestra en función del número de ciclo. La gráfica sirve para identificar y examinar las amplificaciones irregulares y para ver los valores del umbral y línea basal de la reacción. • Rn vs Cycle (Rn vs ciclo): Rn es la fluorescencia de fluorocromo del notificador normalizada. En esta gráfica, Rn se representa en función del número de ciclo. La gráfica sirve para identificar y examinar las amplificaciones irregulares. • CT vs Well (CT vs pocillo): el ciclo umbral (CT) es el número de ciclo de PCR en el cual el nivel de fluorescencia corta el umbral. En esta gráfica, CT se representa en función de la posición del pocillo. La gráfica sirve para localizar amplificaciones con valores atípicos. Cada gráfica se puede ver de las siguientes formas: lineal o log10. Acerca del experimento de ejemplo Revisión de la gráfica de amplificación En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, hay que revisar cada gen diana en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) para buscar: • Valores de umbral y línea basal correctos • Valores atípicos 1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis (Análisis) Amplification Plot (Gráfica de amplificación). Nota: Si en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) no aparece ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar). 2. Observe los pocillos de GAPDH en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación): Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 103 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Revisión de la gráfica de amplificación a. Haga clic en la ficha View Plate Layout (Ver disposición de placa). b. En los menús desplegables Select Wells With (Seleccionar pocillos con), seleccione Target (Diana) y, a continuación, GAPDH. 2a 2b 3. En la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación): a. En el menú desplegable Plot Type (Tipo de gráfica), seleccione ∆Rn vs Cycle (∆Rn vs ciclo). b. En el menú desplegable Color Plot By (Colorear gráfica por), seleccione Well (Pocillo). c. Haga clic en Show/Hide the plot legend (Mostrar/ocultar la leyenda de la gráfica). 4. Observe los valores de la línea basal: a. En el menú desplegable Graph Type (Tipo de gráfica), seleccione Linear (Lineal). b. Active la casilla de verificación Baseline (Línea basal) para ver los ciclos inicial y final de la línea basal. c. Compruebe que la línea basal está ajustada correctamente. En el experimento del ejemplo, la línea basal termina antes de que se inicie la amplificación. Notas 104 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Revisión de la gráfica de amplificación 3a 4a 3b 3c 4b 5. Observe los valores de umbral: a. En el menú desplegable Graph Type (Tipo de gráfica), seleccione Log (Registro). b. En el menú desplegable Target (Diana), seleccione GAPDH. c. Active la casilla de verificación Threshold (Umbral) para ver el umbral. d. Compruebe que el umbral está situado correctamente. En el experimento de ejemplo, el umbral está en la fase exponencial. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 105 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Revisión de la gráfica de amplificación 5a 5b 5c 6. Busque cualquier valor atípico: a. En el menú desplegable Plot Type (Tipo de gráfica), seleccione CT vs Well (CT vs pocillo). b. Busque pocillos fuera de la curva de amplificación. En el experimento de ejemplo, no hay ningún valor atípico para GAPDH. 6a Notas 106 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Revisión de la gráfica de amplificación 7. Repita los pasos 2 a 6 para los pocillos de c-myc. En el experimento de ejemplo, hay un valor atípico para el gen c-myc (pocillo D1). Omitirá este pocillo en la sección de solución de problemas (“Omisión de pocillos para el análisis” en la página 118). Directrices de análisis Cuando analice su propio experimento de curva estándar relativa, busque: • Los valores de línea basal y umbral correctos: el software StepOne calcula automáticamente los valores de línea basal y umbral dando por hecho que los datos tienen una gráfica de amplificación típica. Una gráfica de amplificación típica tiene: a. Una fase de meseta o plateau b. Una fase lineal c. Una fase exponencial (geométrica) d. Un determinado ruido de fondo e. Una línea basal a b Umbral c ∆Rn d Ciclo e ¡IMPORTANTE! Los errores en el experimento (por ejemplo, errores de contaminación o pipeteo) pueden producir curvas de amplificación atípicas que pueden derivar a cálculos incorrectos de los valores de línea basal y umbral por parte del software StepOne. Por lo tanto, Applied Biosystems recomienda examinar la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) y revisar los valores de línea basal y umbral asignados a cada pocillo después del análisis. • Valores atípicos Si el experimento no cumple las directrices anteriores, solucione los problemas de la siguiente forma: • Ajuste manualmente la línea basal y/o el umbral (consulte “Revisión de las opciones de análisis” en la página 114). O • Omita pocillos (consulte “Omisión de pocillos para el análisis” en la página 118). Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 107 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos Para obtener más información Para obtener más información acerca de la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos La pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica) muestra los resultados de los cálculos de cuantificación relativa a través del perfil de expresión génica. Hay disponibles dos gráficas: • RQ vs Target (Cuantificación relativa vs diana): agrupa los valores de cuantificación relativa (RQ) por diana. Se traza cada muestra para cada gen diana. • RQ vs Sample (Cuantificación relativa vs muestra): agrupa los valores de cuantificación relativa (RQ) por muestra. Se traza cada gen diana para cada muestra. Cada gráfica se puede ver de las siguientes formas: lineal, log10, Ln, log2. En la tabla de pocillos, se muestran datos de cada pocillo de la placa de reacción, incluidos: • El nombre de la muestra, el nombre de el gen diana, la tarea y los fluorocromos • El ciclo umbral calculado (CT), la fluorescencia normalizada (Rn) y los valores de cantidades • Avisos Acerca del experimento de ejemplo Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, se revisa: • Para cada gen diana de la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica) para el nivel de expresión (o cambio en número de veces de la expresión) de la muestra de gen diana en relación con la muestra de referencia. • La tabla de pocillos para evaluar la precisión de los grupos de réplicas. 1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis (Análisis) Gene Expression (Expresión génica). Nota: Si en la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica) no aparece ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar). 2. En la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica): a. En el menú desplegable Plot Type (Tipo de gráfica), seleccione RQ vs Sample (Cuantificación relativa vs Muestra). b. En el menú desplegable Graph Type (Tipo de gráfica), seleccione Log10. c. En el menú desplegable Orientation (Orientación), seleccione Vertical Bars (Barras verticales). Notas 108 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos d. Haga clic en Show/Hide the plot legend (Mostrar/ocultar la leyenda de la gráfica). En el experimento de ejemplo, se muestra el nivel de expresión de c-myc en el hígado en relación con su nivel de expresión en la muestra de referencia (riñón). Dado que la muestra de referencia se compara consigo misma, el nivel de expresión es 1. Si el resultado se muestra en el tipo de gráfico Log10, el nivel de expresión de la muestra de referencia aparece como 0 en el gráfico (log10 de 1=0). 2a 2b 2c 2d 3. Revise la tabla de pocillos: a. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis (Análisis) Amplification Plot (Gráfica de amplificación) y, a continuación, seleccione la ficha View Well Table (Ver tabla de pocillos). b. En el menú desplegable Group By (Agrupar por), seleccione Replicate (Réplica). c. Fíjese en la columna CT SD para evaluar la precisión de los grupos de réplicas. En el experimento de ejemplo, hay un valor atípico (pocillo D1). Este pocillo se omite en la sección de solución de problemas (“Omisión de pocillos para el análisis” en la página 118). Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 109 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos 3a 3b 3c 3c Nota: Para mostrar u ocultar columnas en la tabla de pocillos, marque/desmarque el nombre de columna en el menú desplegable Show in Table (Mostrar en tabla). Directrices de análisis Para obtener más información Cuando analice su propio experimento de curva estándar relativa, busque: • Diferencias en la expresión génica (como un cambio en número de veces de la expresión) en relación con la muestra de referencia. • Desviación estándar en los grupos de réplicas (valores CT SD). Si es preciso, omita los valores atípicos (“Omisión de pocillos para el análisis” en la página 118). Para obtener más información acerca de la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica) o la tabla de pocillos, acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. Notas 110 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Presentación de los datos Presentación de los datos Hay distintas formas de presentar los datos del experimento: • • • • • • Guardando la gráfica como un archivo de imagen Imprimiendo la gráfica Imprimiendo la disposición de la placa Creando diapositivas Imprimiendo un informe Exportando datos Para obtener más información acerca de estos procedimientos, acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 111 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Presentación de los datos Notas 112 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Sección 5.2 Solución de problemas Sección 5.2 Solución de problemas Esta sección cubre los siguientes temas: ■ Revisión de las opciones de análisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 ■ Revisión del resumen QC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116 ■ Omisión de pocillos para el análisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118 ■ Revisión de la gráfica multicomponente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120 ■ Revisión de la gráfica de datos brutos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122 Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 113 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Revisión de las opciones de análisis Revisión de las opciones de análisis El cuadro de diálogo Analysis Settings (Opciones de análisis) muestra las opciones de análisis del ciclo umbral (CT), los avisos, la cuantificación relativa y las opciones avanzadas. Si las opciones de análisis predeterminadas del software StepOne no son adecuadas para el experimento, puede cambiarlas en el cuadro de diálogo Analysis Settings (Opciones de análisis) y, a continuación, volver a analizar el experimento. Acerca del experimento de ejemplo En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, se utilizan las opciones de análisis predeterminadas sin ningún cambio. Revisión de las opciones de análisis 1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis (Análisis). 2. Haga clic en Analysis Settings (Opciones de análisis) para abrir el cuadro de diálogo Analysis Settings (Opciones de análisis). 3. En el experimento de ejemplo, se utilizan opciones de análisis para cada ficha: • CT Settings (Opciones de CT) • Flag Settings (Opciones de avisos) • Relative Quantification Settings (Opciones de cuantificación relativa) • Advanced Settings (Opciones avanzadas) Notas 114 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Revisión de las opciones de análisis Directrices de análisis A menos que ya haya determinado cuál son las opciones óptimas para el experimento, utilice las opciones de análisis predeterminadas en el software StepOne. Si las opciones predeterminadas no son adecuadas para el experimento, puede cambiar: • CT Settings (Opciones de CT): utilice esta ficha para ajustar manualmente el umbral y la línea basal. Si ajusta manualmente el umbral y la línea basal, Applied Biosystems recomienda lo siguiente: Opción Umbral Recomendación Introduzca un valor para el umbral de manera que: • Esté por encima del ruido de fondo. • Esté por debajo de las fases de meseta o plateau y fase lineal de la curva de amplificación. • Esté dentro de la fase exponencial de la curva de amplificación. Línea basal Seleccione los valores Start Cycle (Ciclo inicial) y End Cycle (Ciclo final) antes de que comience la amplificación. • Flag Settings (Opciones de avisos): utilice esta ficha para: – Ajustar la sensibilidad para que se marquen más o menos pocillos. – Cambiar los parámetros de los avisos que aplica el software StepOne. • Relative Quantitation Settings (Opciones de cuantificación relativa): utilice esta ficha para: – Cambiar la muestra de referencia y/o el control endógeno. – Seleccionar el algoritmo que se debe utilizar para determinar los valores mínimos y máximos de RQ (nivel de confianza o desviaciones estándar). • Advanced Settings (Opciones avanzadas): utilice esta ficha para cambiar las opciones de línea basal pocillo a pocillo. Para obtener más información Para obtener más información acerca de las opciones de análisis, acceda al software StepOne pulsando F1 cuando se abra el cuadro de diálogo Analysis Settings (Opciones de análisis). Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 115 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Revisión del resumen QC Revisión del resumen QC La pantalla QC Summary (Resumen QC) muestra una lista de avisos del software StepOne, e incluye la frecuencia y ubicación de los mismos en el experimento abierto. Acerca del experimento de ejemplo En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, hay que revisar la pantalla QC Summary (Resumen QC) para saber si los datos del experimento han desencadenado algún aviso: • Los pocillos D7, D8 y E1 han producido datos que han desencadenado el aviso HIGHSD. • El pocillo D1 ha producido datos que han desencadenado el aviso OUTLIERRG. Revisión del resumen QC 1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis (Análisis) QC Summary (Resumen QC). Nota: Si en la pantalla QC Summary (Resumen QC) no aparece ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar). 2. Revise el resumen de avisos. En el experimento de ejemplo, hay 4 pocillos marcados. 3. En la tabla Flag Details (Detalles de aviso), observe las columnas Frequency (Frecuencia) y Wells (Pocillos) para determinar qué avisos aparecen en el experimento. En el experimento de ejemplo: • El aviso HIGHSD aparece 3 veces, en los pocillos D7, D8 y E1. • El aviso OUTLIERRG aparece 1 vez en el pocillo D1. Nota: Un valor 0 en la columna Frequency (Frecuencia) indica que el aviso no aparece en el experimento. 4. Por cada aviso que aparezca en el experimento, haga clic en la fila de avisos para ver información detallada acerca del aviso. En el experimento de ejemplo: a. El aviso HIGHSD (pocillos D7, D8 y E1) indica una gran desviación estándar en el grupo de réplicas. Esto es lo esperado para los valores CT >35 debido a la poca cantidad de gen diana. No es necesario omitir los pocillos del análisis. b. El aviso OUTLIERRG (pocillo D1) indica que en el grupo de réplicas hay un valor atípico. Vaya a “Omisión de pocillos para el análisis” en la página 118 para quitar el pocillo D1. Notas 116 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Revisión del resumen QC 2 3 4 Posibles avisos En los experimentos de curva estándar relativa, los datos del experimento pueden desencadenar los avisos que se indican a continuación. Si en el experimento no aparece un aviso, su frecuencia será 0. Si la frecuencia es >0, eso significa que el aviso aparece en algún lugar del experimento. La posición del pocillo se indica en la columna Wells (Pocillos). Aviso Descripción AMPNC Amplificación en control negativo BADROX Señal de referencia pasiva incorrecta BLFAIL Error del algoritmo de línea basal CTFAIL Error del algoritmo CT EXPFAIL Error del algoritmo exponencial HIGHSD Desviación estándar alta en el grupo de réplicas NOAMP No hay amplificación NOISE Ruido mayor que otros pocillos en la placa NOSIGNAL No hay señal en el pocillo OFFSCALE La fluorescencia está fuera de la escala OUTLIERRG Valor atípico en el grupo de réplicas SPIKE Picos de ruido THOLDFAIL Error en el algoritmo del umbral Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 117 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Omisión de pocillos para el análisis Directrices de análisis Para obtener más información Cuando analice su propio experimento de curva estándar relativa: • Haga clic en cada aviso de la tabla Flag Details (Detalles de avisos) con una frecuencia >0 para ver información detallada acerca del aviso. Si es necesario, haga clic en el vínculo de solución de problemas para saber cómo corregir el aviso. • Puede cambiar las opciones de los avisos: – Ajustar la sensibilidad para que se marquen más o menos pocillos. – Cambiar los parámetros de los avisos que aplica el software StepOne. Para obtener más información acerca de la pantalla QC Summary (Resumen QC) o de las opciones de avisos, acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. Omisión de pocillos para el análisis Los errores de los experimentos pueden causar que algunos pocillos se amplifiquen de manera insuficiente o no se amplifiquen. Estos pocillos suelen producir valores CT que difieren significativamente de los valores medios de los pocillos de réplicas asociadas. Si se incluyen en los cálculos, estos valores atípicos pueden dar lugar a mediciones erróneas; para garantizar la precisión, omita los valores atípicos del análisis. Acerca del experimento de ejemplo Omisión de pocillos En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, se utiliza la tabla de pocillos para quitar el pocillo D1 del análisis. El pocillo D1 está marcado con el aviso OUTLIERRG (consulte “Revisión del resumen QC” en la página 116). 1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis (Análisis) Amplification Plot (Gráfica de amplificación). Nota: Si en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) no aparece ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar). 2. En la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación), seleccione CT vs Well (CT vs pocillo) en el menú desplegable Plot Type (Tipo de gráfica). 3. Seleccione la ficha View Well Table (Ver tabla de pocillos). 4. En la tabla de pocillos: a. En el menú desplegable Group By (Agrupar por), seleccione Replicate (Réplica). b. Fíjese si en el grupo de réplicas hay algún valor atípico (asegúrese de que están marcados con un aviso). En el experimento de ejemplo, el pocillo D1 es un valor atípico. c. Active la casilla de verificación Omit (Omitir) junto al pocillo D1. Notas 118 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Omisión de pocillos para el análisis 3 4a 2 Pocillo 4c 5. Haga clic en Analyze (Analizar) para volver a analizar los datos del experimento sin el pocillo D1. 5 Directrices de análisis Cuando analice su propio experimento de curva estándar relativa, fíjese bien si en los grupos de réplicas hay valores atípicos. Si es necesario, quite manualmente los valores atípicos con la tabla de pocillos. Siga el procedimiento “Omisión de pocillos” anterior para quitar los valores atípicos del experimento. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 119 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Revisión de la gráfica multicomponente Para obtener más información Para obtener más información acerca de la omisión de pocillos para el análisis, acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. En la ayuda, busque los temas relacionados con la omisión de pocillos: 1. Haga clic en la ficha Search (Buscar). 2. Escriba omit well (omisión de pocillos). 3. Haga clic en List Topics (Ver temas). 4. Haga doble clic en los temas que desee leer. Revisión de la gráfica multicomponente La pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente) muestra la contribución espectral completa de cada fluorocromo de un pocillo seleccionado durante el tiempo que dura el proceso de PCR. Acerca del experimento de ejemplo Revisión de la gráfica multicomponente En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, en la pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente) hay que fijarse en: • • • • Fluorocromo ROX™ (referencia pasiva) Fluorocromo FAM™ (notificador) Picos, depresiones y/o cambios repentinos Amplificación en pocillos de control negativo 1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis (Análisis) Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente). Nota: Si en la pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente) no aparece ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar). 2. Muestre un solo pocillo a la vez en la pantalla Multicomponente Plot (Gráfica multicomponente): a. Haga clic en la ficha View Plate Layout (Ver disposición de placa). b. Seleccione un pocillo en la disposición de la placa; el pocillo se muestra en la pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente). 3. En el menú desplegable Plot Color (Color de gráfica), seleccione Dye (Fluorocromo). 4. Haga clic en gráfica). Show/Hide the plot legend (Mostrar/ocultar la leyenda de la 5. Compruebe la señal del fluorocromo FAM. En el experimento de ejemplo, la señal del fluorocromo FAM aumenta a lo largo de la reacción de PCR, lo que indica que la amplificación es normal. Notas 120 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Revisión de la gráfica multicomponente 6. Compruebe la señal del fluorocromo ROX. En el experimento de ejemplo, la señal del fluorocromo ROX permanece constante a lo largo de la reacción de PCR, lo que indica que los datos son típicos. 3 4 2a 2b 5 6 7. Seleccione de uno en uno los pocillos de control negativo y compruebe la amplificación. En el experimento de ejemplo, no hay amplificación en los pocillos de control negativo. 7 Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 121 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Revisión de la gráfica de datos brutos Directrices de análisis Para obtener más información Cuando analice su propio experimento de curva estándar relativa, busque: • Referencia pasiva: el nivel de fluorescencia del fluorocromo de referencia pasiva debe permanecer relativamente constante a lo largo de la reacción de PCR. • Fluorocromo del notificador: el nivel de fluorescencia del fluorocromo del notificador debería presentar una región plana que se corresponde con la línea basal, seguida por un rápido aumento en la fluorescencia a medida que la amplificación continúa. • Cualquier irregularidad de la señal: no debería haber ningún pico, depresión ni cambio súbito en la señal fluorescente. • Pocillos de control negativo: no debería haber ninguna amplificación en los pocillos de control negativo. Para obtener más información acerca de la pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. Revisión de la gráfica de datos brutos En la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos), se muestra la señal de fluorescencia bruta (no normalizada) para cada filtro óptico de los pocillos seleccionados durante cada ciclo de la PCR a tiempo real. Acerca del experimento de ejemplo Revisión de la gráfica de datos brutos En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, hay que revisar la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos) para comprobar si hay un aumento estable de la señal (que no hay ninguna depresión ni cambio abrupto) a partir del filtro apropiado. 1. En el panel Experiment Menu (Menú de experimento), seleccione Analysis (Análisis) Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos). Nota: Si en la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos) no aparece ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar). 2. Para ver los 48 pocillos en la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos), haga clic en la esquina superior izquierda de la disposición de la placa en la ficha View Plate Layout (Ver disposición de placa). 3. Haga clic en gráfica). Show/Hide the plot legend (Mostrar/ocultar la leyenda de la 4. Haga clic y arrastre el puntero Show Cycle (Mostrar ciclo) desde el ciclo 1 al 40. En el experimento de ejemplo, hay un aumento estable en la señal desde el filtro 1, que se corresponde con el filtro del fluorocromo FAM™. Notas 122 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Revisión de la gráfica de datos brutos 3 4 Los filtros del sistema StepOne™ son: Filtro 1 Fluorocromo Fluorocromo FAM™ Fluorocromo SYBR® Green 2 Fluorocromo JOE™ Fluorocromo VIC® 3 Directrices de análisis Fluorocromo™ROX Cuando analice su propio experimento de curva estándar relativa, fíjese en lo siguiente para cada filtro: • Crecimiento característico de la señal • Depresiones o cambios abruptos Para obtener más información Para obtener más información acerca de la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 123 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa Revisión de la gráfica de datos brutos Notas 124 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos Este capítulo cubre los siguientes temas: ■ Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126 ■ Creación de un nuevo experimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127 ■ Definición de las propiedades del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129 ■ Definición de los métodos y materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131 ■ Configuración de los genes diana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135 ■ Configuración de las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137 ■ Configuración de las opciones de cuantificación relativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140 ■ Configuración del protocolo de termociclado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 ■ Revisión de la configuración de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142 ■ Solicitud de materiales para el experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148 ■ Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152 Nota: Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o seleccionando Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne). Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 125 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos Resumen del capítulo Resumen del capítulo En este capítulo, se explica cómo utilizar el asistente de diseño en el software StepOne™ para configurar el experimento de CT comparativos (∆∆CT). El asistente de diseño le guiará por los procedimientos óptimos recomendados por Applied Biosystems a medida que vaya introduciendo los parámetros de diseño del experimento de ejemplo. Flujo de trabajo del experimento de ejemplo A continuación, se muestra el flujo de trabajo para diseñar el experimento de ejemplo que se incluye en esta guía de introducción. Nota: Diseñe el experimento de ejemplo con el flujo de trabajo del asistente de diseño del software StepOne. Cuando diseñe sus propios experimentos, puede seleccionar flujos de trabajo alternativos (consulte “Uso de esta guía con sus propios experimentos” en la página 9). Experimento de CT comparativos (∆∆CT) Inicio del experimento Diseño del experimento (Capítulo 6) 1. Cree un nuevo experimento. 2. Defina las propiedades del experimento. 3. Defina los métodos y los materiales. 4. Configure los genes diana. 5. Configure las muestras. 6. Configure la cuantificación relativa. 7. Configure el protocolo de termociclado. 8. Revise la configuración de la reacción. 9. Solicite materiales para el experimento. 10.Finalice el flujo de trabajo del asistente de diseño. Preparación de las reacciones (Capítulo 7) Realización del experimento (Capítulo 8) Análisis del experimento (Capítulo 9) Fin del experimento Notas 126 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos Creación de un nuevo experimento Creación de un nuevo experimento Cree un experimento nuevo con el asistente de diseño del software StepOne. Creación de un experimento 1. Haga doble clic en (acceso directo al software StepOne) o seleccione Start (Inicio)All Programs (Todos los programas)Applied Biosystems StepOneStepOne v2.0. 2. En la pantalla Home (Inicio), haga clic en diseño) para abrir el asistente de diseño. Design Wizard (Asistente de 2 3. Consulte “Elementos del software” más adelante para obtener información acerca de la navegación por el asistente de diseño. Elementos del software A continuación, se ilustran los elementos del software StepOne para el asistente de diseño. 1. Barra de menús: muestra los menús disponibles en el software: • File (Archivo) • Edit (Edición) • Instrument (Instrumento) • Analysis (Análisis) • Tools (Herramientas) • Help (Ayuda) Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 127 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos Creación de un nuevo experimento 2. Barra de herramientas: muestra las herramientas disponibles en el software: • New Experiment (Experimento nuevo) • Open (Abrir) • Close (Cerrar) • Send Experiment to Instrument (Enviar experimento al instrumento) • Download Experiment from Instrument (Descargar experimento del instrumento) 3. Cabecera del experimento: indica el nombre del experimento, el tipo de experimento y los reactivos del experimento abierto. 4. Panel de navegación: ofrece enlaces a todas las pantallas del asistente de diseño: • Experiment Properties (Propiedades del experimento) • Methods & Materials (Métodos y materiales) • Targets (Dianas) • Opciones de cuantificación relativa • Samples (Muestras) • Run Method (Protocolo de termociclado) • Reaction Setup (Configuración de la reacción) • Materials List (Lista de materiales) Nota: Inicialmente, el asistente de diseño muestra el tipo de experimento Quantitation - Standard Curve (Cuantificación: curva estándar). Las pantallas disponibles de este asistente pueden cambiar si se selecciona otro tipo de experimento. Por ejemplo, la pantalla Relative Quantitation Settings (Opciones de cuantificación relativa) no aparece hasta que se selecciona el tipo de experimento de curva estándar o CT comparativos (∆∆CT). Notas 128 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos Definición de las propiedades del experimento 5. Fichas del experimento: se muestra una ficha por cada experimento abierto. 1 2 3 4 5 Definición de las propiedades del experimento En la pantalla Experiment Properties (Propiedades de experimento), escriba la información de identificación del experimento y, a continuación, seleccione el tipo de experimento que desea diseñar. Acerca del experimento de ejemplo Pantalla Experiment Properties (Propiedades de experimento) En el experimento de CT comparativos (∆∆CT) de ejemplo: • El experimento se identifica como un ejemplo. • Se utiliza una MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate. • El tipo de experimento es de cuantificación. 1. Haga clic en el campo Experiment Name (Nombre de experimento) y, a continuación, escriba Comparative CT Example (Ejemplo de CT comparativos). Nota: La cabecera del experimento se actualiza con el nombre del experimento que acaba de escribir. 2. Haga clic en el campo Barcode (Código de barras) y, a continuación, escriba el código de barras en la placa de reacción de PCR. 3. Haga clic en el campo User Name (Nombre de usuario) y, a continuación, escriba Example User (Usuario de ejemplo). Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 129 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos Definición de las propiedades del experimento 4. Haga clic en el campo Comments (Comentarios) y, a continuación, escriba Comparative CT Getting Started Guide Example (Ejemplo de la guía de introducción del CT comparativos). 5. Seleccione Quantitation (Cuantificación) en el tipo de experimento. 6. Haga clic en Next (Siguiente) >. 1 2 3 4 5 Directrices de diseño Cuando diseñe su propio experimento de CT comparativos: • Escriba un nombre para el experimento que sea descriptivo y fácil de recordar. El nombre del experimento se utiliza como nombre de archivo predeterminado del experimento. Puede introducir hasta 100 caracteres en el campo Experiment Name (Nombre de experimento). Nota: No se pueden utilizar los siguientes caracteres en en campo Experiment Name (Nombre de experimento): barra inclinada hacia delante (/), barra inclinada hacia atrás (\), signo mayor que (>), signo menor que (<), asterisco (*), signo de interrogación (?), comillas ("), línea vertical (|), dos puntos (:) o punto y coma (;). • Utilice MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plates, MicroAmp™ Fast 8-Tube Strips o MicroAmp® Fast Reaction Tubes with Caps. Los consumibles tipo rápido se pueden utilizar con reactivos tipo rápido y estándar. • (Opcional) Introduzca un código de barras para identificarlo en la placa de reacción de PCR. Puede introducir hasta 100 caracteres en el campo Barcode (Código de barras). • (Opcional) Escriba un nombre de usuario para identificar al propietario del experimento. Puede introducir hasta 100 caracteres en el campo User Name (Nombre de usuario). • (Opcional) Escriba comentarios para describir el experimento. Puede introducir hasta 1000 caracteres en el campo Comments (Comentarios). Notas 130 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos Definición de los métodos y materiales • Seleccione Quantitation (Cuantificación) en el tipo de experimento. Para obtener más información Para obtener más información acerca de: • La pantalla Experiment Properties (Propiedades de experimento), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. • Consumibles, consulte “Consumibles admitidos” en la página 3. • Experimentos de cuantificación, consulte la Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System. Definición de los métodos y materiales En la pantalla Methods & Materials (Métodos y materiales), seleccione el método de cuantificación, los reactivos, la velocidad de rampa y el tipo de molde de PCR que se van a utilizar en el experimento. Acerca del experimento de ejemplo Pantalla Methods & Materials (Métodos y materiales) En el experimento de CT comparativos de ejemplo: • • • • Se utiliza el método de cuantificación de CT comparativos. Se utilizan reactivos TaqMan®. Se utiliza la velocidad de rampa rápida en el proceso del instrumento. cDNA (preparado a partir de RNA total aislado de hígado, riñón y cerebro) es el tipo de molde. Antes de utilizar el molde cDNA, primero hay que realizar una retrotranscripción para convertir el RNA en cDNA (consulte “Preparación del molde” en la página 157). 1. Seleccione Comparative CT (∆∆CT) (CT comparativos) como método de cuantificación. 2. Seleccione ensayos TaqMan® para los reactivos. 3. Seleccione Fast (~40 minutes to complete a run) (Rápido (40 minutos aproximadamente para completar una reacción)) para la velocidad de la rampa. 4. Seleccione cDNA (complementary DNA) (cDNA (DNA complementario)) como tipo de molde. 5. Haga clic en Next (Siguiente) >. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 131 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos Definición de los métodos y materiales 1 2 3 4 Directrices de diseño Cuando diseñe su propio experimento de CT comparativos: • Seleccione Comparative CT (∆∆CT) (CT comparativos (∆∆CT) como método de cuantificación. Los experimentos de CT comparativos (∆∆CT) determinan el cambio de expresión de un gen diana en una muestra en relación con el mismo gen diana en una muestra de referencia. Para obtener los resultados, se utilizan fórmulas aritméticas. Para configurar la placa de reacción, el método de CT comparativos requiere dianas, muestras, una muestra de referencia y un control endógeno. Nota: Antes de utilizar el método de CT comparativos, Applied Biosystems recomienda determinar si las eficiencias de PCR del ensayo diana y el ensayo de control endógeno son aproximadamente iguales. Applied Biosystems TaqMan® Gene Expression Assays y Custom TaqMan® Gene Expression Assays tienen unas eficiencias de amplificación equivalentes del 100% (±10%). • Seleccione los reactivos que desea utilizar: – Seleccione ensayos TaqMan® si desea utilizar estos reactivos para detectar la amplificación y cuantificar la cantidad de gen diana en las muestras. Los reactivos TaqMan se componen de dos cebadores y una sonda TaqMan®. Los cebadores están diseñados para amplificar el gen diana. La sonda TaqMan está diseñada para hibridar en el gen diana y generar una señal de fluorescencia cuando se amplifica el gen diana. ¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo TAMRA™ como notificador ni apantallador con el sistema StepOne™. – Seleccione reactivos SYBR® Green si desea utilizar estos reactivos para detectar la amplificación y cuantificar la cantidad de gen diana en las muestras. Los reactivos SYBR Green se componen de dos cebadores y un fluorocromo SYBR Green. Los cebadores están diseñados para amplificar el gen diana. El Notas 132 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos Definición de los métodos y materiales fluorocromo SYBR Green genera una señal de fluorescencia cuando se une a DNA de doble cadena. El fluorocromo SYBR Green suele formar parte de la mezcla maestra SYBR Green que se añade a la reacción. Si utiliza un fluorocromo SYBR Green: Active la casilla de verificación Include Melt Curve (Incluir curva de disociación) para realizar un análisis de curva de disociación de el gen diana amplificado. Seleccione Standard (Estándar) para la velocidad de la rampa. Applied Biosystems no dispone de una mezcla maestra rápida para reactivos SYBR Green. Nota: Se pueden utilizar otros reactivos basados en fluorescencia en el sistema StepOne; sin embargo, debe diseñar su experimento con el flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) en lugar con el asistente de diseño. Consulte “Flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada)” en la página 206. • Seleccione la velocidad de rampa apropiada para el proceso del instrumento: – Seleccione Fast (~40 Minutes to Complete a Run) (Rápido (aproximadamente 40 minutos para completar una reacción)) si utiliza reactivos tipo rápido para las reacciones de PCR. – Seleccione Standard (~2 Hours to Complete a Run) (Estándar (aproximadamente 2 horas para completar una reacción)) si utiliza reactivos estándar para las reacciones de PCR (incluidos reactivos SYBR Green y reactivos TaqMan estándar). • Seleccione el molde de PCR apropiado: – Seleccione cDNA (complementary DNA) (cDNA (DNA complementario)) si va a realizar una RT-PCR de 2 pasos y ya ha realizado la retrotranscripción para convertir el RNA en cDNA. Se añade DNA complementario a las reacciones de PCR. – Seleccione RNA si va a realizar una RT-PCR de 1 paso. Se añade el RNA o mRNA total a las reacciones de PCR. – Seleccione gDNA (genomic DNA) (gDNA (DNA genómico)) si ya ha extraído el gDNA de un tejido o una muestra. Se añade DNA genómico purificado a las reacciones de PCR. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 133 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos Definición de los métodos y materiales Para obtener más información Para obtener más información acerca de: • La pantalla Methods & Materials (Métodos y materiales), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. • La determinación de las eficiencias de PCR, acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. En la ayuda, realice la búsqueda de la siguiente manera: a. Haga clic en la ficha Search (Buscar). b. Escriba PCR efficiency (Eficiencia de PCR). c. Haga clic en List Topics (Ver temas). d. Haga doble clic en Determine PCR Efficiency (Determinar la eficiencia de la • • • • PCR). Si utiliza el método de cuantificación de curva estándar relativa, consulte los capítulos 2 - 5 de esta guía. El uso del método de cuantificación de curva estándar, consulte la Guía de introducción a StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de curva estándar. Los reactivos TaqMan y SYBR Green, consulte la Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System. La PCR, incluida la PCR en singleplex y en multiplex, y la RT PCR de 1 y de 2 pasos, consulte la Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System. Notas 134 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos Configuración de los genes diana Configuración de los genes diana En la pantalla Targets (Dianas), escriba el número de genes diana que desea cuantificar en la placa de reacción de PCR y, a continuación, configure el ensayo para cada gen diana. Acerca del experimento de ejemplo Pantalla Targets (Dianas) En el experimento de CT comparativos de ejemplo: • Se cuantifican dos dianas en la placa de reacción. • El ensayo Target 1 (Diana 1) está configurado para el gen diana que se está estudiando. En el experimento de ejemplo, es TP53 (un factor de transcripción que regula otros genes). • El ensayo Target 2 (Diana 2) se configura para el control endógeno. Para el experimento de ejemplo, se trata de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) humano. El GAPDH se utiliza como control endógeno, porque sus niveles de expresión suelen ser relativamente estables. 1. Haga clic en el campo How many targets do you want to quantify in the reaction plate? (¿Cuántas dianas desea cuantificar en la placa de reacción?) y, a continuación, escriba 2. Nota: El número de filas de la tabla de ensayos diana se actualiza con el número que escriba. 2. Configure el ensayo Target 1 (Diana 1): a. Haga clic en la celda Enter Target Name (Escribir nombre de gen diana) y, a continuación, escriba TP53. b. En el menú desplegable Reporter (Notificador), seleccione FAM (predeterminado). c. En el menú desplegable Quencher (Apantallador), seleccione NFQ-MGB (predeterminado). d. Deje la opción predeterminada en el campo Color. 3. Configure el ensayo Target 2 (Diana 2): a. Haga clic en la celda Enter Target Name (Escribir nombre de gen diana) y, a continuación, escriba GAPDH. b. En el menú desplegable Reporter (Notificador), seleccione FAM (predeterminado). c. En el menú desplegable Quencher (Apantallador), seleccione NFQ-MGB (predeterminado). d. Deje la opción predeterminada en el campo Color. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 135 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos Configuración de los genes diana 4. Haga clic en Next (Siguiente) >. Nota: En todos los genes diana, deje en blanco el campo (Optional) Enter Gene Name ((Opcional) Escriba el nombre del gen). Puede buscar el identificador del gen/ensayo para solicitar los materiales (consulte “Solicitud de materiales para el experimento” en la página 148). 1 2 3 Directrices de diseño Cuando diseñe su propio experimento de CT comparativos: • Identifique cada ensayo diana con un nombre y un color únicos. Puede introducir hasta 100 caracteres en el campo Target Name (Nombre de gen diana). • Seleccione un control endógeno para cada muestra. El control endógeno es un gen diana que está presente en todas las muestras que se están investigando. Se debería expresar por igual en todos los tipos de muestras, con independencia del tratamiento o el origen del tejido (ejemplos de controles endógenos: β-actina, GAPDH y RNA ribosomal 18S [rRNA 18S]). El control endógeno se utiliza para normalizar los resultados de la PCR; el control endógeno corrige la cantidad de molde, la eficiencia de extracción del ácido nucleico, la eficiencia de la retrotranscripción y los errores de calibración de las pipetas. Tenga en cuenta que: – Cada tipo de muestra (por ejemplo, cada tejido de un estudio en el que se comparan múltiples tejidos) requiere un control endógeno. – Si las muestras están distribuidas en múltiples placas, cada placa debe tener un control endógeno. Asimismo, cada placa debe incluir un control endógeno para cada tipo de muestra de la placa. • Seleccione el fluorocromo del notificador utilizado en el ensayo diana: – Seleccione FAM si el fluorocromo FAM™ está unido al extremo de 5′ de la sonda TaqMan que se utiliza para detectar el gen diana. Notas 136 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos Configuración de las muestras – Seleccione JOE si el fluorocromo JOE™ está unido al extremo de 5′ de la sonda TaqMan que se utiliza para detectar el gen diana. – Seleccione VIC si el fluorocromo VIC® está unido al extremo de 5′ de la sonda TaqMan que se utiliza para detectar el gen diana. – Seleccione SYBR si utiliza fluorocromo SYBR® Green para detectar DNA de doble cadena. • Seleccione el apantallador utilizado en el ensayo diana: – Seleccione NFQ-MGB si a la sonda TaqMan de 3′ que está utilizando para detectar el gen diana hay unido un apantallador no fluorescente de unión al surco menor de la doble cadena de DNA. – Seleccione None (Ninguno) si se utiliza fluorocromo SYBR Green. ¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo TAMRA™ como notificador ni apantallador con el sistema StepOne™. Para obtener más información Para obtener más información acerca de: • La pantalla Targets (Dianas) , acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. • La selección de un control endógeno, consulte la nota de aplicación Using TaqMan® Endogenous Control Assays to Select an Endogenous Control for Experimental Studies. Configuración de las muestras En la pantalla Samples (Muestras), escriba el número de muestras, réplicas y controles negativos que va a incluir en la placa de reacción, escriba los nombres de las muestras y, a continuación, seleccione las reacciones de muestra/diana que va a configurar. Acerca del experimento de ejemplo En el experimento de CT comparativos de ejemplo: • Se utilizan tres muestras: cDNA preparado a partir de RNA total aislado de hígado, riñón y cerebro. Las muestras contienen cantidades desconocidas de TP53 (diana) y del gen GAPDH (control endógeno). • Se utilizan tres réplicas. Las réplicas son reacciones idénticas que contienen componentes y volúmenes idénticos. • Se utilizan seis controles negativos. Las reacciones de control negativo contienen agua en lugar de la muestra y no se deberían amplificar. El software incluye automáticamente tres controles negativos para cada ensayo diana. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 137 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos Configuración de las muestras Pantalla Samples (Muestras) 1. Haga clic en el campo How many samples do you want to test in the reaction plate? (Cuántas muestras desea probar en la placa de reacción?) y, a continuación, escriba 3. Nota: El número de filas de la tabla de las muestras se actualiza con el número que escriba. 2. Haga clic en el campo How many replicates do you need? (¿Cuántas réplicas necesita?) y, a continuación, escriba 3. 3. Configure la muestra 1: a. Haga clic en el campo Enter Sample Name (Escriba nombre de muestra) y, a continuación, escriba Liver (Hígado). b. Deje la opción predeterminada en el campo Color. 4. Configure la muestra 2: a. Haga clic en el campo Enter Sample Name (Escriba nombre de muestra) y, a continuación, escriba Kidney (Riñón). b. Deje la opción predeterminada en el campo Color. 5. Configure la muestra 3: a. Haga clic en el campo Enter Sample Name (Escriba nombre de muestra) y, a continuación, escriba Brain (Cerebro). b. Deje la opción predeterminada en el campo Color. 6. Seleccione All Sample/Target Reactions (Todas las reacciones de muestra/diana) para configurar todos los genes diana de todas las muestras. 7. En el panel Well Count (Número de pocillos), confirme que hay: • 18 pocillos desconocidos • 24 pocillos vacíos Nota: El software incluye automáticamente tres controles negativos para cada ensayo diana. Los pocillos de control negativo se muestran en la disposición de la placa (pocillos A1 a A6). 8. En la ficha View Plate Layout (Ver disposición de la placa), en el menú desplegable Arrange Plate by (Ordenar placa por), seleccione Rows (Filas) (predeterminado). 9. Haga clic en Next (Siguiente) >. Notas 138 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos Configuración de las muestras 8 1 2 3 4 5 6 7 Directrices de diseño Cuando diseñe su propio experimento de CT comparativos: • Identifique cada muestra con un nombre y un color únicos. Puede introducir hasta 100 caracteres en el campo Sample Name (Nombre de muestra). • Escriba el número de reacciones idénticas (réplicas) que desea configurar. Applied Biosystems recomienda tres réplicas para cada reacción de muestra. • El software incluye automáticamente tres controles negativos para cada ensayo diana. • Seleccione la combinación de reacciones de muestra/diana deseada: – Seleccione All Sample/Target Reactions (Todas las reacciones de muestra/diana) para configurar todos los genes diana de todas las muestras. – Seleccione Specify Sample/Target Reactions (Especifique reacciones de muestra/diana) para configurar de uno en uno los genes diana que se van a amplificar en cada muestra. Nota: En el asistente de diseño, cada reacción de PCR sólo puede contener una muestra y un ensayo diana. Para obtener más información Para obtener más información acerca de la pantalla Samples (Muestras), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 139 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos Configuración de las opciones de cuantificación relativa Configuración de las opciones de cuantificación relativa En la pantalla Relative Quantitation Settings (Opciones de cuantificación relativa), seleccione la muestra de referencia y el control endógeno para realizar la cuantificación relativa. Acerca del experimento de ejemplo Pantalla Relative Quantitation Settings (Opciones de cuantificación relativa) En el experimento de CT comparativos de ejemplo: • El tejido de cerebro se utiliza como muestra de referencia. • GAPDH se utiliza como control endógeno. 1. En el menú desplegable Which sample do you want to use as the reference sample? (¿Qué muestra desea utilizar como muestra de referencia?), seleccione Brain (cerebro). 2. En el menú desplegable Which target do you want to use as the endogenous control? (¿Qué diana desea utilizar como control endógeno?), seleccione GAPDH. 3. Haga clic en Next (Siguiente) >. 1 2 Directrices de diseño Cuando diseñe su propio experimento de CT comparativos: • Seleccione una muestra de referencia entre las muestras creadas anteriormente (“Configuración de las muestras” en la página 137). Los resultados de la amplificación de las muestras se comparan con los resultados de la amplificación de la muestra de referencia para determinar la expresión relativa. • Seleccione un control endógeno en los ensayos diana creados previamente (“Configuración de los genes diana” en la página 135). Los resultados de la amplificación del control endógeno se utilizan para normalizar los resultados de la amplificación del gen diana para corregir las diferencias en la cantidad de molde añadido a cada reacción. Notas 140 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos Configuración del protocolo de termociclado Para obtener más información Para obtener más información acerca de: • La pantalla Relative Quantitation Settings (Opciones de cuantificación relativa), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. • Las muestras de referencia (también denominadas calibradores) y los controles endógenos, consulte User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression. Configuración del protocolo de termociclado En la pantalla Run Method (Protocolo de termociclado), revise el volumen de la reacción y el perfil térmico del protocolo de termociclado predeterminado. Si es necesario, puede editar el protocolo de termociclado predeterminado o sustituirlo por otro de la biblioteca Run Method (Protocolo de termociclado). Acerca del experimento de ejemplo Revisión de la pantalla Run Method (Protocolo de termociclado) En el experimento de CT comparativos de ejemplo, se utiliza el protocolo de termociclado predeterminado sin modificaciones. 1. Haga clic en la ficha Graphical View (Vista gráfica) (predeterminada) o Tabular View (Vista tabular). 2. Asegúrese de que en el campo Reaction Volume Per Well (Volumen de reacción por pocillo) aparece 20 µL. 3. Asegúrese de que en el perfil térmico aparecen las etapas y los ciclos que se indican a continuación. 4. Haga clic en Next (Siguiente) >. 1 2 3 Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 141 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos Revisión de la configuración de la reacción Directrices de diseño Para obtener más información Cuando diseñe su propio experimento de CT comparativos: • Escriba un número entre 10 y 30 para el volumen de reacción/pocillo. El sistema StepOne admite volúmenes de reacción de entre 10 y 30 µL. • Revise el perfil térmico: – Asegúrese de que el perfil térmico es apropiado para los reactivos. – Si va a realizar una RT-PCR de 1 paso, incluya un paso de retrotranscripción. Si el experimento necesita un perfil térmico diferente, modifique el perfil térmico o cambie el protocolo de termociclado por otro de la biblioteca Run Method (Protocolo de termociclado). La biblioteca Run Method (Protocolo de termociclado) está incluida en el software StepOne. Para obtener más información acerca de la biblioteca Run Method (Protocolo de termociclado) o acerca de la pantalla Run Method (Protocolo de termociclado), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. Revisión de la configuración de la reacción En la pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción), seleccione el tipo de ensayo (si utiliza reactivos TaqMan) y, a continuación, revise los volúmenes calculados para preparar las reacciones de PCR y las diluciones de las muestras. Si es necesario, puede editar el volumen de reacción, el volumen de reacción de exceso, las concentraciones de los reactivos y/o la concentración de las muestras. ¡IMPORTANTE! Realice estos pasos para cada ensayo diana de la placa de reacción. Acerca del experimento de ejemplo En el experimento de CT comparativos de ejemplo: Se utilizan Applied Biosystems TaqMan® Gene Expression Assays. El volumen de reacción por pocillo es 20 µL. El volumen de reacción de exceso es del 10%. Los componentes de la reacción son: – TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕) – Ensayo de TP53 (20✕) – Ensayo de GAPDH (20✕) – Muestra – Agua • La concentración de la muestra diluida es de 5,0 ng/µL. • La concentración de la solución de partida de la muestra es de 100 ng/µL. • • • • Notas 142 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos Revisión de la configuración de la reacción Pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción) Complete la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción) para el ensayo de TP53 1. Seleccione la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción) (predeterminada). 2. En el panel Select Target (Seleccionar diana), seleccione TP53. 3. En el menú desplegable Assay Type (Tipo de ensayo), seleccione Inventoried/Made to Order (En inventario/Fabricado bajo pedido). 4. Asegúrese de que en el campo Reaction Volume Per Well (Volumen de reacción por pocillo) aparece 20 µL. 5. Asegúrese de que en el campo Excess Reaction Volume (Volumen de reacción en exceso) muestra 10%. 6. En el panel Reactions for TP53 (Reacciones para TP53): a. Asegúrese de que en el campo Master Mix Concentration (Concentración de mezcla maestra) aparece 2✕. b. Asegúrese de que en el campo Assay Mix Concentration (Concentración de ensayo) aparece 20✕. c. Revise los componentes y los volúmenes calculados para las reacciones de PCR: Componente Volumen (µL) para 1 reacción Mezcla maestra (2✕) 10,0 Ensayo (20✕) 1,0 Muestra (10✕) 2,0 ‡ H2O 7,0 Volumen total 20,0 ‡ El volumen de la muestra se limita al 10% del volumen total de la reacción. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 143 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos Revisión de la configuración de la reacción 3 4 5 1 2 6a 6b 6c Complete la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción) para el ensayo de GAPDH 1. Seleccione la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción) (predeterminada). 2. En el panel Select Target (Seleccionar diana), seleccione GAPDH. 3. En el menú desplegable Assay Type (Tipo de ensayo), seleccione Inventoried/Made to Order (En inventario/Fabricado bajo pedido). 4. Asegúrese de que en el campo Reaction Volume Per Well (Volumen de reacción por pocillo) aparece 20 µL. 5. Asegúrese de que en el campo Excess Reaction Volume (Volumen de reacción en exceso) muestra 10%. 6. En el panel Reactions for GAPDH (Reacciones para GAPDH): a. Asegúrese de que en el campo Master Mix Concentration (Concentración de mezcla maestra) aparece 2✕. b. Asegúrese de que en el campo Assay Mix Concentration (Concentración de ensayo) aparece 20✕. Notas 144 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos Revisión de la configuración de la reacción c. Revise los componentes y los volúmenes calculados para las reacciones de PCR: Componente Volumen (µL) para 1 reacción Mezcla maestra (2✕) 10,0 Ensayo (20✕) 1,0 Muestra (10✕) 2,0 ‡ H2O 7,0 Volumen total 20,0 ‡ El volumen de la muestra se limita al 10% del volumen total de la reacción. 3 4 5 1 2 6a 6b 6c Complete la ficha Sample Dilution Calculations (Cálculos de la dilución de muestra) 1. Seleccione la ficha Sample Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de muestra). 2. Haga clic en el campo Diluted Sample Concentration (10✕ for Reaction Mix) (Concentración de muestra diluida (10X para la mezcla de reacción)) y, a continuación, escriba 5,0. 3. En el menú desplegable de la unidad, seleccione ng/µL (predeterminado). Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 145 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos Revisión de la configuración de la reacción 4. Revise los volúmenes calculados para las diluciones de las muestras: Concentración de la solución origen (ng/µL) Volumen de muestra (µL) Volumen de disolvente (µL) Volumen total de muestra diluida (µL) Hígado 100,0 1,0 19,0 20,0 Riñón 100,0 1,0 19,0 20,0 Cerebro 100,0 1,0 19,0 20,0 Nombre de la muestra 1 2 3 4 Imprima las instrucciones de la configuración de la reacción Imprima las instrucciones detalladas de la configuración de la reacción y, a continuación, guárdelas para el Capítulo 7, “Preparación de las reacciones de CT comparativos.” 1. Haga clic en Print Reaction Setup (Imprimir configuración de reacción). 1 2. En el cuadro de diálogo, seleccione: • Detailed Reaction Setup Instructions (Instrucciones detalladas de la configuración de la reacción) • Include Plate Layout (Incluir disposición de la placa) • Use sample color (Utilizar color de muestra) Notas 146 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos Revisión de la configuración de la reacción 3. Haga clic en Print (Imprimir). 2 3 4. En el cuadro de diálogo Print (Imprimir), seleccione la impresora y las opciones de impresión y, a continuación, haga clic en OK (Aceptar). 5. Haga clic en Next (Siguiente) >. Directrices de diseño Cuando diseñe su propio experimento de CT comparativos: • Si utiliza reactivos TaqMan, seleccione el tipo de ensayo que va a utilizar: – Seleccione Inventoried/Made to Order (En inventario/Fabricado bajo pedido) si utiliza Applied Biosystems TaqMan®Gene Expression Assays (en inventario o fabricados bajo pedido) o Applied Biosystems Custom TaqMan®Gene Expression Assays. – Seleccione Custom (Personalizado) si va a diseñar sus propios ensayos con el software Primer Express®. • Escriba un número entre 10 y 30 para el volumen de reacción/pocillo. El sistema StepOne admite volúmenes de reacción de entre 10 y 30 µL. • Incluya el volumen de reacción en exceso para contabilizar la pérdida que se produce durante el pipeteo. Applied Biosystems recomienda un volumen de reacción en exceso de al menos el 10%. • Revise las concentraciones de la mezcla de reacción para cada gen diana: Si es necesario: – Para los reactivos TaqMan, modifique las concentraciones de la mezcla maestra y el ensayo. – Para los reactivos SYBR Green, modifique las concentraciones de la mezcla maestra, el cebador directo y el cebador reverso. – Para la RT-PCR de 1 paso, modifique la concentración de retrotranscripción. • Revise los componentes de la mezcla de reacción para cada gen diana: – Si va a trabajar de modo rápido, asegúrese de utilizar una mezcla maestra rápida en las reacciones de PCR. – Si va a realizar reacciones de PCR en modo estándar, asegúrese de utilizar una mezcla maestra tipo estándar en las reacciones de PCR. – En la RT-PCR de 1 paso, asegúrese de incluir retrotranscriptasa en las reacciones de PCR y de utilizar un tampón específico. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 147 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos Solicitud de materiales para el experimento • Revise los cálculos de la dilución de las muestras para cada muestra. Si es necesario, modifique la concentración de muestra diluida (incluidas las unidades) y la concentración de la solución de partida. Para obtener más información Para obtener más información acerca de: • La pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. • Para los ensayos de Applied Biosystems, refiérase a: – TaqMan® Gene Expression Assays Protocol – Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol Solicitud de materiales para el experimento En la pantalla Materials List (Lista de materiales), revise la lista de materiales que se recomiendan para preparar para la placa de reacción de PCR. Opcionalmente, puede solicitar los materiales recomendados a la tienda en línea de Applied Biosystems. Cree una cesta de la compra, añada productos a la cesta de compra y, a continuación, inicie la sesión para enviar su pedido. Para acceder a la tienda en línea de Applied Biosystems, debe tener una conexión a Internet ilimitada. Nota: El software StepOne recomienda los materiales que debe solicitar de acuerdo con el diseño del experimento. Se da por hecho que se va a diseñar el experimento, solicitar los materiales y luego preparar (Capítulo 7) y procesar (Capítulo 8) la placa de reacción cuando reciba los materiales. Acerca del experimento de ejemplo Pantalla Ordering Materials (Solicitud de materiales) En el experimento de CT comparativos de ejemplo, los materiales recomendados son: • • • • • MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate MicroAmp™ Optical 48-Well Adhesive Film TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase® UNG Ensayo de TP53: Hs00153340_m1 (RefSeq NM_000546.2) Ensayo de GAPDH: Kit de control endógeno de GAPDH (GAPDH) humano (PN 4333764T) 1. Busque el ensayo diana en la tienda en línea de Applied Biosystems: a. Asegúrese de que el ordenador está conectado a Internet. b. Haga clic en el campo Enter Gene Name (Escriba el nombre del gen), escriba TP53 y, a continuación, haga clic en Find Assay (Buscar ensayo). c. En el cuadro de diálogo Find Assay Results (Buscar resultados de ensayo), seleccione la fila Hs00153340_m1. d. Haga clic en el campo Enter Gene Name (Escriba el nombre del gen), escriba GAPDH y, a continuación, haga clic en Find Assay (Buscar ensayo). Notas 148 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos Solicitud de materiales para el experimento e. En el cuadro de diálogo Find Assay Results (Buscar resultados de ensayo), seleccione la fila 4333764T. f. Haga clic en Apply Assay Selection (Aplicar selección de ensayo). 2. Complete el panel Experiment Materials List (Lista de materiales del experimento): a. En el menú desplegable Display (Visualización), seleccione All Items (Todos los elementos) (predeterminada) y, a continuación, revise los materiales recomendados. Si es necesario, utilice la barra de desplazamiento situada a la derecha para ver todos los elementos. b. Active la casilla de verificación junto a cada uno de los siguientes elementos: • • • • • MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate MicroAmp™ Optical 48-Well Adhesive Film TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase® UNG Ensayo de TP53: Hs00153340_m1 (RefSeq NM_000546.2) Ensayo de GAPDH: Kit de control endógeno de GAPDH (GAPDH) humano (PN 4333764T) Nota: Para obtener más información acerca de un elemento específico, haga clic en el vínculo del número de referencia para conectarse a la tienda en línea de Applied Biosystems. En la página de inicio, escriba el número de referencia en el campo Search (Búsqueda) y, a continuación, haga clic en Go (Ir). c. Haga clic en Add Selected Items to Shopping List (Añadir elementos seleccionados a la cesta de compra). 3. Compruebe si la cesta de compra del experimento contiene los materiales deseados y que las cantidades son correctas y, a continuación, haga clic en Order Materials in List (Solicitar materiales de la lista). Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 149 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos Solicitud de materiales para el experimento 1b,1d 2a 2c 2b 3 4. En el cuadro de diálogo, Order Materials - Log In (Solicitar materiales – Inicio de sesión), escriba el nombre de usuario y la contraseña de la tienda en línea de Applied Biosystems y, a continuación, haga clic en Login and Submit (Iniciar la sesión y enviar). Nota: Si no tiene cuenta en la tienda en línea de Applied Biosystems, haga clic en Register Now (Registrarse ahora) para crear una cuenta. 4 5. Después de realizar el pedido, haga clic en Finish Designing Experiment (Finalizar el diseño del experimento). Directrices de diseño Cuando diseñe su propio experimento de CT comparativos: • Confirme que el ordenador tiene una conexión a Internet ilimitada. Notas 150 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos Solicitud de materiales para el experimento • Applied Biosystems recomienda las siguientes versiones de navegadores y Adobe® Acrobat® Reader para utilizar el sitio web de Applied Biosystems: Sistema operativo del pc de escritorio Netscape® Navigator Microsoft® Internet Explorer Adobe® Acrobat® Reader Windows® 98/NT/2000 v6.x o posterior v6.x o posterior v4.0 o posterior Macintosh® OS 9 o posterior v6.x o posterior v5.2 o posterior v4.0 o posterior Nota: Asegúrese de que se han activado las cookies y Java Script para que el sitio web funcione correctamente. • Seleccione todos los materiales que necesite para el experimento y añádalos a la cesta de compra. Para obtener más información Para obtener más información acerca de la pantalla Materials List (Lista de materiales), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 151 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño Para finalizar el flujo de trabajo del asistente de diseño, revise la disposición de la placa y, a continuación, seleccione una opción de salida. Acerca del experimento de ejemplo El software StepOne selecciona automáticamente ubicaciones para los pocillos en la placa de reacción. En el experimento de CT comparativos de ejemplo: • Los pocillos se colocan tal y como se muestra a continuación. • El experimento se guarda tal y como está y se cierra. Nota: Para el experimento de ejemplo, no realice el proceso en este momento. Finalización del asistente de diseño 1. En la ventana Review Plate for Experiment (Revisar placa para el experimento), revise la disposición de la placa. Asegúrese de que hay: • 18 pocillos desconocidos • 6 pocillos de control negativo • 24 pocillos vacíos Nota: Si la disposición de la placa es incorrecta, haga clic en Return to the Wizard (Volver al asistente) y compruebe los valores que ha introducido. 2. Haga clic en Save Experiment (Guardar experimento). Notas 152 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño 2 1 3. En el cuadro de diálogo Save Experiment (Guardar experimento), haga clic en Save (Guardar) para aceptar la ubicación y el nombre de archivo predeterminados. El experimento de ejemplo se guarda y se cierra, y regresa a la pantalla de inicio. Nota: De manera predeterminada, el experimento de ejemplo se guarda en la carpeta Applied Biosystems\StepOne System\experiments. 3 Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 153 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño Directrices de diseño Para obtener más información Cuando diseñe su propio experimento de CT comparativos: • En la ventana Review Plate for Experiment (Revisar placa para el experimento), seleccione la opción de salida apropiada: – Haga clic en Save Experiment (Guardar experimento) si desea guardar y cerrar el experimento sin realizar ningún otro cambio ni iniciar el proceso. – Haga clic en Start Run for This Experiment (Iniciar proceso para este experimento) si desea guardar el experimento e iniciar el proceso. Asegúrese de que la placa de reacción está cargada en el instrumento. – Haga clic en Edit Plate Layout (Editar disposición de placa) si desea utilizar el flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) para modificar la disposición de la placa. – Haga clic en Create Another Experiment Using the Design Wizard (Crear otro experimento con el asistente de diseño) si desea guardar y cerrar el experimento y, a continuación, crear otro experimento con el asistente de diseño. – Haga clic en Return to the Wizard (Regresar al asistente) si desea regresar al experimento para realizar cambios con el asistente de diseño. • De manera predeterminada, los experimentos se guardan en la carpeta Applied Biosystems\StepOne System\experiments. Para cambiar: – La ubicación en la que se guarda un experimento específico, desplácese a la ubicación deseada con el cuadro de diálogo Save Experiment (Guardar experimento). – La ubicación en la que se guardan los experimentos de manera predeterminada, seleccione Tools (Herramientas)Preferences (Preferencias) y, a continuación, seleccione la ficha General (predeterminada). En el campo Default Data Folder (Carpeta de datos predeterminada), desplácese a la ubicación deseada. Para obtener más información acerca del uso del flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada), consulte “Flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada)” en la página 206. Notas 154 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos Este capítulo cubre los siguientes temas: ■ Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156 ■ Preparación del molde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157 ■ Preparación de las diluciones de las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158 ■ Preparación de la mezcla de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 160 ■ Preparación de la placa de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163 Nota: Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o seleccionando Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne). Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 155 Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos Resumen del capítulo Resumen del capítulo En este capítulo, se explica cómo preparar las reacciones de PCR para el experimento de CT comparativos (∆∆CT) de ejemplo y se ofrecen directrices para preparar las reacciones de PCR para su propio experimento de CT comparativos. Flujo de trabajo del experimento de ejemplo A continuación, se muestra el flujo de trabajo para preparar las reacciones de PCR para el experimento de ejemplo que se incluye en esta guía de introducción. Experimento de CT comparativos (∆∆CT) Inicio del experimento Diseño del experimento (Capítulo 6) Preparación de las reacciones (Capítulo 7) 1. Prepare el molde. 2. Prepare las diluciones de las muestras. 3. Prepare la mezcla de reacción para cada ensayo diana. 4. Prepare la placa de reacción. Realización del experimento (Capítulo 8) Análisis del experimento (Capítulo 9) Fin del experimento Notas 156 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos Preparación del molde Preparación del molde Prepare el molde para las reacciones de PCR con el High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit. ¡IMPORTANTE! Applied Biosystems recomienda utilizar High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit para realizar una retrotranscripción a partir de RNA total y obtener un conjunto de cDNA. Los TaqMan® Gene Expression Assays se han diseñado utilizando el High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit; no se han probado otros protocolos para los TaqMan Gene Expression Assays. Acerca del experimento de ejemplo Materiales necesarios Para el experimento de CT comparativos de ejemplo, el molde para las reacciones de PCR es cDNA sintetizado a partir de las muestras de RNA total utilizando el High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit. • RNA aislado total preparado a partir de tejidos de hígado, riñón y cerebro. • Uno de los Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits: Kit Número de referencia High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (200 reacciones) 4368814 High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (1000 reacciones) 4368813 High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor (200 reacciones) 4374966 High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor (1000 reacciones) 4374967 Nota: El High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit se llamaba antiguamente High-Capacity cDNA Archive Kit. Preparación del molde Utilice el High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit para sintetizar cDNA de cadena sencilla a partir de las muestras de RNA total. Siga los procedimientos de Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol para: 1. Preparar la mezcla maestra de la reacción. PELIGRO QUÍMICO. El tampón de reacción 10X puede causar irritación de los ojos, la piel y las vías respiratorias. Consulte la ficha técnica de seguridad (MSDS) y siga las instrucciones de manipulación indicadas. Use protectores oculares, vestimenta protectora y guantes apropiados. 2. Prepare las reacciones de cDNA. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 157 Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos Preparación de las diluciones de las muestras 3. Realice la retrotranscripción en un termociclador. Directrices de preparación Para obtener más información Cuando prepare su propio experimento de CT comparativos (∆∆CT): • Applied Biosystems recomienda extraer primero el DNA o RNA del tejido o muestra. • Applied Biosystems recomienda los siguientes moldes: – cDNA (cDNA) complementario: cDNA sintetizado a partir de las muestras de RNA total utilizando un High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit. – RNA: RNA o mRNA total purificado extraído de un tejido o una muestra. – DNA (gDNA) genómico: gDNA purificado ya extraído de un tejido o una muestra. Para obtener más información acerca de: • La preparación de moldes de cDNA, consulte Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol (PN 4375575). El protocolo no se incluye en los High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits. Puede descargarlo desde el sitio web Applied Biosystems Documents on Demand: http://docs.appliedbiosystems.com/search.taf • La preparación de moldes de RNA o gDNA, consulte el protocolo de los reactivos de purificación que haya seleccionado. Para localizar los reactivos de purificación de Applied Biosystems, visite el sitio web de Applied Biosystems: http://www.appliedbiosystems.com/ Preparación de las diluciones de las muestras Realice diluciones de las muestras antes de añadir las muestras a la mezcla de reacción final. Diluya las muestras con los volúmenes que ha calculado el software StepOne™ (“Complete la ficha Sample Dilution Calculations (Cálculos de la dilución de muestra)” en la página 145). Acerca del experimento de ejemplo Para el experimento de CT comparativos de ejemplo: • Las diluciones de las muestras son necesarias porque el volumen de las muestras se limita al 10% del volumen total de la reacción en el software StepOne. El volumen total de la reacción es de 20 µL/reacción, por lo que el volumen de las muestras es de 2 µL/reacción. • La concentración de la solución de partida es de 100 ng/µL. Después de diluir la muestra de acuerdo con la tabla Sample Dilutions Calculations (Cálculos de diluciones de las muestras), la muestra tendrá una concentración de 5,0 ng/µL. Esto supone una concentración de 10✕ cuando se añaden 2 µL al volumen de mezcla de reacción final de 20 µL. Hay una concentración de 1✕ en la reacción final. Notas 158 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos Preparación de las diluciones de las muestras • Los volúmenes calculados en el software son: Concentración de la solución origen (ng/µL) Volumen de muestra (µL) Volumen de disolvente (µL) Volumen total de muestra diluida (µL) Hígado 100,0 1,0 19,0 20,0 Riñón 100,0 1,0 19,0 20,0 Cerebro 100,0 1,0 19,0 20,0 Nombre de la muestra Materiales necesarios Preparación de las diluciones de las muestras • • • • • • • Agua para diluir la muestra Tubos de microcentrífuga Pipetas Puntas de pipeta Solución de partida de las muestras Agitador Centrífuga 1. Etiquete un tubo de microcentrífuga diferente para cada muestra diluida: • Hígado • Riñón • Cerebro 2. Añada el volumen de agua requerido (disolvente) a cada tubo vacío: Tubo Nombre de la muestra Volumen de disolvente (µL) 1 Hígado 19,0 2 Riñón 19,0 3 Cerebro 19,0 3. Añada el volumen de solución de partida de las muestras requerido (disolvente) a cada tubo vacío: Tubo Nombre de la muestra Volumen de muestra (µL) 1 Hígado 1,0 2 Riñón 1,0 3 Cerebro 1,0 4. Agite cada muestra diluida entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifugue brevemente los tubos. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 159 Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos Preparación de la mezcla de reacción 5. Coloque las muestras diluidas en hielo hasta que prepare la placa de reacción. Directrices de preparación Para obtener más información Cuando prepare su propio experimento de CT comparativos: • Podría necesitar diluciones de las muestras porque el volumen de las muestras se limita al 10% del volumen total de la reacción en el software StepOne. Debe realizar diluciones de las muestras antes de añadir las muestras a la mezcla de reacción final. • Para conseguir un rendimiento óptimo de los TaqMan® Gene Expression Assays o los Custom TaqMan® Gene Expression Assays, utilice entre 10 y 100 ng de molde de cDNA por 20-µL de reacción. Para reactivos tipo rápido, Applied Biosystems recomienda 10 ng. • Utilice tampón TE o agua para diluir la muestra. Para obtener más información acerca de los ensayos de Applied Biosystems, consulte: • TaqMan® Gene Expression Assays Protocol • Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol. Preparación de la mezcla de reacción Prepare la mezcla de reacción con los componentes y volúmenes que ha calculado el software StepOne (“Complete la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción) para el ensayo de TP53” en la página 143 y “Complete la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción) para el ensayo de GAPDH” en la página 144). Nota: El software calcula todos los componentes de las reacciones de PCR. Sin embargo, para preparar la mezcla de reacción de esta sección, incluya únicamente la mezcla maestra, el ensayo y agua. Añada la muestra cuando prepare la placa de reacción (consulte “Preparación de la placa de reacción” en la página 163). Acerca del experimento de ejemplo Para el experimento de CT comparativos de ejemplo: • Los componentes de la mezcla de reacción son: – TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕) – Ensayo de TP53 (20✕) – Ensayo de GAPDH (20✕) – Agua Notas 160 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos Preparación de la mezcla de reacción • Los volúmenes calculados en el software para ambos ensayos diana son: Componente Volumen (µL) para 1 reacción Mezcla maestra (2✕) 10,0 Ensayo (20✕) 1,0 H2O 7,0 Volumen total 18,0 Nota: En este momento, no se añade la muestra. Materiales necesarios Preparación de la mezcla de reacción • • • • • Tubos de microcentrífuga Pipetas Puntas de pipeta Componentes de la mezcla de reacción (enumerados arriba) Centrífuga ¡IMPORTANTE! Prepare la mezcla de reacción para cada ensayo diana por separado. 1. Etiquete un tubo del tamaño apropiado para cada mezcla de reacción: • Mezcla de reacción para TP53 • Mezcla de reacción para GAPDH 2. Para el ensayo de TP53, añada los volúmenes requeridos de cada componente al tubo de la mezcla de reacción de TP53: Volumen (µL) para 1 reacción Volumen (µL) para 12 reacciones (más un exceso del 10%) TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕) 10,0 132,0 Ensayo de TP53 (20✕) 1,0 13,2 Agua 7,0 92,4 Volumen total de la mezcla de reacción 18,0 237,6 Componente Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 161 Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos Preparación de la mezcla de reacción 3. Para el ensayo de GAPDH, añada los volúmenes requeridos de cada componente al tubo de la mezcla de reacción de GAPDH: Volumen (µL) para 1 reacción Volumen (µL) para 12 reacciones (más un exceso del 10%) TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕) 10,0 132,0 Ensayo de GAPDH (20✕) 1,0 13,2 Agua 7,0 92,4 Volumen total de la mezcla de reacción 18,0 237,6 Componente 4. Para mezclar la mezcla de reacción de cada tubo, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo y, a continuación, tápelos. 5. Centrifugue brevemente los tubos para quitar las burbujas de aire. 6. Coloque las mezclas de las reacciones en hielo hasta que prepare la placa de reacción. Directrices de preparación Para obtener más información Cuando prepare su propio experimento de CT comparativos: • Si el experimento incluye más de un ensayo diana, prepare la mezcla de reacción para cada ensayo diana de manera separada. • Incluya un volumen de exceso en los cálculos para compensar la pérdida que se produce durante las transferencias de reactivos. Applied Biosystems recomienda un volumen de exceso de al menos el 10%. • Incluya todos los componentes requeridos. • Prepare los reactivos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. • Mantenga los ensayos protegidos de la luz, en el refrigerador, hasta que esté listo para usarlos. Una exposición excesiva a la luz puede afectar a las sondas fluorescentes. • Antes de utilizarlo: – Dé vueltas al bote para mezclar bien la mezcla maestra. – Agite el ensayo para resuspenderlo y, a continuación, centrifugue brevemente el tubo. – Para descongelar las muestras congeladas, colóquelas en hielo. Una vez descongeladas, agite las muestras para resuspenderlas y, a continuación, centrifugue los tubos brevemente. Para obtener más información acerca de la preparación de la mezcla de reacción, consulte el protocolo apropiado para los reactivos que está utilizando en las reacciones de PCR: • TaqMan® Gene Expression Assays Protocol Notas 162 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos Preparación de la placa de reacción • Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol Preparación de la placa de reacción Prepare las reacciones para cada grupo de réplicas y, a continuación, transfiéralas a la placa de reacción. Utilice la disposición de la placa que se muestra en el software StepOne. Acerca del experimento de ejemplo Materiales necesarios Para el experimento de CT comparativos de ejemplo: • Se utiliza una MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate. • El volumen de la reacción es de 20 µL/pocillo. • La placa de reacción contiene: – 18 pocillos desconocidos – 6 pocillos de control negativo – 24 pocillos vacíos • Se utiliza la disposición de la placa que genera automáticamente el software StepOne: • • • • • • • • • • Tubos de microcentrífuga Pipetas Puntas de pipeta Mezcla de reacción para TP53 (página 161) Mezcla de reacción para GAPDH (página 161) Agua Muestras (página 159) MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate MicroAmp™ Optical 48-Well Adhesive Film Centrífuga Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 163 Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos Preparación de la placa de reacción Preparación de la placa de reacción 1. Para cada gen diana, prepare las reacciones de control negativo: a. A un tubo del tamaño apropiado, añada los volúmenes de la mezcla de reacción y de agua que se indican a continuación. Tubo Mezcla de reacción Volumen de la mezcla de reacción (µL) Volumen de agua (µL) 1 Mezcla de reacción para TP53 59,4 6,6 2 Mezcla de reacción para GAPDH 59,4 6,6 b. Para mezclar la reacción, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo y, a continuación, tape el tubo. c. Centrifugue brevemente el tubo para quitar las burbujas de aire. d. Añada 20 µL de la reacción de control negativo a los pocillos apropiados de la placa de reacción. 2. Por cada grupo de réplicas, prepare las reacciones para los elementos desconocidos o muestras: a. A tubos del tamaño adecuado, añada los volúmenes de la mezcla de reacción y de las muestras que se indican a continuación. Mezcla de reacción Volumen de la mezcla de reacción (µL) Volumen de muestra (µL) Tubo Reacción desconocida 1 Hígado TP53 Mezcla de reacción para TP53 59,4 Hígado 6,6 2 Riñón TP53 Mezcla de reacción para TP53 59,4 Riñón 6,6 3 Cerebro TP53 Mezcla de reacción para TP53 59,4 Cerebro 6,6 4 GAPDH en hígado Mezcla de reacción para GAPDH 59,4 Hígado 6,6 5 GAPDH en riñón Mezcla de reacción para GAPDH 59,4 Riñón 6,6 Muestra Notas 164 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos Preparación de la placa de reacción Tubo 6 Reacción desconocida Mezcla de reacción Cerebro GAPDH Mezcla de reacción para GAPDH Volumen de la mezcla de reacción (µL) 59,4 Muestra Cerebro Volumen de muestra (µL) 6,6 b. Para mezclar las reacciones, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo y, a continuación, tape los tubos. c. Centrifugue brevemente los tubos para quitar las burbujas de aire. d. Añada 20 µL de la mezcla de reacción desconocida (muestra) a los pocillos apropiados de la placa. 3. Selle la placa de reacción con película adhesiva óptica. 4. Centrifugue brevemente la placa de reacción para quitar las burbujas de aire. 5. Hasta que esté preparado para realizar la reacción, coloque la placa de reacción en hielo en un sitio oscuro. Directrices de preparación Para obtener más información Cuando prepare su propio experimento de CT comparativos: • Procure utilizar los consumibles adecuados. • Asegúrese de que la colocación de las reacciones de PCR se corresponde con la disposición de la placa que se muestra en el software StepOne. Puede: – Aceptar la disposición de la placa que genera automáticamente el software. o – Utilizar el flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) para cambiar la disposición de la placa en el software. Para obtener más información acerca de: • La preparación de la placa de reacción, consulte el protocolo apropiado para los reactivos que está utilizando en las reacciones de PCR: – TaqMan® Gene Expression Assays Protocol – Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol • Los consumibles, consulte la página 3. • El uso del flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) para cambiar la disposición de la placa, consulte “Flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada)” en la página 206. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 165 Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos Preparación de la placa de reacción Notas 166 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 8 Realización del experimento de CT comparativos Este capítulo cubre los siguientes temas: ■ Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168 ■ Preparación de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169 ■ Realización del experimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171 Nota: Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o seleccionando Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne). Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 167 Capítulo 8 Realización del experimento de CT comparativos Resumen del capítulo Resumen del capítulo En este capítulo, se explica cómo realizar una reacción en Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System. Flujo de trabajo del experimento de ejemplo A continuación, se muestra el flujo de trabajo para realizar el experimento de ejemplo que se incluye en esta guía de introducción. Inicio del experimento Diseño del experimento (Capítulo 6) Preparación del experimento (Capítulo 7) Realización del experimento (Capítulo 8) 1. Prepare el proceso. 2. Active las opciones de notificación. 3. Inicie el proceso. 4. Monitorice el proceso. 5. Descargue el instrumento y transfiera los datos. Análisis del experimento (Capítulo 9) Fin del experimento Notas 168 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 8 Realización del experimento de CT comparativos Preparación de la reacción Preparación de la reacción Para preparar el proceso, abra el experimento y cargue la MicroAmp™ Fast Optical 48Well Reaction Plate en el instrumento StepOne™. Apertura del experimento de ejemplo 1. Si aún no se está ejecutando el software StepOne™, haga doble clic en (acceso directo al software StepOne) o seleccione Start (Inicio)All Programs (Todos los programas)Applied Biosystems StepOneStepOne v2.0. 2. En la pantalla Home (Inicio), haga clic en Open (Abrir). 3. En el cuadro de diálogo Open (Abrir), desplácese hasta la carpeta experiments (experimentos) (predeterminada). 4. Haga doble clic en Comparative CT Example (Ejemplo de CT comparativos) para abrir el archivo del experimento de ejemplo que ha creado en el Capítulo 6. 2 3 4 Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 169 Capítulo 8 Realización del experimento de CT comparativos Preparación de la reacción Carga de la placa de reacción PELIGRO DE LESIONES FÍSICAS. Durante el uso del instrumento, la temperatura del bloque puede superar los 100 °C. Si el instrumento se ha utilizado recientemente, mantenga las manos alejadas de él hasta que el bloque alcance la temperatura ambiente. ¡IMPORTANTE! Lleve guantes sin polvo para manejar la placa de reacción. 1. Abra la bandeja del instrumento. 2. Coloque las reacciones en el bloque. La colocación de las reacciones depende del tipo de consumible que se utilice: • Si utiliza una placa de reacción, colóquela con el pocillo A1 en la esquina posterior izquierda. • Si utiliza tiras de tubos de reacción, colóquelas en el bloque directamente. A1 3. Cierre cuidadosamente la bandeja del instrumento. Notas 170 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 8 Realización del experimento de CT comparativos Realización del experimento Realización del experimento Realice los siguientes procedimientos del capítulo 4: • • • • “(Opcional) Activación de las notificaciones” en la página 71 “Inicio de la reacción” en la página 73 “Monitorización de la reacción” en la página 76 “Descarga de la placa de reacción y transferencia de datos” en la página 87 Asegúrese de seleccionar el archivo Comparative CT Example.eds en lugar del archivo Relative Standard Curve Example.eds. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 171 Capítulo 8 Realización del experimento de CT comparativos Realización del experimento Notas 172 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Este capítulo cubre los siguientes temas: ■ Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174 ■ Sección 9.1 Revisión de los resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175 ■ Sección 9.2 Solución de problemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193 Nota: Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o seleccionando Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne). Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 173 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Resumen del capítulo Resumen del capítulo El software StepOne™ analiza los datos con el método de cuantificación de CT comparativos (∆∆CT). En la primera sección de este capítulo, se explica cómo revisar los datos analizados utilizando las pantallas de análisis y cómo presentar los datos. Si los resultados son cuestionables, en la Sección 2 de este capítulo se explican algunos pasos para solucionar los problemas. Flujo de trabajo del experimento de ejemplo A continuación, se muestra el flujo de trabajo para analizar el experimento de ejemplo que se incluye en esta guía de introducción. Experimento de CT comparativos (∆∆CT) Inicio del experimento Diseño del experimento (Capítulo 6) Preparación de las reacciones (Capítulo 7) Realización del experimento (Capítulo 8) Análisis del experimento (Capítulo 9) Sección 1. Revisión de los resultados: 1. Analice. 2. Revise la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica) o la tabla de pocillos. 3. Revise la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación). 4. Presente los datos. Sección 2. Solución de problemas: 1. Revise las opciones de análisis; ajuste la línea basal y el umbral. 2. Revise la pantalla QC Summary (Resumen QC). 3. Omita pocillos. 4. Revise la pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente). 5. Revise la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos). Fin del experimento Notas 174 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Sección 9.1 Revisión de los resultados Sección 9.1 Revisión de los resultados Esta sección cubre los siguientes temas: ■ Análisis del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176 ■ Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos . . . . . . . . . . . . 182 ■ Revisión de la gráfica de amplificación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185 ■ Presentación de los datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191 Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 175 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Análisis del experimento Análisis del experimento El software StepOne analiza el experimento y muestra los resultados en las pantallas de análisis (por ejemplo, en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación), QC Summary (Resumen QC), etc.) Acerca del experimento de ejemplo Para el experimento de CT comparativos de ejemplo, utilice el archivo de datos que se instala con el software StepOne. Este archivo de datos se ha creado con los mismos parámetros de diseño que se indican en el Capítulo 6 y luego se ha procesado y analizado en un instrumento StepOne™. Encontrará el archivo de datos del experimento de ejemplo en su ordenador: <unidad>:\Applied Biosystems\StepOne System\experiments\examples donde <unidad> es la unidad del disco duro del ordenador en la que está instalado el software de StepOne. La unidad de instalación predeterminada del software es la unidad C. Análisis del experimento de ejemplo 1. Si aún no se está ejecutando el software StepOne, haga doble clic en (acceso directo al software StepOne) o seleccione Start (Inicio)All Programs (Todos los programas)Applied BiosystemsStepOneStepOne v2.0. 2. En la pantalla Home (Inicio), haga clic en Open (Abrir). 3. En el cuadro de diálogo Open (Abrir), desplácese hasta la carpeta examples (ejemplos). 4. Haga doble clic en Comparative CT Example (Ejemplo de CT comparativos) para abrir el archivo de datos del experimento de ejemplo. Notas 176 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Análisis del experimento 2 3 4 5. Haga clic en Analyze (Analizar). El software analiza los datos utilizando las opciones de análisis predeterminadas. 5 6. Consulte “Elementos del software” más adelante y “Consejos de desplazamiento” en la página 179 para obtener información acerca de cómo desplazarse por las pantallas de análisis. Directrices Cuando analice su propio experimento de CT comparativos: • Inmediatamente después de una reacción, el software StepOne analiza automáticamente los datos utilizando las opciones de análisis predeterminadas y, a continuación, muestra la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) en el ordenador. • Para volver a analizar los datos, seleccione todos los pocillos de la disposición de la placa y, a continuación, haga clic en Analyze (Analizar). Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 177 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Análisis del experimento Elementos del software A continuación, se ilustran los elementos del software StepOne de las pantallas de análisis. 1. Barra de menús: muestra los menús disponibles en el software: • File (Archivo) • Edit (Edición) • Instrument (Instrumento) • Analysis (Análisis) • Tools (Herramientas) • Help (Ayuda) 2. Barra de herramientas: muestra las herramientas disponibles en el software: • New Experiment (Experimento nuevo) • Open (Abrir) • Save (Guardar) • Close (Cerrar) • Send Experiment to Instrument (Enviar experimento al instrumento) • Download Experiment from Instrument (Descargar experimento del instrumento) • Export (Exportar) • Print Report (Imprimir informe) 3. Cabecera del experimento: indica el nombre del experimento, el tipo de experimento y los reactivos del experimento abierto. 4. Panel de menús del experimento: incluye vínculos a las siguientes pantallas del software: • Pantallas de configuración • Pantallas del perfil de reacción • Pantallas de análisis: –Amplification Plot (Gráfica de amplificación) –Gene Expression (Expresión génica) –Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente) –Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos) –QC Summary (Resumen QC) –Multiple Plots View (Vista de múltiples gráficas) 5. Panel de gráficas: muestra la pantalla de análisis seleccionada para el experimento abierto. 6. Fichas de visualización: muestra la disposición de la placa o la tabla de pocillos del experimento abierto. Notas 178 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Análisis del experimento 7. Fichas del experimento: muestra una ficha por cada experimento abierto. 1 2 3 6 4 7 5 Consejos de desplazamiento Cómo seleccionar pocillos Para ver pocillos específicos en las pantallas de análisis, seleccione los pocillos en la ficha View Plate Layout (Ver disposición de placa) de la siguiente manera: 1. Para seleccionar pocillos de un tipo específico, utilice los menús desplegables Select Wells With (Seleccionar pocillos con): seleccione Sample (Muestra), Target (Diana) o Task (Tarea) y, a continuación, seleccione el nombre de la muestra, el gen diana o la tarea. 2. Para seleccionar un solo pocillo, haga clic en él en la disposición de la placa. 3. Para seleccionar varios pocillos, haga clic y arrastre el ratón por encima de los pocillos deseados, pulse CTRL+clic, o pulse Mayús+clic en la disposición de la placa. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 179 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Análisis del experimento 4. Para seleccionar los 48 pocillos, haga clic en la esquina superior izquierda de la disposición de la placa. 1 4 Cómo ver múltiples gráficas Utilice la vista Multiple Plots (Múltiples gráficas) para ver simultáneamente hasta cuatro gráficas. Para desplazarse por la vista Multiple Plots (Múltiples gráficas): 1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis (Análisis) Multiple Plots View (Vista de múltiples gráficas). 2. Para ver cuatro gráficas, haga clic en gráficas en una matriz de 2 X 2). 3. Para ver dos gráficas en filas, haga clic en en dos filas). Show plots in a 2 ✕ 2 matrix (Mostrar Show plots in two rows (Ver gráficas 4. Para ver dos gráficas en columnas, haga clic en (Ver gráficas en dos columnas). Show plots in two columns Notas 180 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Análisis del experimento 5. Para ver una gráfica específica, seleccione la gráfica en el menú desplegable situado encima de la visualización de cada gráfica. 5 2 3 4 Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 181 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos La pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica) muestra los resultados de los cálculos de cuantificación relativa a través del perfil de expresión génica. Hay disponibles dos gráficas: • RQ vs Target (Cuantificación relativa vs diana): agrupa los valores de cuantificación relativa (RQ) por diana. Se traza cada muestra para cada gen diana. • RQ vs Sample (Cuantificación relativa vs muestra): agrupa los valores de cuantificación relativa (RQ) por muestra. Se traza cada gen diana para cada muestra. Cada gráfica se puede ver de las siguientes formas: lineal, log10, Ln, log2. En la tabla de pocillos, se muestran datos de cada pocillo de la placa de reacción, incluidos: • El nombre de la muestra, el nombre de el gen diana, la tarea y los fluorocromos • El ciclo umbral calculado (CT), la fluorescencia normalizada (Rn) y los valores de cantidades • Avisos Acerca del experimento de ejemplo Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos En el experimento de CT comparativos de ejemplo, se revisa: • Cada gen diana de la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica) para el nivel de expresión (o cambio en número de veces de la expresión) de la muestra de gen diana en relación con la muestra de referencia. • La tabla de pocillos para evaluar la precisión de los grupos de réplicas. 1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis (Análisis) Gene Expression (Expresión génica). Nota: Si en la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica) no aparece ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar). 2. En la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica): a. En el menú desplegable Plot Type (Tipo de gráfica), seleccione RQ vs Sample (Cuantificación relativa vs Muestra). b. En el menú desplegable Graph Type (Tipo de gráfica), seleccione Log10. c. En el menú desplegable Orientation (Orientación), seleccione Vertical Bars (Barras verticales). Notas 182 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos d. Haga clic en Show/Hide the plot legend (Mostrar/ocultar la leyenda de la gráfica). En el experimento de ejemplo, se muestra el nivel de expresión de TP53 en el hígado y el riñón en relación con su nivel de expresión en la muestra de referencia (cerebro). Dado que la muestra de referencia se compara consigo misma, el nivel de expresión es 1. Si el resultado se muestra en el tipo de gráfico Log10, el nivel de expresión de la muestra de referencia aparece como 0 en el gráfico (log10 de 1=0). 2a 2b 2c 2d 3. Revise la tabla de pocillos: a. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis (Análisis) Amplification Plot (Gráfica de amplificación) y, a continuación, seleccione la ficha View Well Table (Ver tabla de pocillos). b. En el menú desplegable Group By (Agrupar por), seleccione Replicate (Réplica). c. Fíjese en la columna CT SD para evaluar la precisión de los grupos de réplicas. En el experimento de ejemplo, no hay ningún valor atípico. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 183 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos 3a 3b 3c Nota: Para mostrar u ocultar columnas en la tabla de pocillos, marque/desmarque el nombre de columna en el menú desplegable Show in Table (Mostrar en tabla). Directrices de análisis Para obtener más información Cuando analice su propio experimento de CT comparativos, busque: • Diferencias en la expresión génica (como un cambio en número de veces de la expresión) en relación con la muestra de referencia. • Desviación estándar en los grupos de réplicas (valores CT SD). Si es preciso, omita los valores atípicos (consulte “Omisión de pocillos para el análisis” en la página 197). Para obtener más información acerca de la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica) o la tabla de pocillos, acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. Notas 184 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Revisión de la gráfica de amplificación Revisión de la gráfica de amplificación En la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación), se muestra la amplificación de todas las muestras de los pocillos seleccionados. Hay disponibles tres gráficas: • ∆Rn vs Cycle (∆Rn vs ciclo): ∆Rn es la variación de la señal de fluorescencia normalizada generada en cada ciclo de la reacción de PCR y son los datos a partir de los cuales se calcula CT. En esta gráfica, ∆Rn se muestra en función del número de ciclo. La gráfica sirve para identificar y examinar las amplificaciones irregulares y para ver los valores del umbral y línea basal de la reacción. • Rn vs Cycle (Rn vs ciclo): Rn es la fluorescencia de fluorocromo del notificador normalizada. En esta gráfica, Rn se muestra en función del número de ciclo. La gráfica sirve para identificar y examinar las amplificaciones irregulares. • CT vs Well (CT vs pocillo): el ciclo umbral (CT) es el número de ciclo de PCR en el cual el nivel de fluorescencia corta el umbral. En esta gráfica, CT se muestra en función de la posición del pocillo. La gráfica sirve para localizar amplificaciones con valores atípicos. Cada gráfica se puede ver de las siguientes formas: lineal o log10. Acerca del experimento de ejemplo Revisión de la gráfica de amplificación En el experimento de CT comparativos de ejemplo, hay que revisar cada gen diana en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) para buscar: • Valores de umbral y línea basal correctos • Valores atípicos 1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis (Análisis) Amplification Plot (Gráfica de amplificación). Nota: Si en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) no aparece ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar). Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 185 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Revisión de la gráfica de amplificación 2. Observe los pocillos de GAPDH en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación): a. Haga clic en la ficha View Plate Layout (Ver disposición de placa). b. En los menús desplegables Select Wells With (Seleccionar pocillos con), seleccione Target (Diana) y, a continuación, GAPDH. 2a 2b 3. En la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación): a. En el menú desplegable Plot Type (Tipo de gráfica), seleccione ∆Rn vs Cycle (∆Rn vs ciclo). b. En el menú desplegable Color Plot By (Colorear gráfica por), seleccione Well (Pocillo). c. Haga clic en Show/Hide the plot legend (Mostrar/ocultar la leyenda de la gráfica). Notas 186 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Revisión de la gráfica de amplificación 4. Observe los valores de la línea basal: a. En el menú desplegable Graph Type (Tipo de gráfica), seleccione Linear (Lineal). b. Active la casilla de verificación Baseline (Línea basal) para ver los ciclos inicial y final de la línea basal. c. Compruebe que la línea basal está ajustada correctamente. En el experimento del ejemplo, la línea basal termina antes de que se inicie la amplificación. 3a 4a 3b 3c 4b Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 187 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Revisión de la gráfica de amplificación 5. Observe los valores de umbral: a. En el menú desplegable Graph Type (Tipo de gráfica), seleccione Log (Registro). b. En el menú desplegable Target (Diana), seleccione GAPDH. c. Active la casilla de verificación Threshold (Umbral) para ver el umbral. d. Compruebe que el umbral está situado correctamente. En el experimento de ejemplo, el umbral está en la fase exponencial. 5a 5b 5c Notas 188 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Revisión de la gráfica de amplificación 6. Busque cualquier valor atípico: a. En el menú desplegable Plot Type (Tipo de gráfica), seleccione CT vs Well (CT vs pocillo). b. Busque pocillos fuera de la curva de amplificación. En el experimento de ejemplo, no hay ningún valor atípico para GAPDH. 6a 7. Repita los pasos 2 a 6 para los pocillos de TP53. En el experimento de ejemplo, no hay ningún valor atípico para TP53. Directrices de análisis Cuando analice su propio experimento de CT comparativos, busque: • Los valores de línea basal y umbral correctos: el software StepOne calcula automáticamente los valores de línea basal y umbral dando por hecho que los datos tienen una gráfica de amplificación típica. Una gráfica de amplificación típica tiene: a. Una fase de meseta o plateau b. Una fase lineal c. Una fase exponencial (geométrica) d. Un determinado ruido de fondo e. Una línea basal Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 189 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Revisión de la gráfica de amplificación a b Umbral c ∆Rn d Ciclo e ¡IMPORTANTE! Los errores en el experimento (por ejemplo, errores de contaminación o pipeteo) pueden producir curvas de amplificación atípicas que pueden derivar a cálculos incorrectos de los valores de línea basal y umbral por parte del software StepOne. Por lo tanto, Applied Biosystems recomienda examinar la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) y revisar los valores de línea basal y umbral asignados a cada pocillo después del análisis. • Valores atípicos Si el experimento no cumple las directrices anteriores, solucione los problemas de la siguiente forma: • Ajuste manualmente la línea basal y/o el umbral (consulte “Revisión de las opciones de análisis” en la página 194). O • Omita pocillos (consulte “Omisión de pocillos para el análisis” en la página 197). Para obtener más información Para obtener más información acerca de la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. Notas 190 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Presentación de los datos Presentación de los datos Hay distintas formas de presentar los datos del experimento: • • • • • • Guardando la gráfica como un archivo de imagen Imprimiendo la gráfica Imprimiendo la disposición de la placa Creando diapositivas Imprimiendo un informe Exportando datos Para obtener más información acerca de estos procedimientos, acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 191 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Presentación de los datos Notas 192 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Sección 9.2 Solución de problemas Sección 9.2 Solución de problemas Esta sección cubre los siguientes temas: ■ Revisión de las opciones de análisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194 ■ Revisión del resumen QC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196 ■ Omisión de pocillos para el análisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197 ■ Revisión de la gráfica multicomponente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200 ■ Revisión de la gráfica de datos brutos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203 Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 193 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Revisión de las opciones de análisis Revisión de las opciones de análisis El cuadro de diálogo Analysis Settings (Opciones de análisis) muestra las opciones de análisis del ciclo umbral (CT), los avisos, la cuantificación relativa y las opciones avanzadas. Si las opciones de análisis predeterminadas del software StepOne no son adecuadas para el experimento, puede cambiarlas en el cuadro de diálogo Analysis Settings (Opciones de análisis) y, a continuación, volver a analizar el experimento. Acerca del experimento de ejemplo Revisión de las opciones de análisis En el experimento de CT comparativos de ejemplo, se utilizan las opciones de análisis predeterminadas sin ningún cambio. 1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis (Análisis). 2. Haga clic en Analysis Settings (Opciones de análisis) para abrir el cuadro de diálogo Analysis Settings (Opciones de análisis). 3. En el experimento de ejemplo, se utilizan opciones de análisis para cada ficha: • CT Settings (Opciones de CT) • Flag Settings (Opciones de avisos) • Opciones de cuantificación relativa • Advanced Settings (Opciones avanzadas) Notas 194 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Revisión de las opciones de análisis Directrices de análisis A menos que ya haya determinado cuál son las opciones óptimas para el experimento, utilice las opciones de análisis predeterminadas en el software StepOne. Si las opciones predeterminadas no son adecuadas para el experimento, puede cambiar: • CT Settings (Opciones de CT): utilice esta ficha para ajustar manualmente el umbral y la línea basal. Si ajusta manualmente el umbral y la línea basal, Applied Biosystems recomienda lo siguiente: Opción Umbral Recomendación Introduzca un valor para el umbral de manera que: • Esté por encima del ruido de fondo. • Esté por debajo de las fases de meseta o plateau y fase lineal de la curva de amplificación. • Esté dentro de la fase exponencial de la curva de amplificación. Línea basal Seleccione los valores Start Cycle (Ciclo inicial) y End Cycle (Ciclo final) antes de que comience la amplificación. • Flag Settings (Opciones de avisos): utilice esta ficha para: – Ajustar la sensibilidad para que se marquen más o menos pocillos. – Cambiar los parámetros de los avisos que aplica el software StepOne. • Relative Quantitation Settings (Opciones de cuantificación relativa): utilice esta ficha para: – Cambiar la muestra de referencia y/o el control endógeno. – Seleccionar el algoritmo que se debe utilizar para determinar los valores mínimos y máximos de RQ (nivel de confianza o desviaciones estándar). • Advanced Settings (Opciones avanzadas): utilice esta ficha para cambiar las opciones de línea basal pocillo a pocillo. Para obtener más información Para obtener más información acerca de las opciones de análisis, acceda al software StepOne pulsando F1 cuando se abra el cuadro de diálogo Analysis Settings (Opciones de análisis). Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 195 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Revisión del resumen QC Revisión del resumen QC La pantalla QC Summary (Resumen QC) muestra una lista de avisos del software StepOne, e incluye la frecuencia y ubicación de los mismos en el experimento abierto. Acerca del experimento de ejemplo Revisión del resumen QC En el experimento de CT comparativos de ejemplo, hay que revisar la pantalla QC Summary (Resumen QC) para saber si los datos del experimento han desencadenado algún aviso. En el experimento de ejemplo, no se ha desencadenado ningún aviso. 1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis (Análisis) QC Summary (Resumen QC). Nota: Si en la pantalla QC Summary (Resumen QC) no aparece ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar). 2. Revise el resumen de avisos. En el experimento de ejemplo, hay 0 pocillos marcados. 3. En la tabla Flag Details (Detalles de aviso), observe las columnas Frequency (Frecuencia) y Wells (Pocillos) para determinar qué avisos aparecen en el experimento. En el experimento de ejemplo, en la columna Frequency (Frecuencia) se muestra 0 en todas las columnas. Nota: Un valor 0 en la columna Frequency (Frecuencia) indica que el aviso no aparece en el experimento. 4. (Opcional) Haga clic en cada fila de avisos para ver información detallada acerca del aviso. 2 3 4 Notas 196 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Omisión de pocillos para el análisis Posibles avisos En los experimentos de CT comparativos, los datos del experimento pueden desencadenar los avisos que se indican a continuación. Si en el experimento no aparece un aviso, su frecuencia será 0. Si la frecuencia es >0, eso significa que el aviso aparece en algún lugar del experimento. La posición del pocillo se indica en la columna Wells (Pocillos). Aviso Directrices de análisis Para obtener más información Descripción AMPNC Amplificación en control negativo BADROX Señal de referencia pasiva incorrecta BLFAIL Error del algoritmo de línea basal CTFAIL Error del algoritmo CT EXPFAIL Error del algoritmo exponencial HIGHSD Desviación estándar alta en el grupo de réplicas NOAMP No hay amplificación NOISE Ruido mayor que otros pocillos en la placa NOSIGNAL No hay señal en el pocillo OFFSCALE La fluorescencia está fuera de la escala OUTLIERRG Valor atípico en el grupo de réplicas SPIKE Picos de ruido THOLDFAIL Error en el algoritmo del umbral Cuando analice su propio experimento de CT comparativos: • Haga clic en cada aviso de la tabla Flag Details (Detalles de avisos) con una frecuencia >0 para ver información detallada acerca del aviso. Si es necesario, haga clic en el vínculo de solución de problemas para saber cómo corregir el aviso. • Puede cambiar las opciones de los avisos: – Ajustar la sensibilidad para que se marquen más o menos pocillos. – Cambiar los parámetros de los avisos que aplica el software StepOne. Para obtener más información acerca de la pantalla QC Summary (Resumen QC) o de las opciones de avisos, acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. Omisión de pocillos para el análisis Los errores de los experimentos pueden causar que algunos pocillos se amplifiquen de manera insuficiente o no se amplifiquen. Estos pocillos suelen producir valores CT que difieren significativamente de los valores medios de los pocillos de réplicas asociadas. Si se incluyen en los cálculos, estos valores atípicos pueden dar lugar a mediciones erróneas; para garantizar la precisión, omita los valores atípicos del análisis. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 197 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Omisión de pocillos para el análisis Acerca del experimento de ejemplo En el experimento de CT comparativos de ejemplo, no hay valores atípicos; no es necesario omitir ningún pocillo del análisis. Omisión de pocillos 1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis (Análisis) Amplification Plot (Gráfica de amplificación). Nota: Si en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) no aparece ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar). 2. En la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación), seleccione CT vs Well (CT vs pocillo) en el menú desplegable Plot Type (Tipo de gráfica). 3. Seleccione la ficha View Well Table (Ver tabla de pocillos). Notas 198 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Omisión de pocillos para el análisis 4. En la tabla de pocillos: a. En el menú desplegable Group By (Agrupar por), seleccione Replicate (Réplica). b. Fíjese si en el grupo de réplicas hay algún valor atípico (asegúrese de que están marcados con un aviso). En el experimento de ejemplo, no hay ningún valor atípico. 3 4a Directrices de análisis Cuando analice su propio experimento de CT comparativos, fíjese bien si en los grupos de réplicas hay valores atípicos. Si es necesario, quite manualmente los valores atípicos con la tabla de pocillos: 1. En el panel Experiment Menu (Menú de experimento), seleccione Analysis (Análisis) Amplification Plot (Gráfica de amplificación). Nota: Si en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) no aparece ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar). 2. En la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación), seleccione CT vs Well (CT vs pocillo) en el menú desplegable Plot Type (Tipo de gráfica). 3. Seleccione la ficha View Well Table (Ver tabla de pocillos). Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 199 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Revisión de la gráfica multicomponente 4. En la tabla de pocillos: a. En el menú desplegable Group By (Agrupar por), seleccione Replicate (Réplica). b. Fíjese si en el grupo de réplicas hay algún valor atípico (asegúrese de que están marcados). c. Active la casilla de verificación Omit (Omitir) que hay junto a los pocillos con valores atípicos. 5. Haga clic en Analyze (Analizar) para volver a analizar los datos del experimento sin los pocillos con valores atípicos. Para obtener más información Para obtener más información acerca de la omisión de pocillos para el análisis, acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. En la ayuda, busque los temas relacionados con la omisión de pocillos: 1. Haga clic en la ficha Search (Buscar). 2. Escriba omit well (omisión de pocillos). 3. Haga clic en List Topics (Ver temas). 4. Haga doble clic en los temas que desee leer. Revisión de la gráfica multicomponente La pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente) muestra la contribución espectral completa de cada fluorocromo de un pocillo seleccionado durante el tiempo que dura el proceso de PCR. Acerca del experimento de ejemplo Revisión de la gráfica multicomponente En el experimento de CT comparativos de ejemplo, en la pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente) hay que fijarse en: • • • • Fluorocromo ROX™ (referencia pasiva) Fluorocromo FAM™ (notificador) Picos, depresiones y/o cambios repentinos Amplificación en pocillos de control negativo 1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis (Análisis) Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente). Nota: Si en la pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente) no aparece ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar). Notas 200 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Revisión de la gráfica multicomponente 2. Muestre un solo pocillo a la vez en la pantalla Multicomponente Plot (Gráfica multicomponente): a. Haga clic en la ficha View Plate Layout (Ver disposición de placa). b. Seleccione un pocillo en la disposición de la placa; el pocillo se muestra en la pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente). 3. En el menú desplegable Plot Color (Color de gráfica), seleccione Dye (Fluorocromo). 4. Haga clic en gráfica). Show/Hide the plot legend (Mostrar/ocultar la leyenda de la 5. Compruebe la señal del fluorocromo FAM. En el experimento de ejemplo, la señal del fluorocromo FAM aumenta a lo largo de la reacción de PCR, lo que indica que la amplificación es normal. 6. Compruebe la señal del fluorocromo ROX. En el experimento de ejemplo, la señal del fluorocromo ROX permanece constante a lo largo de la reacción de PCR, lo que indica que los datos son típicos. 3 4 2a 2b 5 6 Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 201 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Revisión de la gráfica multicomponente 7. Seleccione de uno en uno los pocillos de control negativo y compruebe la amplificación. En el experimento de ejemplo, no hay amplificación en los pocillos de control negativo. 7 Directrices de análisis Para obtener más información Cuando analice su propio experimento de CT comparativos, busque: • Referencia pasiva: el nivel de fluorescencia del fluorocromo de referencia pasiva debe permanecer relativamente constante a lo largo de la reacción de PCR. • Fluorocromo del notificador: el nivel de fluorescencia del fluorocromo del notificador debería indicar una región plana que se corresponde con la línea basal, seguida por un rápido aumento en la fluorescencia a medida que la amplificación continúa. • Cualquier irregularidad de la señal: no debería haber ningún pico, depresión ni cambio súbito en la señal fluorescente. • Pocillos de control negativo: no debería haber ninguna amplificación en los pocillos de control negativo. Para obtener más información acerca de la pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. Notas 202 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Revisión de la gráfica de datos brutos Revisión de la gráfica de datos brutos En la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos), se muestra la señal de fluorescencia bruta (no normalizada) para cada filtro óptico de los pocillos seleccionados durante cada ciclo de la PCR a tiempo real. Acerca del experimento de ejemplo Revisión de la gráfica de datos brutos En el experimento de CT comparativos de ejemplo, hay que revisar la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos) para comprobar si hay un aumento estable de la señal (que no hay ninguna depresión ni cambio abrupto) a partir del filtro apropiado. 1. En el panel Experiment Menu (Menú de experimento), seleccione Analysis (Análisis) Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos). Nota: Si en la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos) no aparece ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar). 2. Para ver los 48 pocillos en la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos), haga clic en la esquina superior izquierda de la disposición de la placa en la ficha View Plate Layout (Ver disposición de placa). 3. Haga clic en gráfica). Show/Hide the plot legend (Mostrar/ocultar la leyenda de la 4. Haga clic y arrastre el puntero Show Cycle (Mostrar ciclo) desde el ciclo 1 al 40. En el experimento de ejemplo, hay un aumento estable en la señal a partir del filtro 1, que se corresponde con el filtro del fluorocromo FAM™. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 203 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos Revisión de la gráfica de datos brutos 3 4 Los filtros del sistema StepOne™ son: Filtro 1 Fluorocromo Fluorocromo FAM™ Fluorocromo SYBR® Green 2 Fluorocromo JOE™ Fluorocromo VIC® 3 Directrices de análisis Fluorocromo ROX™ Cuando analice su propio experimento de CT comparativos, fíjese en lo siguiente para cada filtro: • Crecimiento característico de la señal • Depresiones o cambios abruptos Para obtener más información Para obtener más información acerca de la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. Notas 204 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Apéndice A Flujos de trabajo alternativos para el experimento Este apéndice cubre los siguientes temas: ■ Flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) . . . . . . . . . . . . . . . . 206 ■ Flujo de trabajo QuickStart (Inicio rápido) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207 ■ Flujo de trabajo de molde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 208 ■ Flujo de trabajo de exportación/importación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209 Nota: Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o seleccionando Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne). Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 205 Apéndice A Flujos de trabajo alternativos para el experimento Flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) Flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) Si crea un experimento de curva estándar relativa o CT comparativos (∆∆CT) con el flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) del software StepOne™, puede configurar el experimento de acuerdo con su criterio. 1. Configure un nuevo experimento: a. Haga doble clic en (acceso directo al software StepOne) o seleccione Start (Inicio)All Programs (Todos los programas)Applied Biosystems StepOneStepOne v2.0. b. En la columna Set Up (Configurar), haga clic en Advanced Setup (Configuración avanzada). c. En el panel de navegación, haga clic en Experiment Properties (Propiedades del experimento) (predeterminado) y, a continuación, escriba las propiedades del experimento de ejemplo. d. En el panel de navegación, haga clic en Plate Setup (Configuración de placa) y, a continuación, asigne los genes diana, los estándares (sólo en experimentos de curva estándar relativa) y las muestras. e. En el panel de navegación, haga clic en Run Method (Protocolo de termociclado) y, a continuación, escriba el volumen de la reacción y cambie el perfil térmico según convenga f. En el panel de navegación, haga clic en Reaction Setup (Configuración de reacción) y, a continuación, revise los volúmenes calculados para las reacciones de PCR, la dilución seriada (sólo en experimentos de curva estándar relativa) y las diluciones de las muestras. Edítelos si es preciso. g. (Opcional) En el panel de navegación, haga clic en Materials List (Lista de materiales) y, a continuación, seleccione y compre los materiales que necesite para el experimento. 2. Prepare las reacciones de PCR: a. Prepare el molde. b. Prepare las diluciones de las muestras. c. Prepare la dilución seriada (sólo en experimentos de curva estándar relativa). d. Prepare la mezcla de reacción. e. Prepare la placa de reacción. Notas 206 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Apéndice A Flujos de trabajo alternativos para el experimento Flujo de trabajo QuickStart (Inicio rápido) 3. Realice el experimento: a. Cargue el instrumento. b. Inicie el proceso c. Descargue el instrumento. 4. Analice los datos. Flujo de trabajo QuickStart (Inicio rápido) Si crea un experimento de curva estándar relativa o CT comparativos con el flujo de trabajo QuickStart (Inicio rápido), puede procesar las reacciones en el instrumento sin ninguna información sobre la configuración de la placa. 1. Prepare las reacciones de PCR: a. Prepare el molde. b. Prepare las diluciones de las muestras. c. Prepare la dilución seriada (sólo en experimentos de curva estándar relativa). d. Prepare la mezcla de reacción. e. Prepare la placa de reacción. 2. Inicie rápidamente el experimento: a. Haga doble clic en (acceso directo al software StepOne) o seleccione Start (Inicio)All Programs (Todos los programas)Applied BiosystemsStepOneStepOne v2.0. b. En la pantalla Run (Proceso), haga clic en QuickStart (Inicio rápido). c. Seleccione la ficha Experiment Properties (Propiedades del experimento) y, a continuación, escriba las propiedades del experimento. d. Seleccione la ficha Run Method (Protocolo de termociclado) y, a continuación, escriba el volumen de la reacción y cambie el perfil térmico según convenga 3. Realice el experimento: a. Cargue el instrumento. b. Inicie el proceso. c. Descargue el instrumento. 4. Complete la configuración de la placa. 5. Analice los datos. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 207 Apéndice A Flujos de trabajo alternativos para el experimento Flujo de trabajo de molde Flujo de trabajo de molde Si crea un molde para un experimento de curva estándar relativa o CT comparativos, puede configurar muchos experimentos con la misma información de configuración. 1. Cree un molde: a. Haga doble clic en (acceso directo al software StepOne) o seleccione Start (Inicio)All Programs (Todos los programas)Applied Biosystems StepOneStepOne v2.0. b. Abra un experimento existente o cree uno nuevo tal y como se describe en el Capítulo 2 o Capítulo 6. c. Seleccione File (Archivo)Save As Template (Guardar como molde). d. En el cuadro de diálogo Save As Template (Guardar como molde), escriba un nombre de archivo y, a continuación, haga clic en Save (Guardar) para guardar el molde. e. Haga clic en Close (Cerrar). 2. Cree un experimento utilizando el molde: a. Si aún no está en la pantalla Home (Inicio), haga clic en Home (Inicio). b. En la columna Set Up (Configurar), haga clic en Template (Molde). c. En el cuadro de diálogo Open (Abrir), seleccione el molde que ha creado en el paso 1. d. Modifique el experimento con las herramientas del flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada). e. Haga clic en Save (Guardar), escriba un nombre de archivo y, a continuación, haga clic en Save (Guardar) para guardar el experimento. 3. Prepare las reacciones de PCR: a. Prepare el molde. b. Prepare las diluciones de las muestras. c. Prepare la dilución seriada (sólo en experimentos de curva estándar relativa). d. Prepare la mezcla de reacción. e. Prepare la placa de reacción. Notas 208 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Apéndice A Flujos de trabajo alternativos para el experimento Flujo de trabajo de exportación/importación 4. Realice el experimento: a. Cargue el instrumento. b. Inicie el proceso. c. Descargue el instrumento. 5. Analice los datos. Flujo de trabajo de exportación/importación Si crea un experimento de curva estándar relativa o CT comparativos con el flujo de trabajo de exportación/importación, puede configurar un experimento nuevo con los datos exportados desde otros experimentos. 1. Haga doble clic en (acceso directo al software StepOne) o seleccione Start (Inicio)All Programs (Todos los programas)Applied Biosystems StepOneStepOne v2.0. 2. Abra un experimento existente o cree uno nuevo tal y como se describe en el Capítulo 2 o el Capítulo 6. 3. Mientras el experimento está abierto, exporte la información de configuración: a. Seleccione File (Archivo)Export (Exportar). b. En la ficha Export Properties (Propiedades de exportación), seleccione Setup (Configuración). c. Seleccione One File (Un archivo) en el menú desplegable. d. Seleccione (*.txt) en el menú desplegable File Type (Tipo de archivo). e. Seleccione Open file(s) when export is complete (Abrir archivos cuando termine la exportación). f. Haga clic en Start Export (Iniciar exportación) y, a continuación, haga clic en Close Export Tool (Cerrar herramienta de exportación) cuando se le solicite. Notas Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 209 Apéndice A Flujos de trabajo alternativos para el experimento Flujo de trabajo de exportación/importación 4. Utilice el archivo exportado como molde y cree la configuración de placa deseada: a. Con una aplicación de hojas de cálculo (por ejemplo, el software Microsoft® Excel), abra el archivo de texto exportado. b. Sustituya los parámetros del archivo de texto según convenga Cuando haya terminado, guarde el archivo en un formato de texto delimitado por tabuladores. ¡IMPORTANTE! El archivo de texto debe tener el formato correspondiente al formato de la disposición de la placa del software StepOne. Para obtener más información acerca del formato de disposición de la placa, acceda a la ayuda haciendo clic en en la barra de herramientas o seleccionando Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne). 5. Si aún no está en la pantalla Home (Inicio), haga clic en Home (Inicio). 6. En la columna Set Up (Configurar), haga clic en (Configuración avanzada). Advanced Setup 7. Información de configuración de la importación: a. Seleccione File (Archivo)Import (Importar). b. Haga clic en Browse (Examinar), seleccione el archivo *.txt que ha creado en el paso 4 y, a continuación, haga clic en Select (Seleccionar). c. Haga clic en Start Import (Iniciar importación). 8. Prepare las reacciones de PCR: a. Prepare el molde. b. Prepare las diluciones de las muestras. c. Prepare la dilución seriada (sólo en experimentos de curva estándar relativa). d. Prepare la mezcla de reacción. e. Prepare la placa de reacción. 9. Realice el experimento: a. Cargue el instrumento. b. Inicie el proceso. c. Descargue el instrumento. 10. Analice los datos. Notas 210 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Bibliografía Kwok, S. and Higuchi, R. 1989. Avoiding false positives with PCR. Nature 339:237–238. Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F., et al. 1985. Enzymatic amplification of β-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230:1350–1354. Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 211 Bibliografía 212 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Glosario AIF Abreviatura de archivo de información de ensayo (Assay Information File). alelo Para unun gen dianaa diana determinado, cualquiera de las diferentes secuencias que aparecen en la población. amplicón Segmento de DNA amplificado durante la PCR. amplificación Etapa del protocolo de termociclado, durante el cual se produce la generación del amplicón. En los experimentos de cuantificación, los datos de fluorescencia recogidos durante la amplificación se muestran en una gráfica de amplificación y se utilizan para calcular los resultados. Si la amplificación está incluida en el proceso del instrumento StepOne™ para experimentos de genotipado o presencia/ausencia, los datos de fluorescencia recogidos durante la amplificación se muestran en una gráfica de amplificación y se pueden utilizar para solucionar problemas. apantallador Molécula unida al extremo de 3′ de las sondas TaqMan® para evitar que el notificador emita una señal de fluorescencia mientras la sonda está intacta. Con los reactivos TaqMan®, se puede utilizar un apantallador no fluorescente de unión al surco menor de la doble hélice del DNA (NFQ-MGB). Con reactivos SYBR Green, no se utiliza ningún apantallador. ¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo TAMRA™ como notificador o apantallador con el sistema StepOne™. apantallador no fluorescente de unión al surco menor de cadena de DNA (NFQ-MGB) Moléculas que están unidas al extremo de 3′ de las sondas TaqMan®. Si la sonda está intacta, el apantallador no fluorescente (NFQ) evita que el fluorocromo del notificador emita una señal de fluorescencia. Dado que el NFQ no emite ninguna fluorescencia, produce señales de fondo más bajas, lo que se deriva en una mayor precisión en la cuantificación. El ligando de unión de surco menor (MGB) aumenta la temperatura de desnaturalización (Tm) sin aumentar la longitud de la sonda. También permite el diseño de sondas más cortas. archivo de información de ensayo (AIF) Archivo de datos del CD que se incluye con cada pedido de ensayo. El nombre de archivo incluye el número del código de barras de la placa. La información del AIF se incluye en un formato delimitado por tabuladores. asistente de diseño Función del software StepOne™ que le ayuda a configurar el experimento guiándole a través de los procedimientos óptimos para comenzar el diseño del experimento. DNA de muestra (10✕) Componente de reacción que se muestra en la pantalla Reaction Setup (Configuración de la reacción). El software asume que el DNA de muestra que se añade a la mezcla de reacción está en una concentración del 10✕. Por ejemplo, si el volumen de la reacción es de 20 µL, el volumen calculado de la muestra de la reacción 1 es 2 µL. Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 213 Glosario Auto∆ Opción para aumentar o reducir la temperatura y/o el tiempo en los ciclos subsiguientes de la reacción de PCR. Cuando Auto∆ está habilitado, las opciones se indican por medio de un icono en el perfil térmico: • Auto∆ activado: • Auto∆ desactivado: biblioteca de ensayos SNP Recogida de ensayos SNP en el software StepOne™. biblioteca de genes diana Recogida de genes diana en el software StepOne™. biblioteca de muestras Recogida de las muestras en el software StepOne™. La biblioteca de muestras contiene el nombre de la muestra y el color de la muestra. calibración espacial Tipo de calibración del sistema StepOne™ en el que el sistema asigna las posiciones de los pocillos en el bloque. Los datos de la calibración espacial se utilizan para que el software pueda asociar aumentos de la fluorescencia durante una reacción con pocillos específicos de la placa de reacción. calibrador Véase muestra de referencia. cantidad En los experimentos de cuantificación, la cantidad de gen diana en las muestras. La cantidad absoluta puede referirse al número de copias, la masa, la molaridad o la carga viral. La cantidad relativa se refiere a la diferencia entre la cantidad de gen diana normalizada en la muestra y la cantidad de gen diana normalizada en la muestra de referencia. cantidad estándar Cantidad conocida de la reacción de PCR. • En los experimentos de curva estándar, la muestra de concentración conocida de gen diana. Las unidades de la cantidad estándar pueden ser la masa, el número de copias, la carga viral u otras unidades para medir la cantidad del gen diana. • En los experimentos de curvas estándar relativas, la muestra de concentración conocida en el estándar. Por ejemplo, la cantidad estándar puede referirse a la cantidad de cDNA o la cantidad de solución de partida. Las unidades no son relevantes en los experimentos de curvas estándar relativas, porque se compensan o simplifican en los cálculos. cantidad inicial Cuando se define una curva estándar o una dilución seriada, se corresponde con la cantidad mayor o menor de partida. cantidad normalizada Cantidad de gen diana dividida por la cantidad de control endógeno. cebador directo Oligonucleótido que flanquea el extremo de 5′ del gen diana. El cebador reverso y el cebador directo se utilizan juntos en las reacciones de PCR para amplificar el gen diana. cebador reverso Oligonucleótido que flanquea el extremo de 3′ del gen diana. El cebador reverso y el cebador directo se utilizan juntos en las reacciones de PCR para amplificar el gen diana. 214 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Glosario ciclo umbral (CT) Número del ciclo de la PCR en el que ∆Rn corta el umbral en la gráfica de amplificación. coeficientes de regresión Valores calculados a partir de la línea de regresión de las curvas estándar, incluido el valor R2, la pendiente y el punto de intersección y. Los valores del coeficiente de regresión se pueden utilizar para evaluar la calidad de los resultados a partir de los estándares. Véase también curva estándar. color de gen diana Color asignado a un gen diana para identificarlo en la disposición de la placa y las gráficas de análisis. Concentración de muestra diluida (10X para la mezcla de reacción) Campo del software que aparece en la ficha Sample Dilution Calculations (Cálculos de dilución de las muestras) de la pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción). En este campo, escriba la concentración de la muestra que desea utilizar para añadir a la mezcla de reacción de todas las muestras del experimento. "10✕ for Reaction Mix" (10X para la mezcla de reacción) significa que el software asume que la muestra o el componente estándar de la mezcla de reacción tiene una concentración del 10✕. Por ejemplo, si la concentración de las muestras diluidas es 50,0 ng/µL (10✕), la concentración de la muestra final de la reacción es 5 ng/µL (1✕). configuración avanzada Función del software StepOne™ que permite configurar el experimento de acuerdo con el diseño de dicho experimento. control endógeno Diana que debería tener un nivel de expresión similar en todas las muestras que se están probando. Se utiliza en experimentos de curva estándar relativa y CT comparativos (∆∆CT) para normalizar las señales de fluorescencia del gen diana que se está cuantificando. También se conoce como gen de mantenimiento. control interno positivo (IPC) En los experimentos de presencia/ausencia, un molde de DNA sintético corto que se añade a las reacciones de PCR. Se puede utilizar el IPC para distinguir los falsos negativos en las reacciones afectadas por los apantalladores de PCR, una configuración incorrecta del ensayo o un fallo del reactivo o del instrumento. control negativo (NTC) En los experimentos del sistema StepOne™, tarea asignada a los genes diana o los ensayos de SNP en los pocillos que contienen agua o tampones en lugar de un molde de las muestras. En los pocillos de control negativo, no se debería producir ninguna amplificación del gen diana. control positivo En los experimentos de genotipado, la tarea del ensayo de SNP en pocillos que contienen una muestra con un genotipo conocido. CT Abreviatura de ciclo umbral (Threshold Cycle). CT automático Opción de análisis en la que el software calcula de manera automática el umbral y la línea basal de la gráfica de amplificación. El software utiliza la línea basal y el umbral para calcular el ciclo umbral (CT). CT manual Opción de análisis en la que se introduce el valor del umbral y se selecciona si se desean utilizar cálculos de línea basal automáticos o manuales. El software utiliza el valor del umbral que se introduce y la línea basal para calcular el ciclo umbral (CT). Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 215 Glosario curva de disociación Visualización de los datos recogidos durante la fase de la curva de disociación. Los picos de la curva de disociación pueden indicar la temperatura de desnaturalización (Tm) del gen diana o pueden identificar la presencia de amplificaciones no específicas. La curva de disociación se puede ver como fluorescencia del notificador normalizado (Rn) y la temperatura o como la derivada de la fluorescencia del notificador normalizada (−Rn′) vs la temperatura. curva estándar En los experimentos de curva estándar y curva estándar relativa: • La línea con un ajuste óptimo que resulta al representar los valores CT frente a las cantidades conocidas del estándar. Véase también línea de regresión. • Conjunto de estándares que contiene una serie de cantidades conocidas. Los datos de las reacciones de la curva estándar se utilizan para generar la curva estándar. La curva estándar se define por el número de puntos de la serie, el número de réplicas estándar, la cantidad inicial y el factor de dilución. Véase también dilución seriada del estándar. delta Rn (∆Rn) Abreviatura de notificador normalizado con línea basal corregida (baseline-corrected normalized reporter). desconocidos En los experimentos de cuantificación, la tarea del gen diana en pocillos que contienen una muestra con cantidades de gen diana desconocidas. En los experimentos de genotipado, la tarea del ensayo de SNP en pocillos que contienen una muestra con un genotipo desconocido. En los experimentos de presencia/ausencia, la tarea del gen diana en pocillos que contienen una muestra en la que no se conoce la presencia del gen diana. diana La secuencia de ácido nucleico que se desea amplificar y detectar. dilución seriada En los experimentos de curvas estándar y curvas estándar relativas, conjunto de normas que contienen una serie de cantidades conocidas. La dilución seriada se prepara por medio de estándares de dilución en serie. Por ejemplo, la solución de partida estándar se utiliza para preparar el primer punto de dilución, el primer punto de dilución se utiliza para preparar el segundo punto de dilución, etc. Los volúmenes necesarios para preparar una dilución seriada se calculan mediante el número de puntos de dilución, el número de réplicas estándar, la cantidad inicial, el factor de dilución y la concentración del estándar en la solución de partida. Véase también curva estándar. disolvente Reactivo utilizado para diluir una muestra o estándar antes de añadirlo a la reacción de PCR. El disolvente puede ser agua o un tampón. disposición de placa Ilustración de la rejilla de 6 × 8 pocillos y contenido asignado a la placa de reacción. En el software, puede utilizar la disposición de la placa como una herramienta de selección para asignar el contenido de los pocillos, ver las asignaciones de los pocillos y ver los resultados. La disposición de la placa se muestra en las pantallas Design Wizard (Asistente de diseño), Advanced Setup (Configuración avanzada), de reacción y de análisis. La disposición de la placa se puede imprimir, incluir en un informe, exportar y guardar como una diapositiva para una presentación. 216 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Glosario disposición autónoma Disposición del sistema en la que el instrumento StepOne™ no está conectado a un ordenador por medio del cable amarillo del sistema StepOne™. En su lugar, se utiliza una unidad USB ( ) para transferir datos entre los componentes del sistema StepOne™. En esta disposición, el instrumento StepOne™ se controla por medio de la pantalla táctil del instrumento. disposición conectada Disposición del sistema en la que el instrumento StepOne™ está conectado directamente a un ordenador conectado por medio del cable del sistema StepOne™ amarillo. En esta disposición, el instrumento StepOne™ está controlado por medio del software StepOne™ del ordenador conectado. EFF% Véase eficiencia de amplificación (EFF%). eficiencia de amplificación (EFF%) Cálculo de la eficiencia de la amplificación de la PCR. La eficiencia de la amplificación se calcula utilizando la pendiente de la línea de regresión de la curva estándar. Una pendiente próxima al −3,3 indica una eficiencia de amplificación de la PCR óptima del 100%. Factores que afectan a la eficiencia de la amplificación: • Rango de cantidades estándar: para obtener medidas de la eficiencia más exactas y precisas, utilice un amplio rango de cantidades estándar, de 5 a 6 órdenes de magnitud (multiplicado por 105 a 106). • Número de réplicas estándar: para obtener mediciones de la eficiencia más precisas, incluya réplicas para reducir los efectos de las imprecisiones del pipeteo. • Apantalladores de la PCR: los apantalladores de la PCR en la reacción pueden reducir la eficiencia de la amplificación. ensayo En el sistema StepOne™, reacción de PCR que contiene cebadores para amplificar un gen diana y una sonda para detectar el gen diana amplificado. mezcla de ensayos Componente de reacción de PCR de los Applied Biosystems TaqMan® Gene Expression Assays y los TaqMan® SNP Genotyping Assays que consta de cebadores diseñados para amplificar un gen diana y una sonda TaqMan® diseñada para detectar la amplificación del gen diana. ensayo SNP Se utiliza en los experimentos de genotipado. Es una reacción de PCR que contiene cebadores para amplificar el SNP y dos sondas para detectar diferentes alelos. ensayos bajo pedido Los ensayos TaqMan® que se fabrican cuando se solicitan. Sólo se envían los ensayos que cumplen las especificaciones de control de calidad de la fabricación. ensayos en inventario Ensayos TaqMan® fabricados previamente, que cumplen las especificaciones de control de calidad y que se guardan en el inventario. estándar Muestra que contiene cantidades estándar conocidas. Las reacciones estándar se utilizan en experimentos de cuantificación para generar curvas estándar. Véase también curva estándar y dilución seriada del estándar. Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 217 Glosario experimento Se refiere al proceso completo de realización de una reacción con el sistema StepOne™, incluida la configuración, el proceso y el análisis. Tipos de experimentos que se pueden realizar con el sistema StepOne™: • • • • • • Cuantificación : curva estándar Cuantificación : curva estándar relativa Cuantificación: CT comparativos (∆∆CT) Curva de disociación Genotipado Presencia/ausencia experimento de punto final Experimento en el que los datos de fluorescencia que se recogen en una lectura a punto final se utilizan para calcular resultados para experimentos de genotipado o presencia/ausencia. factor de dilución Valor numérico que define la secuencia de cantidades en la curva estándar. El factor de dilución y la cantidad inicial sirven para calcular la cantidad estándar de cada punto de la curva estándar. Por ejemplo, si la curva estándar se define con un factor de dilución de 1:10 o 10, la diferencia entre 2 puntos adyacentes cualquiera en la curva se multiplica por 10. fase Componente del perfil térmico. Una fase consta de uno o varios pasos. fase cíclica Fase del perfil térmico que se repite. Si la fase cíclica se utiliza para realizar la PCR, se denomina fase de amplificación. fase de curva de disociación Fase del perfil térmico con un incremento de temperatura para generar una curva de disociación. fase de espera Fase del perfil térmico que incluye uno o varios pasos. Por ejemplo, puede añadir una fase de espera al perfil térmico para activar enzimas, para desactivar enzimas o para incubar una reacción. fluorocromo del sistema Fluorocromo fabricado por Applied Biosystems y precalibrado en el sistema StepOne™. Fluorocromos del sistema: • • • • • Fluorocromo FAM™ Fluorocromo JOE™ Fluorocromo ROX™ Fluorocromo SYBR® Green Fluorocromo VIC® ¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo TAMRA™ como notificador o apantallador con el sistema StepOne™. 218 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Glosario fluorocromo personalizado Fluorocromo que no fabrica Applied Biosystems. Puede utilizar fluorocromos personalizados para realizar experimentos de PCR a tiempo real en el sistema StepOne™. Antes de utilizar fluorocromos personalizados, realice una calibración del fluorocromo personalizado. ¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo TAMRA™ como notificador o apantallador con el sistema StepOne™. fluorocromo puro Reactivo que contiene el fluorocromo fluorescente. Los fluorocromos puros se utilizan para realizar una calibración de fluorocromo puro en el sistema StepOne™. Véase también fluorocromo del sistema. gen de mantenimiento Véase control endógeno. gráfica de amplificación Visualización de los datos recogidos durante la fase cíclica de la amplificación de la PCR. Se puede ver como: • Notificador normalizado con línea basal corregida (∆Rn) frente al ciclo • Notificador normalizado (Rn) frente al ciclo • Ciclo umbral (CT) frente al pocillo gráfica de datos brutos Visualización del incremento de la fluorescencia de los pocillos seleccionados de todos los filtros. Muestra el incremento de la fluorescencia de todos los puntos de recogida de datos de la reacción. gráfica de discriminación de alelos Visualización de los datos recogidos durante la lectura a punto final. La gráfica de discriminación de alelos es una gráfica de la señal del notificador normalizada procedente de la sonda del alelo 1 que se ha trazado a partir de la señal del notificador normalizada procedente de la sonda del alelo 2. gráfica de temperatura Visualización de temperaturas de la muestra, la cubierta del instrumento y el bloque de instrumento durante el proceso del instrumento. gráfica multicomponente Visualización de los datos recogidos durante la fase cíclica de la PCR a tiempo real. La gráfica multicomponente muestra la fluorescencia de todos los ciclos de la reacción. grupo de réplicas Conjunto de reacciones idénticas de un experimento. identificador de ensayo Valor o código asignado por Applied Biosystems a los TaqMan® Gene Expression Assays y los TaqMan® SNP Genotyping Assays. identificador refSNP Número que identifica el identificador de agrupamiento de SNP (refSNP) de referencia. Lo genera dbSNP (Single Nucleotide Polymorphism Database of Nucleotide Sequence Variation o Base de datos de polimorfismos nucleótidos únicos de variación de secuencia nucleótida). Se puede utilizar para buscar en el almacén de Applied Biosystems un Applied Biosystems SNP Genotyping Assay. También se denomina número rs. inhibidor del IPC Reactivo añadido a las reacciones de PCR para bloquear la amplificación del control positivo interno (IPC). Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 219 Glosario intersección y Coeficiente de regresión calculado a partir de la línea de regresión de la curva estándar. La intersección y indica el ciclo umbral esperado (CT) para una muestra con una cantidad igual a 1 (por ejemplo, 1 ng/µL). IPC Abreviatura de control positivo interno (Internal Positive Control). Además, en los experimentos de presencia/ausencia, es la tarea del gen diana de IPC en pocillos que contiene el molde de IPC. IPC bloqueado En los experimentos de presencia/ausencia, tarea asignada al gen diana de IPC en los pocillos que contienen un agente de bloqueo de IPC en lugar de una muestra. Véase también pocillos de IPC bloqueados por control negativo. IPC+ Llamada de presencia/ausencia cuando el control interno positivo (IPC) es correcto. lectura a punto final Se utiliza en los experimentos de genotipado y presencia/ausencia. Es la parte del proceso del instrumento que se produce después de la amplificación. En los experimentos de genotipado, los datos de fluorescencia que se recogen durante la lectura a punto final se muestran en la gráfica de discriminación de alelos y se utilizan para asignar genotipos. En los experimentos de presencia/ausencia, los datos de fluorescencia que se recogen durante la lectura a punto final se muestran en la gráfica de presencia/ausencia, y se utilizan para detectar la presencia o ausencia de la diana. lectura previa a la PCR Se utiliza en los experimentos de genotipado y presencia/ausencia. Es la parte del proceso del instrumento que se produce antes de la amplificación. Los datos de fluorescencia que se recogen durante la lectura previa a la PCR se utilizan para normalizar los datos de fluorescencia a tiempo final. línea basal En la gráfica de amplificación, línea ajustada a los niveles de fluorescencia de un rango de ciclos definido. Si se utiliza una opción de análisis de línea basal manual, Applied Biosystems recomienda seleccionar los primeros ciclos de la PCR para determinar la línea basal. línea basal automática Opción de análisis en la que el software calcula los ciclos inicial y final de la línea basal para la gráfica de amplificación. El software utiliza la línea basal y el umbral para calcular el ciclo umbral (CT). línea basal manual Opción de análisis en la que se introducen los ciclos inicial y final de la línea basal para la gráfica de amplificación. El software utiliza la línea basal y el umbral para calcular valores CT. línea de regresión En los experimentos de curva estándar y curva estándar relativa, la línea que mejor se ajusta a partir de la curva estándar. Fórmula de la línea de regresión: CT = m [registro (Cant)] + b donde m es la pendiente, b es el punto de intersección y, y Cant es la cantidad estándar. Véase también coeficientes de regresión. método CT comparativos (∆∆CT) 220 Método de cuantificación para experimentos de cuantificación. Con el método CT comparativos (∆∆CT), se utilizan los resultados de una muestra de referencia y un control endógeno para determinar cantidades relativas de un gen diana en las muestras. Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Glosario método de cuantificación En los experimentos de cuantificación, el método que se utiliza para determinar la cantidad de gen diana en las muestras. En los experimentos de cuantificación, hay tres tipos de métodos de cuantificación disponibles: curva estándar, CT comparativos (∆∆CT) y curva estándar relativa. método de curva estándar Método de cuantificación para experimentos de cuantificación. Con el método de curva estándar, los resultados de los estándares se utilizan para determinar cantidades absolutas de un gen diana en las muestras. método de la curva estándar relativa Método de cuantificación para experimentos de cuantificación. Con el método de la curva estándar relativa, se utilizan los resultados de los estándares, una muestra de referencia y un control endógeno para determinar las cantidades relativas de un gen diana en las muestras. mezcla de cebador Componente de reacción de PCR que contiene el cebador directo y el cebador reverso diseñados para amplificar el gen diana. mezcla de cebador/sonda Componente de reacción de PCR que consta de cebadores diseñados para amplificar el gen diana y una sonda TaqMan® diseñada para detectar la amplificación del gen diana. mezcla de reacción Solución que contiene todos los componentes necesarios para procesar la reacción de PCR, excepto el molde (de muestra, estándar o de control). mezcla de sondas Componente de reacción de PCR que contiene una sonda TaqMan® diseñada para detectar la amplificación del gen diana. molde Tipo de ácido nucleico que se añade a la reacción de PCR. El molde recomendado varía en función del tipo de experimento. monitorización remota Función del software que permite ver el estado de un instrumento en red, enviar experimentos al instrumento y descargar experimentos del instrumento en el ordenador. muestra El molde que se está amplificando. muestra de referencia En experimentos de curva estándar relativa y CT comparativos (∆∆CT), la muestra a la que se refieren los resultados cuantitativos relativos. También se denomina calibrador. Muestra estándar (10✕) Componente de reacción que se muestra en la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la muestra de reacción) de la pantalla Reaction Setup (Configuración de la reacción). El software asume que la muestra o el estándar que se añade a la mezcla de reacción está en una concentración del 10✕. Por ejemplo, si el volumen de la reacción es de 20 µL, el volumen calculado de la muestra o estándar de la reacción 1 es 2 µL. nombre de experimento Introducido durante la configuración del experimento, es el nombre que se utiliza para identificar el experimento. Los nombres de los experimentos no pueden superar los 100 caracteres y no pueden incluir ninguno de los siguientes caracteres: barra inclinada hacia delante (/), barra inclinada hacia atrás (\), signo mayor que (>), signo menor que (<), asterisco (*), signo de interrogación (?), comillas ("), línea vertical (|), dos puntos (:) o punto y coma (;). notificador Fluorocromo fluorescente que se utiliza para detectar la amplificación. Si se utilizan reactivos TaqMan®, el fluorocromo del notificador se une al extremo de 5′. Si se utilizan reactivos SYBR® Green, el fluorocromo del notificador es SYBR® Green. Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 221 Glosario notificador derivado (−Rn′) Se muestra en el eje y de la curva de disociación. La señal del notificador derivado es el opuesto de la primera derivada de la fluorescencia normalizada del notificador. notificador normalizado (Rn) Señal de fluorescencia que emite el fluorocromo del notificador normalizado a la señal de fluorescencia de la referencia pasiva. notificador normalizado con línea basal corregida (∆Rn) La magnitud de la señal de fluorescencia normalizada que genera el notificador durante la amplificación de la PCR. número rs Véase identificador refSNP. omitir pocillo Acción que se realiza después del análisis para omitir uno o varios pocillos de todos los análisis antes de volver a analizar los datos. pantalla táctil Visor del instrumento que se toca para controlarlo. paso Componente del perfil térmico. Los pasos se definen por la temperatura, el tiempo, la rampa y el estado de recogida de datos. En los ciclos, los pasos también se definen por medio del estado Auto∆. PCR a tiempo real Proceso de recogida de datos de fluorescencia durante la amplificación de la PCR. Los datos de la PCR a tiempo real sirven para calcular los resultados de los experimentos de cuantificación o para solucionar los problemas de los resultados de los experimentos de genotipado o presencia/ausencia. pendiente Coeficiente de regresión calculado a partir de la línea de regresión de la curva estándar. La pendiente indica la eficiencia de la amplificación de la PCR para el ensayo. Una pendiente de −3,3 indica una eficiencia de amplificación del 100%. Véase también eficiencia de amplificación (EFF%). perfil térmico Parte de un protocolo de termociclado que especifica la temperatura, el tiempo, la rampa y los puntos de recogida de datos de todos los pasos y fases del proceso del instrumento. pocillos de IPC de control negativo En los experimentos de presencia/ausencia, pocillos que contienen un molde de IPC y un tampón o agua en lugar de una muestra en la reacción de PCR. El molde de IPC es lo único que se debería amplificar en los pocillos de IPC de control negativo, porque la reacción no contiene ninguna muestra. Véase también IPC+. pocillos de IPC de control negativo bloqueado En los experimentos de presencia/ausencia, pocillos que contienen un agente de bloqueo del IPC en lugar de una muestra en la reacción de PCR. No se debería producir ninguna amplificación en los pocillos de IPC de control negativo bloqueado, porque la reacción no contiene ninguna muestra y la amplificación del IPC está bloqueada. También se denomina "sin control de amplificación” (NAC). protocolo de termociclado Definición del volumen de reacción y el perfil térmico del proceso del instrumento. punto Un estándar en una curva estándar. La cantidad estándar de cada punto de la curva estándar se calcula en base a la cantidad inicial y el factor de dilución. 222 ∆Rn = Rn (punto final) − Rn (línea basal), donde Rn = notificador normalizado. Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Glosario QuickStart (Inicio rápido) Función del sistema StepOne™ que permite realizar el experimento sin introducir la información de configuración de la placa. química Véase reactivos. rampa La velocidad a la que cambia la temperatura durante el proceso del instrumento. Excepto en el caso del paso de la curva de disociación, la rampa se define como un porcentaje. En el caso del paso de la curva de disociación, la rampa se define como un incremento de la temperatura. En el gráfico del perfil térmico, la rampa se indica por medio de una línea diagonal. reacción de la muestra/diana Combinación de la muestra y el ensayo diana en una reacción de PCR. En el asistente de diseño, cada reacción de PCR sólo puede contener una muestra y un ensayo diana. reacción del ensayo SNP/muestra Combinación de la muestra y el ensayo SNP en una reacción de PCR. Cada reacción de PCR sólo puede contener una muestra y un ensayo SNP. reactivos Los componentes de la reacción de PCR que se está utilizando para amplificar el gen diana y detectar la amplificación. Tipos de reactivos utilizados en el sistema StepOne™: • Reactivos TaqMan® • Reactivos SYBR® Green • Otros reactivos reactivos SYBR® Green Componente de reacción de PCR que consta de dos cebadores que están diseñados para amplificar el gen diana y el fluorocromo SYBR® Green para detectar DNA de doble cadena. reactivos TaqMan® Componentes de reacción de PCR que constan de cebadores diseñados para amplificar el gen diana y una sonda TaqMan® diseñada para detectar la amplificación del gen diana. rechazar pocillo Acción que realiza el software durante el análisis para quitar uno o varios pocillos de un análisis posterior si se aplica un aviso específico al pocillo. recogida de datos Proceso durante la utilización del instrumento en el que un componente del instrumento detecta datos de fluorescencia en cada pocillo de la placa de reacción. El instrumento transforma la señal en datos electrónicos y los datos se guardan en el archivo del experimento. Los puntos de recogida de datos se indican por medio de un icono en el perfil térmico: • Recogida de datos activada: • Recogida de datos desactivada: referencia pasiva Fluorocromo que produce una señal de fluorescencia. Dado que la señal de referencia pasiva debería ser uniforme en todos los posillos, se utiliza para normalizar la señal del fluorocromo del notificador para justificar las fluctuaciones de fluorescencias causadas por diferencias menores entre pocillos en concentraciones o en volumen. La normalización de la señal de referencia pasiva permite obtener datos de gran precisión. réplicas Número total de reacciones idénticas que contienen componentes idénticos y volúmenes idénticos. Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 223 Glosario retrotranscriptasa Componente de reacción de PCR que convierte el RNA en cDNA. La retrotranscriptasa se añade a la reacción de PCR para realizar un RT-PCR de 1 paso. Rn Abreviatura de notificador normalizado (Normalized Reporter). serie Véase dilución seriada. sin control de amplificación (NAC) Véase también pocillos de IPC de control negativo bloqueado. sin control de molde (NTC) Véase control negativo (NTC). SNP Abreviatura de polimorfismo de nucleótido único (Single Nucleotide Polymorphism). El SNP puede constar de una diferencia base o una indel (inserción/deleción). tarea Tipo de reacción realizada en el pocillo para el gen diana o el ensayo SNP. Tareas disponibles en los experimentos del sistema StepOne™: • • • • • • Desconocida Control negativo Estándar (experimentos de curvas estándar y curvas estándar relativas) Control positivo (experimentos de genotipado) IPC (experimentos de presencia/ausencia) IPC bloqueado (experimentos de presencia/ausencia) temperatura de desnaturalización (Tm) Punto en la curva de disociación en el que se produce un pico en los niveles de fluorescencia que sirve para indicar que el DNA de doble cadena amplificado se disocia en DNA de cadena sencilla. tipo de experimento El tipo de experimento que se realiza con el sistema StepOne™: • Curva estándar • CT comparativos (∆∆CT) • Curva estándar relativa • Curva de disociación (no disponible en el asistente de diseño) • Genotipado • Presencia/ausencia El tipo de experimento que seleccione afecta a las pantallas de configuración, perfil de reacción y análisis. Tm Abreviatura de temperatura de desnaturalización (Tm o Melting Temperature). umbral Nivel de fluorescencia por encima de la línea basal y dentro de la región de crecimiento exponencial de la gráfica de amplificación. El umbral se puede determinar automáticamente (véase CT automático) o se puede ajustar manualmente (véase CT manual). umbral del ciclo Véase ciclo umbral (CT). 224 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Glosario valor atípico Para un conjunto de datos, un punto de dato que es significativamente más pequeño o grande que los demás. valor R2 Coeficiente de regresión calculado a partir de la línea de regresión de la curva estándar. El valor R2 indica la proximidad del ajuste entre la línea de regresión de la curva estándar y los puntos de datos CT individuales de las reacciones estándar. El valor 1,00 indica un ajuste perfecto entre la línea de regresión y los puntos de datos. velocidad de la rampa Velocidad a la que se produce la rampa de temperatura durante el proceso del instrumento. Las velocidades de rampa disponibles son rápida y estándar. Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 225 Glosario 226 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Índice A ADVERTENCIA, descripción xi analizar experimento analizar 94, 176 directrices 95, 102, 107, 110, 115, 118, 119, 122, 123, 177, 184, 189, 195, 197, 199, 202, 204 flujo de trabajo 92, 174 omitir pocillos 118, 197 para obtener más información 103, 108, 110, 115, 118, 120, 122, 123, 184, 190, 195, 197, 200, 202, 204 publicar los datos 111, 191 ver opciones de análisis 114, 194 ver pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) 103, 185 ver pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión de genes) 108, 182 ver pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente) 120, 200 ver pantalla Multiple Plots (Múltiples gráficas) 99, 180 ver pantalla QC Summary (Resumen QC) 116, 196 ver pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos) 122, 203 ver pantalla Standard Curve (Curva estándar) 100 ver tabla de pocillos 108, 182 Applied Biosystems asistencia técnica x comentarios del cliente acerca de la documentación ix contacto x Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System. Véase sistema StepOne. asistencia técnica, contacto x ayuda en línea. Consulte Sistema de ayuda B biblioteca 34, 142 biblioteca Run Method (Método de proceso) 34, 142 C cargar placa de reacción 70, 170 categoría de instalación xx categoría de sobretensión (potencia) xx comentarios del cliente, acerca de los documentos de Applied Biosystems ix consejos de desplazamiento seleccionar pocillos 98, 179 ver múltiples gráficas 99, 180 consumibles 21, 130 admitidos 3 Véase también materiales necesarios. 3 control endógeno componente de experimento 5 pantalla Relative Quantification Settings (Opciones de cuantificación relativa) 32, 140 seleccionar 27, 136 control negativo, componente de experimento 5, 6 convenciones utilizadas en esta guía vii crear nuevo experimento 17, 127 D datos acerca de la recopilación de datos 2 experimento de ejemplo 9, 12, 94, 176 publicar 111, 191 transferir 87 descargar placa de reacción 87 Design Wizard (Asistente de diseño) elementos del software 127 finalizar 46, 152 pantalla Experiment Properties (Propiedades de experimento) 20, 129 pantalla Materials List (Lista de materiales) 43, 148 pantalla Methods & Materials (Métodos y materiales) 22, 131 pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción) 35, 142 pantalla Relative Quantification Settings (Opciones cuantificación relativa) 140 pantalla Relative Quantification Settings (Opciones de cuantificación relativa) 32 pantalla Run Method (Método de proceso) 33, 141 pantalla Samples (Muestras) 30, 137 pantalla Standards (Estándares) 28 pantalla Targets (Dianas) 25, 135 dianas configurar 25, 135 directrices de diseño 26, 136 dilución seriada de estándar componente de experimento 5 preparar 55 volúmenes calculados 36, 39 diluciones de muestras preparar 53, 158 volúmenes calculados 40, 53, 146, 159 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 227 Índice directrices análisis 95, 102, 107, 110, 115, 118, 119, 122, 123, 177, 184, 189, 195, 197, 199, 202, 204 diseño 21, 23, 26, 29, 32, 33, 34, 41, 45, 48, 130, 132, 136, 139, 140, 142, 147, 150, 154 eliminación de residuos químicos xix preparación 54, 58, 60, 64, 158, 160, 162, 165 proceso 72 seguridad de residuos químicos xix seguridad química xvii diseñar experimento configurar dianas 25, 135 configurar estándares 28 configurar método de proceso 33, 141 configurar muestras 30, 137 configurar opciones cuantificación relativa 140 configurar opciones de cuantificación relativa 32 crear nuevo 17, 127 definir métodos y materiales 22, 131 definir propiedades del experimento 20, 129 directrices 21, 23, 26, 29, 32, 33, 34, 41, 45, 48, 130, 132, 136, 139, 140, 142, 147, 150, 154 elementos del software 127 finalizar flujo de trabajo del asistente de diseño 46, 152 flujo de trabajo 16, 126 para obtener más información 22, 24, 27, 30, 32, 33, 34, 42, 45, 48, 131, 134, 137, 139, 141, 142, 148, 151, 154 revisar configuración de reacción 35, 142 solicitar materiales 43, 148 disposición conectada inicio 73 supervisión 77 transferir datos 88 distribución autónoma inicio 74 supervisión 86 supervisión remota 83 transferencia de datos remota 88 transferir datos 89 documentación, relacionada viii componente de experimento 5 configurar 28 diluir 55 directrices de diseño 29 EMC xxiii reacciones estándar 62 seguridad xxiii estándares de compatibilidad electromagnética. ConsulteEstándares EMC estándares de seguridad xxiii estándares EMC xxiii etiquetas de seguridad, en instrumentos xiv experimento de CT comparativo de ejemplo analizar 174 datos 12 descripción 11 diseño 126 flujo de trabajo 13 nombre 129 preparar 156 proceso 168 experimento de curva estándar relativa de ejemplo analizar 92 datos 12 descripción 10 diseño 16 flujo de trabajo 13 nombre 20 preparar 50 proceso 68 experimento de DDCT. Véase experimento de CT comparativo experimentos de CT comparativo acerca de 5 comparados con experimentos de curva estándar relativa 6 experimentos de curva estándar relativa acerca de 4 comparados con experimentos de CT comparativo 6 E flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) 9, 10, 24, 48, 64, 133, 154, 165, 206 flujo de trabajo de exportación/importación 10, 209 flujo de trabajo de inicio rápido 10, 207 flujo de trabajo de plantilla 10, 208 flujos de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) 206 experimento de ejemplo 13 Exportación/importación 10, 209 Plantilla 10, 208 QuickStart (Inicio rápido) 10, 207 flujos de trabajo alternativos del experimento. Véase flujos de trabajo. formación, información acerca de x eficiencia de amplificación 29, 30, 102, 103 elementos del software Design Wizard (Asistente de diseño) 127 pantallas de análisis 96, 178 eliminación de residuos, directrices xx ensayos en inventario 41, 147 ensayos fabricados bajo pedido 41, 147 ensayos personalizados 41, 147 ergonomía, seguridad xxii estación de trabajo xxii estándares casilla de verificación Set Up Standards (Configurar estándares) 25, 26 228 F Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Índice G gráfica de amplificación, típica 107, 189 H High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits 51, 157 I iconos de peligro. Consulte símbolos de peligro, en instrumentos imprimir instrucciones de la configuración de la reacción 40, 146 indicador BADROX 117, 197 indicador NOAMP 117, 197 indicador NOISE 117, 197 indicador NOSIGNAL 117, 197 indicador OFFSCALE 117, 197 indicador OUTLIERRG 117, 197 indicador SPIKE 117, 197 indicador THOLDFAIL 117, 197 iniciar proceso disposición conectada 73 distribución autónoma 74 L línea basal ajustar manualmente 115, 195 valores correctos 107, 189 M marcador AMPNC 117, 197 marcador BLFAIL 117, 197 marcador CTFAIL 117, 197 marcador EXPFAIL 117, 197 marcador HIGHSD 117, 197 marcadores en experimentos de CT comparativo 197 en experimentos de curva estándar relativa 117 opciones de análisis 115, 195 materiales necesarios 51, 53, 55, 59, 61, 157, 159, 161, 163 mezcla de reacción volúmenes 59, 161 volúmenes calculados 36, 38, 143, 145 movimiento repetitivo, seguridad xxii movimiento y levantamiento, seguridad xvi MSDS descripción xvii obtención xviii MSDS, obtener x muestra de referencia componente de experimento 5 pantalla Relative Quantification Settings (Opciones de cuantificación relativa) 32, 140 muestras componente de experimento 4, 5 configurar 30, 137 diluciones 53, 158 directrices de diseño 32, 139 preparar plantilla 51, 157 reacciones de muestras (desconocidas) 64, 164 O omitir pocillos 118, 197 opciones de análisis avanzadas 115, 195 CT 115, 195 cuantificación relativa 115, 195 línea basal 115, 195 marcador 115, 195 umbral 115, 195 ver 114, 194 opciones de notificación 71 otros reactivos basados en fluorescencia 9 P palabras de aviso para el usuario, descripción viii pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) supervisión durante un proceso 78 ver después de proceso 103, 185 pantalla Experiment Properties (Propiedades de experimento) 20, 129 pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión de genes) 108, 182 pantalla Materials List (Lista de materiales) 43, 148 pantalla Methods & Materials (Métodos y materiales) 22, 131 pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente) 120, 200 pantalla Multiple Plots (Múltiples gráficas) 99, 180 pantalla QC Summary (Resumen QC) 116, 196 pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos) 122, 203 pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción) 35, 142 pantalla Relative Quantification Settings (Opciones cuantificación relativa) 140 pantalla Relative Quantification Settings (Opciones de cuantificación relativa) 32 pantalla Run Method (Método de proceso) 33, 141 supervisión durante un proceso 81 pantalla Samples (Muestras) 30, 137 pantalla Standards (Estándares) 28 pantalla Targets (Dianas) 25, 135 pantalla Temperature Plot (Gráfica de temperatura) 80 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 229 Índice pantallas de análisis consejos de desplazamiento 98, 179 elementos del software 96, 178 pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) 103, 185 pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión de genes) 108, 182 pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente) 120, 200 pantalla Multiple Plots (Múltiples gráficas) 99, 180 pantalla QC Summary (Resumen QC) 116, 196 pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos) 122, 203 pantalla Standard Curve (Curva estándar) 100 tabla de pocillos 108, 182 PCR multiplexada 7, 25, 134 PCR uniplexada 7, 25, 134 Peligro xxi PELIGRO, descripción xi peligros. Consulte seguridad perfiles de residuos, descripción xx placa de reacción cargar 70, 170 descargar 87 disposición 46, 152 preparar 61, 163 plantilla. Véase muestras. pocillos control negativo 31, 46, 61, 138, 152, 163 desconocidos 31, 46, 61, 138, 152, 163 estándar 31, 46, 61, 138, 152, 163 omitir 118, 197 seleccionar 98, 179 PRECAUCIÓN, descripción xi preparar el proceso 69, 169 preparar experimento dilución seriada de estándar 55 diluciones de muestras 53, 158 directrices 54, 58, 60, 64, 158, 160, 162, 165 flujo de trabajo 50, 156 mezcla de reacción preparar 58, 160 para obtener más información 52, 54, 60, 65, 158, 160, 162, 165 placa de reacción 61, 163 plantilla 51, 157 publicar datos 111, 191 R reactivos otros basados en fluorescencia 9 SYBR Green 8 TaqMan 8 reactivos SYBR Green 8, 23, 24, 27, 41, 123, 132, 134, 136, 147, 204 230 reactivos TaqMan 8, 23, 24, 27, 41, 123, 132, 134, 136, 147, 204 realizar experimento activar opciones de notificaciones 71 alertas 82 directrices 72 flujo de trabajo 68 iniciar 73 para obtener más información 71, 82, 84 preparar 69, 169 supervisar 76 transferir datos 87 réplica, componente de experimento 5, 6 residuos biológicos peligrosos, manipulación xx residuos radioactivos, manipulación xx resultados, interpretar 93, 175 RT-PCR de 1 pasos 7, 24, 25, 34, 41, 133, 134, 142, 147 RT-PCR de 2 pasos 7, 11, 12, 24, 25, 133, 134 S seguridad antes de usar el instrumento xvi convenciones xi directrices xvii, xix, xx eléctrica xx ergonomía xxii estación de trabajo xxii estándares xxiii mover y levantar el instrumento xvi mover/levantar xvi movimiento repetitivo xxii peligros biológicos xxi química xvii residuo químico residuos químicos xix uso del instrumento xvi seguridad de residuos químicos xix seguridad eléctrica xx seguridad química xvii seleccionar pocillos 98, 179 símbolos de peligro. Consulte símbolos de peligro, en instrumentos símbolos de peligro. Consulte símbolos de seguridad, en instrumentos símbolos de seguridad, en instrumentos xiii símbolos, seguridad xiii sistema de ayuda, acceso ix sistema StepOne consumibles 3 distribuciones 73, 76, 88 filtros 123, 204 reactivos 8 recopilación de datos 2 solicitar materiales 43, 148 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Índice solución de problemas ajustar línea basal 115, 195 ajustar umbral 115, 195 marcadores 117, 197 omitir pocillos 118, 197 ver opciones de análisis 114, 194 ver pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente) 120, 200 ver pantalla QC Summary (Resumen QC) 116, 196 ver pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos) 122, 203 supervisar proceso disposición conectada 77 distribución autónoma 86 distribución autónoma (remota) 83 pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) 78 pantalla Run Method (Método de proceso) 81 pantalla Temperature Plot (Gráfica de temperatura) 80 suposiciones de uso de esta guía vii T tabla de pocillos 108, 182 transferir datos 87 U umbral ajustar manualmente 115, 195 valores correctos 107, 189 usar esta guía como tutorial 9 con sus propios experimentos 9 uso del instrumento, seguridad xvi V valores atípicos. Véase omitir pocillos. velocidad de la rampa 22, 24, 131, 133 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa 231 Índice 232 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa Worldwide Sales and Support Applied Biosystems vast distribution and service network, composed of highly trained support and applications personnel, reaches 150 countries on six continents. For sales office locations and technical support, please call our local office or refer to our Web site at www.appliedbiosystems.com. Applied Biosystems is committed to providing the world’s leading technology and information for life scientists. Headquarters 850 Lincoln Centre Drive Foster City, CA 94404 USA Phone: +1 650.638.5800 Toll Free (In North America): +1 800.345.5224 Fax: +1 650.638.5884 06/2010 www.appliedbiosystems.com Número de referencia 4377742 Rev. B