Thermo Fisher Scientific Primagam Non‑Human Primate M. tuberculosis Interferon‑Gamma Kit Instrucciones de operación

Marca
Thermo Fisher Scientific
Modelo
Primagam Non‑Human Primate M. tuberculosis Interferon‑Gamma Kit
Tipo
Instrucciones de operación
Primagam™ Non‑Human Primate M. tuberculosis
Interferon‑Gamma Kit
ELISA para la detección de tuberculosis en primates no humanos
Número de catálogo 63311
N.º de pub. MAN0018719 Rev. A.0
Tecnología Especie Tipo de muestra
ELISA Primates no humanos Sangre total
¡ADVERTENCIA! Lea las hojas de datos de seguridad (HDS o SDS) y siga las instrucciones de manipulación. Lleve el equipo de
protección individual (EPI) adecuado (gafas, ropa, y guantes). Las hojas de datos de seguridad (HDS o SDS) se encuentran
disponibles en thermosher.com/support.
Descripción del producto
El Applied Biosystems™ Primagam™ Non-Human Primate M. tuberculosis Interferon-Gamma Kit es una prueba diagnóstica basada en
ELISA que mide el interferón-γ (IFN-γ) en muestras de sangre total a n de detectar la tuberculosis (TB). La liberación de IFN-γ en
respuesta a la estimulación con antígenos de derivados proteicos puricados (PPD) con tuberculina es un biomarcador de alto valor como
pronóstico de la infección por TB. El kit detecta la presencia de IFN-γ en las siguientes especies: Aotus (mico nocturno), Ateles (mono
araña), Colobus (guerezas), gibón/siamang, guenon/De Brazza's, langur, lémur, macaco, mandril, tití, mono ardilla, tamarino y Vervet.
La tuberculosis es una enfermedad progresiva que ataca al sistema respiratorio de los primates. Los primates no humanos pueden
transmitirla a sus cuidadores de los zoológicos y laboratorios de investigación, lo cual constituye un peligro para la salud pública. La
prueba intradérmica a nivel del párpado es el método utilizado tradicionalmente para detectar la tuberculosis en primates no humanos.
Esta prueba requiere de inmovilización y detecta la TB en función de la inamación e hinchazón en el lugar de la inyección. La Primagam™
Non-Human Primate M. tuberculosis Interferon-Gamma Kit se puede utilizar para la detección de TB de forma complementaria o
alternativa a la prueba intradérmica a nivel del párpado.
El kit sigue un procedimiento de laboratorio de dos días:
•Día 1: Se recolectan muestras de sangre total en tubos de heparina y luego se incuban alícuotas de cada muestra con un solo antígeno:
Bovine PPD, Avian PPD, o Nil Antigen Control.
•Día 2: Se mide el IFN-γ producido por los linfocitos estimulados por antígenos con la tecnología de ELISA.
Se evaluó el kit durante un brote de tuberculosis en 54 simios macacos cynomolgus (Macaca fascicularis) y 22 simios rhesus (Macaca mulaa).
Los resultados del kit mostraron un 92 % de sensibilidad con un 100 % de especicidad. Un examen adicional en una colonia separada,
presuntamente sin TB de acuerdo con los antecedentes, y un régimen periódico de pruebas cutáneas dieron también lugar a una
especicidad del 100 %.
INSTRUCCIONES DE USO
Sólo para uso veterinario. Sólo para uso in vitro.
Componentes y almacenamiento
Se suministran reactivos y placas para 30 pruebas.
Nota: Para las instrucciones de reconstitución y dilución, ver “Antes de empezar“ en la página 3.
Tabla 1 Primagam™ Non‑Human Primate M. tuberculosis Interferon‑Gamma Kit (N.º de Cat. 63311)
Componentes Descripción Cantidad Almacenami
ento [1]
Microplate Strip[2] Listo para usar. 2 microplacas de 96 pocillos
2-8 °C
Bovine PPD Diluir antes de usar. 5 ml
Avian PPD Diluir antes de usar. 5 ml
Nil Antigen Control
• Listo para usar.
• Contiene timerosal 0,01 % en
peso por volumen (p/v).
5 ml
Positive Primate IFN-γ Control • Reconstituir antes de usar.
• Contiene timerosal al 0,01 % p/v.
1 recipiente de sólidos
liofilizados
Negative Primate IFN-γ Control • Reconstituir antes de usar.
• Contiene timerosal al 0,01 % p/v.
1 recipiente de sólidos
liofilizados
Green Diluent (Muestra y tampón de diluyente conjugado) • Listo para usar.
• Contiene timerosal al 0,01 % p/v. 40 ml
Conjugate‑100x Concentrate (anticuerpo IFN-γ antiprimate
marcado con peroxidasa de rábano rusticano)
• Reconstituir antes de usar.
• Contiene timerosal al 0,01 % p/v.
1 recipiente de sólidos
liofilizados
Wash Buffer‑20x Concentrate • Diluir antes de usar.
• Contiene timerosal al 0,01 % p/v. 2 × 50 ml
Enzyme Substrate Buffer • Listo para usar.
• Contiene H2O2.30 ml
Chromogen Solution‑100x Concentrate • Diluir antes de usar.
• Contiene TMB en DMSO. 0,5 ml
Enzyme Stopping Solution • Listo para usar.
• Contiene 0,5 M de H2SO4.15 ml
[1] Consulte la fecha de caducidad en la etiqueta.
[2] Los pocillos están recubiertos de anticuerpos dirigidos contra el IFN-γ de primate.
Materiales necesarios no suministrados
A menos que se indique lo contrario, todos los materiales están disponibles en thermosher.com.
Artículo Origen[1]
Instrumentos
Multiskan™ FC Microplate Photometer, o un lector de placas equivalente[2] 51119000
Wellwash™ Microplate Washer o equivalente 5165000
(Opcional)
Agitador de microplacas MLS
(Opcional)
Agitador de balanceo para tubos MLS
2
Primagam
™
Non‑Human Primate M. tuberculosis Interferon‑Gamma Kit Instrucciones de uso
Artículo Origen[1]
Equipos
Armario de bioseguridad (BSC, nivel II) MLS
Pipeta monocanal (10-1000 µl) MLS
Pipeta multicanal (50-500 µl) MLS
Mezclador de laboratorio (mezclador vórtex o equivalente) MLS
Portaagujas, de 2 a 3 por colector MLS
Incubadora humidificadora a 37 °C MLS
Cilindros de medición (100 ml, 1 l y 2 l) MLS
Tubos, placas y otros consumibles
Tubos de heparina de litio para recogida de sangre, 1 tubo por animal MLS
Agujas Vacutainer de 1,5 pulgadas 23G-18G, 1 aguja por animal MLS
Pipetas estériles graduadas de 1 o 5 ml MLS
Placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos, 1 placa por cada 8 animales MLS
Microtubos de 1 ml en formato de 96 pocillos con gradilla y tapas, 1 gradilla por cada 30 animales MLS
Tubos de polipropileno MLS
Puntas de pipeta (según las recomendaciones del fabricante de la pipeta) thermofisher.com/pipettetips
Reservorios de solución MLS
Reactivos
Agua desionizada o destilada (2 l) MLS
Medio RPMI o PBS (1X), pH 7.4 MLS
[1] MLS: Fisher Scientific (fisherscientific.com) u otro proveedor principal de productos de laboratorio.
[2] El lector de placas debe ser capaz de medir a 450 nm con un filtro de referencia a 620-650 nm.
Directrices de procedimiento
• Siga estrictamente las normas nacionales de seguridad.
• Siga el protocolo del kit en los laboratorios adecuados para su propósito.
• Considere las muestras como potencialmente infecciosas y todos los elementos que entren en contacto con ellas como potencialmente
contaminados.
• Manipule todas las muestras de sangre de primates en un armario de bioseguridad (BSC, nivel II).
• Analice todas las muestras y realice los controles por duplicado.
• Deseche los recipientes y los reactivos sin utilizar de acuerdo a los requerimientos locales de desechos biomédicos.
• Cambie las puntas de pipeta después de cada etapa de pipeteo.
• Mantenga los reservorios de solución separados para cada reactivo.
• No utilice los componentes del kit después de su fecha de caducidad o en caso de observar cambios en su aspecto.
• No utilice componentes del kit con números de lote diferentes.
• Utilice agua desionizada o destilada, o agua de calidad equivalente.
• Utilice una lavadora de microplacas en todas las etapas de lavado.
Antes de empezar
Determinar el valor máximo del agitador de placas
Si emplea un agitador de placas, determine el valor máximo.
1. Compruebe que la placa encaja bien en su agitador.
2. Añada 1,6 ml de agua a cada pocillo de la placa y luego cúbrala con una lámina de sellado.
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3. Determine el valor máximo que puede emplear en su agitador sin que el agua salpique la lámina de sellado.
Diluir los antígenos
1. Añada 160 µl de Bovine PPD a 840 µl de medio RPMI o PBS para obtener una concentración nal del ensayo de 300 IU/ml.
2. Añada 160 µl de Avian PPD a 840 µl de medio RPMI o PBS para obtener una concentración nal del ensayo de 250 IU/ml.
Conserve los antígenos diluidos entre 2 y 8 °C durante un mes como máximo.
Reconstituir los controles
1. Reconstituya el Positive Primate IFN-γ Control y el Negative Primate IFN-γ Control en 1,0 ml de agua desionizada o destilada.
2. Deje reposar el contenido durante al menos 15 minutos hasta que se disuelva.
3. Invierta suavemente cada tubo 4 o 5 veces para mezclar.
Conserve los controles reconstituidos entre 2 y 8 °C durante tres meses como máximo.
Reconstituir el Conjugate‑100x Concentrate
¡IMPORTANTE! Conserve el Conjugate-100x Concentrate siempre entre 2 y 8 °C, incluso durante la reconstitución.
1. Reconstituya el Conjugate-100x Concentrate en 0,5 ml de agua desionizada o destilada.
2. Deje reposar el contenido durante al menos 15 minutos hasta que se disuelva.
3. Invierta suavemente el tubo 4 o 5 veces para que se mezcle, luego manténgalo entre 2 y 8 °C hasta su uso.
Conserve el Conjugate-100x Concentrate reconstituido entre 2 y 8 °C durante 3 meses como máximo.
Preparar el Wash Buffer‑1x
Nota: Una microplaca de 96 pocillos requiere 1 l de Wash Buer‑1x.
1. (Opcional) Si el Wash Buer‑20x Concentrate muestra un precipitado, caliente la botella en un baño de agua a 37 °C hasta que el
precipitado se disuelva.
2. Mezcle el Wash Buer‑20x Concentrate bien.
3. Combine 1 parte de Wash Buer‑20x Concentrate con 19 partes de agua desionizada o destilada.
Por ejemplo, añada 50 ml de Wash Buer‑20x Concentrate a 950 ml de agua desionizada o destilada.
4. Mezcle hasta obtener una solución transparente.
Conserve el Wash Buer‑1x a temperatura ambiente (22 ± 3 °C) durante un máximo de dos semanas o entre 2 y 8 °C durante un máximo de
un mes.
Día 1: Recolectar muestras de sangre total y luego incubar con los antígenos
Recolectar las muestras de sangre total
1. Recolecte al menos 5 ml de sangre de cada animal en tubos de heparina, luego transera las muestras al laboratorio a temperatura
ambiente.
2. Cultive las muestras de sangre en las siguientes 12 horas para preservar la viabilidad de los linfocitos (siguiente sección).
Tomar una alícuota de las muestras de sangre y luego incubar con los antígenos
1. Mezcle todas las muestras de sangre para garantizar que la heparina se disuelva, según su método de mezcla.
•Con un agitador de rodillo: agite suavemente entre 1 y 2 minutos.
•Con inversión: invierta suavemente cada tubo 10 veces.
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2. Transera tres alícuotas de 1,5 ml de cada muestra de sangre a pocillos separados de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos (ver
Tabla 2).
3. Añada 100 µl de Nil Antigen Control (N), Bovine PPD diluido (B) o Avian PPD diluido (A) a los pocillos pertinentes que contengan
sangre, de acuerdo con la tabla siguiente.
Tabla 2 Disposición recomendada de la placa de muestras
123456
AAnimal 1
NAnimal 1
BAnimal 1
AAnimal 2
NAnimal 2
BAnimal 2
A
BAnimal 3
NAnimal 3
BAnimal 3
AAnimal 4
NAnimal 4
BAnimal 4
A
CAnimal 5
NAnimal 5
BAnimal 5
AAnimal 6
NAnimal 6
BAnimal 6
A
DAnimal 7
NAnimal 7
BAnimal 7
AAnimal 8
NAnimal 8
BAnimal 8
A
4. Con un agitador de placas, mezcle completamente las muestras con los antígenos durante 1 minuto (ver “Determinar el valor máximo
del agitador de placas“ en la página 3).
Como alternativa, si no dispone de un agitador de placas, agite la placa de cultivo de tejidos para mezclar. Sujete la tapa y la placa
juntas con rmeza, agite 10 veces en el sentido de las agujas del reloj y repita la operación en el sentido contrario.
¡IMPORTANTE! Para lograr un rendimiento óptimo del ensayo, asegúrese de que las muestras se mezclan completamente con los
antígenos. No es posible mezclar en exceso.
5. Transera la placa de cultivo de tejidos a una incubadora humedecida a 37 °C y luego incube entre 16 y 20 horas.
Día 2: Colectar el plasma y luego realizar el ELISA
Antes de empezar
Equilibre todos los componentes del kit (salvo Conjugate-100x Concentrate) a temperatura ambiente, luego mezcle suavemente los
reactivos, las muestras y los controles.
Nota: Algunos reactivos pueden necesitar varias horas para alcanzar el equilibrio. Si se necesita un tiempo de equilibrio menor, caliente los
reactivos en un baño de agua a 30 °C.
Colectar el plasma y almacenar las muestras (opcional)
1. Retire la placa de cultivo de tejido de la incubadora.
2. (Opcional) Centrifugue la placa a 500 × g a temperatura ambiente durante 5 minutos.
3. Evitando la capa inferior de glóbulos rojos, pipetee con cuidado para transferir 150-300 µl de plasma a un microtubo limpio de 1 ml
en una gradilla para almacenamiento de 96 pocillos (ver Tabla 3).
Nota: Es importante evitar la recogida de glóbulos rojos con el plasma en este paso. Sin embargo, unos pocos glóbulos rojos no
alterarán el ensayo.
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El siguiente orden de almacenamiento permite una transferencia eciente de las muestras desde la gradilla para almacenamiento a las
tiras de las microplacas, con una pipeta multicanal.
Tabla 3 Orden recomendado para el almacenamiento de plasma
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 1N[1] 1B 1A 2N 2B 2A 3N 3B 3A 4N 4B 4A
B 5N 5B 5A 6N 6B 6A 7N 7B 7A 8N 8B 8A
C 9N 9B 9A X X X 10N 10B 10A 11N 11B 11A
D 12N 12B 12A 13N 13B 13A 14N 14B 14A 15N 15B 15A
E 16N 16B 16A 17N 17B 17A 18N 18B 18A 19N 19B 19A
F 20N 20B 20A 21N 21B 21A 22N 22B 22A 23N 23B 23A
G 24N 24B 24A X X X 25N 25B 25A 26N 26B 26A
H 27N 27B 27A 28N 28B 28A 29N 29B 29A 30N 30B 30A
[1] En cada pocillo se indica el número de cada animal seguido del antígeno (N—Nil Antigen Control, B—Bovine PPD, A—Avian PPD, X—vacío).
Nota: Después de que las muestras se hayan transferido a las tiras de microplacas, utilice los pocillos vacíos (X) para los controles que
se suministran con el kit.
4. (Opcional) Conserve las muestras de plasma en microtubos sellados entre 2 y 8 °C durante un máximo de 28 días o a –20 °C durante
un máximo de 5 años.
Asegúrese de que las gradillas de las muestras estén fechadas e incluyan las iniciales del operador, el contenido del tubo y la
información sobre el animal.
Llevar a cabo el ELISA
• Equilibre todos los componentes del kit (salvo Conjugate-100x Concentrate) a temperatura ambiente, luego mezcle suavemente los
reactivos, las muestras y los controles.
• Determine el número de tiras de microplaca de 8 pocillos que se requieren para el ensayo y luego coloque las tiras en los bastidores de
las microplacas. Vuelva a colocar las tiras y los bastidores no utilizados en la bolsa y consérvelos a entre 2 °C y 8 °C para usarlos en el
futuro.
= Anticuerpo anti-IFN-γ |
= IFN-γ |
= Conjugado |
= Sustrato
a. Añada 50 µl de Green Diluent a cada pocillo de la microplaca montada.
b. Transera 50 µl de cada muestra de plasma al pocillo pertinente que contenga Green Diluent.
Las muestras de plasma de cada animal deben añadirse a los pocillos al mismo tiempo.
Recomendamos utilizar una pipeta multicanal.
Nota: Cuando se descongelan, las muestras de plasma pueden coagularse. Pipetee con cuidado
para asegurarse de que añade el volumen correcto de plasma a cada pocillo.
c. Añada 50 µl de cada muestra de control al pocillo pertinente que contenga Green Diluent.
d. Mezcle las muestras y los controles con Green Diluent con un agitador de placas a velocidad
moderada-alta durante 1 minuto.
Como alternativa, si no dispone de un agitador de placas, pipetee arriba y abajo 5 veces para
mezclar.
e. Cubra la placa con una tapa y luego incube durante 60 minutos a temperatura ambiente.
1Incubar las muestras con
Green Diluent
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a. Lave los pocillos de la microplaca 6 veces con 400 µl de Wash Buer‑1x y deje los pocillos en
remojo durante 10 segundos entre cada lavado.
Nota: Llene los pocillos con cuidado con Wash Buer‑1x para evitar la contaminación cruzada
con los pocillos adyacentes.
b. Dé golpecitos en la placa sobre una toalla de papel para extraer todo el Wash Buer‑1x de los
pocillos.
2Lavar los pocillos
¡IMPORTANTE! Prepare el Conjugate-1x no más de 15 minutos antes de usarlo.
a. Para cada tira de microplaca de 8 pocillos, combine 10 µl de Conjugate-100x Concentrate con 1 ml
de Green Diluent.
b. Mezcle a fondo el Conjugate-1x. Evitar la formación de espuma, ya que podría provocar la
desnaturalización del Conjugate.
c. Vuelva a almacenar la porción no utilizada de Conjugate-100x Concentrate a entre 2 y 8 °C.
3Diluir el Conjugate‑100x
Concentrate
a. Añada 100 µl de Conjugate-1x a cada pocillo de la microplaca.
b. Mezcle bien usando un agitador de placas a velocidad moderada-alta durante 1 minuto.
Como alternativa, si no dispone de un agitador de placas, pipetee arriba y abajo 5 veces para
mezclar.
c. Cubra la placa con una tapa y luego incube durante 60 minutos a temperatura ambiente.
d. Aspire la solución de los pocillos, luego lave los pocillos 6 veces con Wash Buer‑1x (ver “Lavar
los pocillos“ en la página 7).
4Añadir el Conjugate‑1x
¡IMPORTANTE!
·Prepare la solución de sustrato enzimático inmediatamente antes de su uso.
·Use recipientes de plástico de polipropileno estériles. No utilice recipientes ni pipetas de
poliestireno.
a. Para cada tira de microplaca de 8 pocillos, combine 10 µl de Chromogen Solution-100x
Concentrate con 1 ml de Enzyme Substrate Buer.
Ejemplo: Para seis tiras de microplaca, combine 60 µl de Chromogen Solution-100x Concentrate
con 6 ml de Enzyme Substrate Buer.
b. Mezcle a fondo la solución de sustrato enzimático.
Nota: Si se produce una decoloración azul, deseche la solución.
5Preparar la solución de
sustrato enzimático
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Nota: Inicie el tiempo de incubación de 30 minutos cuando la solución de sustrato enzimático se añada
al primer pocillo.
a. Añada 100 µl de solución de sustrato enzimático a cada pocillo de la microplaca.
b. Mezcle bien usando un agitador de placas a velocidad moderada-alta durante 1 minuto.
Como alternativa, si no dispone de un agitador de placas, pipetee arriba y abajo 5 veces para
mezclar.
c. Cubra la placa con una tapa y luego incube durante 30 minutos a temperatura ambiente en la
oscuridad.
6Añadir la solución de
sustrato enzimático
a. Añada 50 µl de Enzyme Stopping Solution a cada pocillo en el mismo orden en que se dispensó
la solución de sustrato enzimático.
b. Dé golpecitos en el lado de la placa para mezclar con suavidad.
La solución en los pocillos cambia de azul a amarillo.
c. Lea la placa a 450 nm (ltro de referencia a 620-650 nm) en los 5 minutos posteriores.
7Añadir el Enzyme
Stopping Solution, luego
leer la placa
Análisis de los resultados
Calcular la absorbancia media
1. Calcule el valor medio DO450 de todas las muestras y controles.
2. Si detecta IFN-γ en muestras estimuladas con Nil Antigen Control, sustraiga el valor medio DO450 de los resultados para ese animal.
Nota: La detección de IFN-γ en muestras estimuladas con Nil Antigen Control podría ser indicativo de coinfección u otro trastorno.
Criterios de validación de la prueba
De no cumplirse los siguientes criterios, los resultados no serán válidos y las muestras deberán volver a analizarse.
Tipo de reacción media DO450 Coeficiente de variación (%)
Negative Primate IFN-γ Control < 0,150 30
Positive Primate IFN-γ Control > 1,00 15
Interpretación de los resultados
Interprete los resultados según la siguiente tabla:
Media DO450 Interpretación
Bovine PPD − Avian PPD > 0,050 y
Bovine PPD − Nil Antigen Control > 0,050 Positivo
Avian PPD > Bovine PPD y
Avian PPD > Nil Antigen Control Negativo[1]
[1] El animal se considera un reactor aviar.
• Para las lecturas de absorbancia que están fuera del límite del lector de placas, véase “Repetir el análisis de muestras con resultados no
válidos“ en la página 9.
• Esta prueba puede dar un resultado falso positivo o falso negativo debido a las condiciones locales. Interprete los resultados teniendo
en cuenta toda la información clínica, histórica y epidemiológica disponible que resulte pertinente para el animal sometido a la
prueba. Podría ser necesario realizar más pruebas de conrmación en determinadas circunstancias.
• La interpretación de las pruebas y las consiguientes decisiones sobre la cría de los animales son responsabilidad del usuario, del
veterinario consultor, asesor de salud animal o autoridad correspondiente.
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Repetir el análisis de muestras con resultados no válidos
1. Diluya las muestras de plasma a 1:4 en Green Diluent.
Por ejemplo, añada 25 µl de plasma de prueba a 75 µl de Green Diluent.
2. Agite a una velocidad moderada-alta de 3 a 5 veces, luego repita el procedimiento ELISA.
Asistencia al cliente y soporte técnico
Visite thermosher.com/support para conocer la última información en servicio y asistencia.
• Números de teléfono de contacto en todo el mundo
• Información de asistencia del producto
– Preguntas más frecuentes (FAQ) sobre productos
– Software, parches y actualizaciones
– Formación para muchas aplicaciones e instrumentos
• Pedidos y soporte web
• Documentación del producto
– Guías de usuario, manuales y protocolos
–Certicados de análisis
– Hojas de datos de seguridad (Safety Data Sheets, SDS; también conocidas como MSDS)
Nota: Para conocer las SDS de los reactivos y productos químicos de otros fabricantes, póngase en contacto con el fabricante.
Garantía limitada del producto
Life Technologies Corporation y/o sus liales garantizan sus productos tal y como se establece en los términos y condiciones para la venta
de Life Technologies en www.thermosher.com/us/en/home/global/terms-and-conditions.html. Si tiene cualquier duda, póngase en
contacto con Life Technologies en www.thermosher.com/support.
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Prionics Lelystad B.V. | Platinastraat 33 | 8211 AR Lelystad | The Netherlands
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La información incluida en esta guía está sujeta a cambios sin previo aviso.
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DEL MISMO.
Traducido del texto en inglés en la publicación Número MAN0018635 Rev. A.0.
Historial de revisiones: N.º de Pub. MAN0018635
Revisión Fecha Descripción
A.0 25 de noviembre de
2019
• Se ha convertido el documento anterior (Primagam_PI_V1.4e_140512.pdf) a la plantilla del documento actual, con
actualizaciones asociadas al número de publicación, la información sobre la licencia limitada, la garantía, las marcas
comerciales y logotipos.
• Se han actualizado los procedimientos para la preparación de antígenos y la estimulación de la sangre.
Información importante sobre licencias: Estos productos pueden estar cubiertos por una o más licencias de etiquetado de uso limitado. Mediante el uso de estos productos,
acepta los términos y condiciones de todas las licencias de etiquetado de uso limitado aplicables.
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