Roche BenchMark ULTRA Interpretation Guide

BenchMark ULTRA
Roche
Marca
Roche
Modelo
BenchMark ULTRA
Tipo
Interpretation Guide

Este manual también es adecuado para

Roche BenchMark ULTRA es un sistema de tinción automatizado diseñado para proporcionar resultados de tinción de alta calidad en un entorno de laboratorio. Con su tecnología avanzada, ofrece una amplia gama de características y beneficios que lo convierten en una herramienta valiosa en el laboratorio:

  • Procesamiento rápido: Roche BenchMark ULTRA tiñe portaobjetos de forma rápida y eficiente, lo que permite un flujo de trabajo más rápido y tiempos de respuesta más cortos.

  • Tinción precisa y reproducible: El sistema utiliza algoritmos avanzados para controlar la temperatura, el tiempo y la dispensación de reactivos, lo que garantiza resultados de tinción consistentes y reproducibles.

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Guía de interpretación del VENTANA
MMR RxDx Panel para el carcinoma
endometrial (CE)
VENTANA anti-MLH1 (M1) Mouse Monoclonal Primary Antibody
VENTANA anti-PMS2 (A16-4) Mouse Monoclonal Primary Antibody
VENTANA anti-MSH2 (G219-1129) Mouse Monoclonal Primary Antibody
VENTANA anti-MSH6 (SP93) Rabbit Monoclonal Primary Antibody
Tabla de contenido
Introducción 1
Uso previsto 3
Uso indicado del producto 3
Objetivo de la Guía de interpretación 3
Evaluación clínica 4
Características de la tinción 4
Criterios de aceptabilidad de la morfología y el fondo 5
Criterios de casos para la evaluación clínica 5
Algoritmo de puntuación 6
Controles 8
Controles positivos internos 8
Flujo de trabajo de muestras 10
Imágenes de referencia 12
Casos competentes 12
Casos deficientes 14
Casos difíciles 18
Impacto de las condiciones previas al análisis en el VENTANA MMR RxDx Panel 28
Condiciones de fijación aceptables para lograr resultados óptimos de tinción 28
Estabilidad de los portaobjetos con cortes 32
Grosor del tejido 32
Bibliografía 33
La reparación de bases de ADN mal emparejadas (MMR) es un
mecanismo molecular conservado que corrige las sustituciones
incorrectas de las bases que tienen lugar de forma espontánea
durante la replicación del ADN. Los métodos que se basan en la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) han demostrado que
la MMR a menudo provoca inestabilidad de microsatélites (MSI),
un trastorno por el que las repeticiones cortas en tándem de los
nucleótidos se introducen en el ADN. Cuando la cantidad de
repeticiones es igual o superior al 30% de los loci de microsatélites
que se estudian, la MSI se puede caracterizar de forma más
detallada como MSI-High (MSI-H). Las deficiencias en los
mecanismos MMR se atribuyen a mutaciones en las proteínas de
los MMR, con mayor frecuencia de MLH1, PMS2, MSH2 y MSH6.
Las proteínas MLH1 y PMS2 suelen funcionar conjuntamente en
un complejo heterodímero, de la misma forma que las proteínas
MSH2 y MSH6. Cuando la MMR funciona con normalidad, el
heterodímero MSH6/MSH2 se liga al ADN mal emparejado. Esta
unión provoca una modificación conformacional que permite
que el heterodímero MLH1/PMS2 se una al complejo MSH6/
MSH2 ligado al ADN, dando como resultado una reparación por
escisión del ADN afectado. Las mutaciones o deficiencias de
estas proteínas dan lugar a una MSI y mutaciones somáticas
frecuentes debido al error en la replicación. Las pruebas de
inmunohistoquímica (IHC) para MMR pueden ser útiles para
identificar los genes MMR con mayor probabilidad de contener
una línea germinal o alteraciones somáticas.
Históricamente, los regímenes de tratamiento de los pacientes
con cáncer se ha establecido en función de la neoplasia maligna
específica. No obstante, las inmunoterapias nuevas, en especial
aquellas que modifican las vías celulares en las que intervienen
las proteínas de muerte programada 1 (PD-1) o del ligando de
muerte programada 1 (PD-L1), están desempeñando un papel
importante en las estrategias terapéuticas de los profesionales
médicos. PD-1 es un receptor de inhibición cuya expresión se
observa en los linfocitos T tras su activación y que se mantiene
constante en estados de estimulación crónica como en el caso de
una infección o un cáncer crónicos. La expresión de PD-L1 se ha
observado en células inmunitarias y malignas y se ha detectado
que la expresión aberrante de PD-L1 en células tumorales
(TC) obstaculiza la inmunidad antitumoral, lo que da lugar a la
inmunoevasión. Por consiguiente, la interrupción de la vía PD-
L1/PD-1 representa una estrategia atractiva para revigorizar la
inmunidad específica frente a tumores de los linfocitos T.
La expresión de las proteínas MMR (MLH1, PMS2, MSH2 y
MSH6) es predominante en las células proliferativas normales
y malignas. En ciertos tipos de cáncer habituales se presentan
deficiencias en la MMR (dMMR) y MSI. Varios estudios han
demostrado que la deficiencia en la MMR está asociada a una
elevada expresión de las proteínas PD-1 o PD-L1. Por tanto,
las proteínas MMR pueden resultar útiles como biomarcadores
predictivos para tratamientos dirigidos contra PD-1; en concreto,
la pérdida de expresión de una o varias proteínas MMR
puede predecir una probabilidad mayor de respuesta a este
tratamiento. Los inhibidores de PD-1 pueden ser convenientes
en tipos de cáncer habituales con una frecuencia elevada de
deficiencia en la MMR y MSI-H, independientemente del tejido
de origen del cáncer. Por consiguiente, podría ser conveniente
la aplicación de un ensayo de pruebas diagnósticas con fines
terapéuticos en los pacientes para los que se contempla el
tratamiento dirigido contra PD-1 a fin de identificar la población
de pacientes con deficiencias en MMR.
El carcinoma endometrial (CE) es una de las neoplasias malignas
ginecológicas más habituales.
12
Habitualmente se señala la
existencia en él de alteraciones genéticas, como la MSI.
12
También
se ha señalado que el CE con MSI podría contener una expresión
más elevada de la proteína PD-L1 en comparación con el CE con
estabilidad de microsatélites (MSS).
16
Mientras que el tratamiento
del CE varía en función del grado, de la histología y del estadio de
la enfermedad,
17
la evaluación del estado de MMR de los tumores
del CE es útil para el pronóstico y la orientación en cuanto al
tratamiento
12
. Por lo tanto, puede ser conveniente llevar a cabo
un ensayo de pruebas diagnósticas con fines terapéuticos en
los pacientes para los que se contempla un tratamiento dirigido
contra PD-1 a fin de identificar el estado de MMR.
La pérdida de expresión de cualquiera de las proteínas esenciales
MMR, como MLH1, PMS2, MSH2 o MSH6, provoca deficiencias
en la MMR. La presencia de tinción de los cuatro marcadores de
proteínas MMR en el tumor indica que el caso tiene un estado de
VENTANA MMR IHC competente. La ausencia de tinción en uno
de los marcadores de proteínas MMR del VENTANA MMR RxDx
Panel indica que el caso tiene un estado de VENTANA MMR IHC
deficiente.
Introducción
VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial 1
2 VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial
Uso previsto
Uso indicado del producto
Consulte la hoja de datos del VENTANA MMR RxDx Panel
correspondiente para obtener información detallada sobre el uso
previsto de este producto, como las indicaciones asociadas.
Objetivo de la Guía de interpretación
El objetivo de esta guía es:
• Proporcionar a los anatomopatólogos una herramienta que
facilite la evaluación clínica de secciones de tejido tumoral
fijado con formol y embebido en parafina (FFPE) y teñido con
el VENTANA MMR RxDx Panel de acuerdo con el etiquetado
del producto propuesto.
• Proporcionar imágenes fotográficas que ilustren los patrones
de tinción resultantes de la tinción de tejidos tumorales con el
VENTANA MMR RxDx Panel.
• Proporcionar imágenes de ejemplo de casos difíciles para
asesorar sobre su evaluación.
• Facilitar orientación en cuanto al uso de elementos de tejido
normales positivos en proteínas MMR, que sirven como
control positivo interno cuando se tiñen con el VENTANA
MMR RxDx Panel.
VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial 3
Estado de tinción Intacta o Perdida de MMR: En estos casos de carcinoma endometrial, los núcleos presentan una tinción
inequívoca en la que predomina el patrón de tinción que se muestra en la mayor parte de los tejidos tumorales del estado Intacto de
MSH6 (panel de la izquierda). La ausencia de tinción nuclear en los tejidos tumorales refleja el estado de Pérdida de MSH6 (panel
de la derecha). La tinción nuclear inequívoca de las células de control interno, como los linfocitos, cercanas a los tumores viables sirven
como controles positivos internos aceptables.
Características de la tinción
Evaluación clínica
Las células marcadas con cada ensayo del VENTANA MMR RxDx
Panel se evalúan para detectar la presencia o ausencia de señal de
diaminobencidina (DAB). La tinción con el VENTANA MMR RxDx
Panel de las proteínas MMR debería presentar un patrón nuclear.
La pérdida de cualquiera de las proteínas MMR detectadas por
el VENTANA MMR RxDx Panel se observa en los núcleos de las
células tumorales. El estado de MMR se clasifica como intacto o de
pérdida en función únicamente de una tinción nuclear inequívoca.
• El estado intacto se caracteriza por la presentación en las
células tumorales de una tinción inequívoca de intensidad igual
o superior a la de los controles internos por encima del fondo.
• El estado de pérdida se caracteriza por la ausencia de
cualquier señal detectable. Es posible que, en los casos en los
que hay pérdida, exista un cambio al color gris claro en el núcleo.
La señal puede distribuirse de forma homogénea con un nivel de
intensidad uniforme en todas las partes neoplásicas del tumor o
de forma heterogénea con varios niveles de intensidad. Debería
poder detectarse fácilmente con aumentos reducidos, como
2x o 4x. En la sección Imágenes de referencia de esta guía
de interpretación se facilita una representación gráfica de los
elementos de tinción y los tipos de células neoplásicas marcadas
con el VENTANA MMR RxDx Panel. El control de reactivo negativo
(NRC) correspondiente a la especie sirve para evaluar la presencia
de fondo en las muestras de la prueba y establecer una línea de
base de la intensidad de tinción. Los criterios de aceptabilidad de
la morfología y el fondo se proporcionan en la Tabla1. Los criterios
de los casos para la evaluación del estado de MMR del tejido
neoplásico con uno de los cuatro ensayos del VENTANA MMR
RxDx Panel se facilitan en la Tabla2.
Ausencia de tinción nuclear de
células tumorales
Tinción nuclear inequívoca de
células tumorales
Tinción nuclear fuerte
en linfocitos
4 VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial
MSH6 10x MSH6 10x
Criterios de aceptabilidad de la morfología y el fondo
Se ha evaluado la aceptabilidad de la morfología del tejido y el fondo en cada caso teñido con el VENTANA MMR RxDx Panel en función
de los criterios que se recogen en la Tabla1.
Criterios de casos para la evaluación clínica
En la Tabla2 se resumen los criterios que debe cumplir un portaobjetos con tejido neoplásico para que se pueda evaluar el estado MMR
con cualquiera de los ensayos del VENTANA MMR RxDx Panel.
Criterios Aceptable Inaceptable
Morfología Se visualizan los elementos celulares de
interés, que permiten la interpretación clínica
de la tinción específica
No se visualizan los elementos celulares de interés,
lo que pone en riesgo la interpretación clínica de la
tinción específica
Fondo El fondo no interfiere en la interpretación
clínica de la tinción específica
El fondo interfiere en la capacidad de interpretar la
tinción específica
Tabla1: Criterios de aceptabilidad de la morfología y el fondo
Interpretación clínica Criterios del patrón de tinción
Evaluable (todos deben cumplirse)
1. H y E contiene ≥50 células tumorales viables
2. El portaobjetos de Negative Reagent Control es aceptable
3. La morfología es aceptable
4. El fondo es aceptable
5. Los controles positivos internos presentan tinción nuclear inequívoca
No evaluable (si se cumple un solo criterio
de esta sección, se deberá repetir la
tinción del portaobjetos del caso no apto,
según corresponda)
1. H y E contiene <50 células tumorales viables
2. El portaobjetos de Negative Reagent Control es inaceptable
3. La morfología es inaceptable
4. El fondo es inaceptable
5. Los controles positivos internos no presentan tinción nuclear inequívoca
6. La interpretación no es posible debido a la pérdida de tejido, a la ausencia
de tejido tumoral, la presencia de artefactos y/o artefactos de borde
Tabla2: Criterios para definir la posibilidad o la imposibilidad de evaluación
VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial 5
El VENTANA MMR RxDx Panel está formado por cuatro ensayos:
VENTANA anti-MLH1 (M1) Mouse Monoclonal Primary Antibody,
VENTANA anti-PMS2 (A16-4) Mouse Monoclonal Primary
Antibody, VENTANA anti-MSH2 (G219-1129) Mouse Monoclonal
Primary Antibody y VENTANA anti-MSH6 (SP93) Rabbit
Monoclonal Primary Antibody. Es indispensable una sección
de tejido en serie de la muestra de la prueba para la tinción
con cada uno de los anticuerpos; son necesarias secciones de
tejido en serie adicionales de la muestra de la prueba para la
tinción con hematoxilina y eosina (H y E) y con el anticuerpo
NRC correspondiente a las especies del anticuerpo respectivo
del VENTANA MMR RxDx Panel (Negative Control (Monoclonal)
(mNRC) o Rabbit Monoclonal Negative Control Ig (rNRC)).
Las células neoplásicas teñidas con el VENTANA MMR RxDx
Panel se evalúan para detectar la presencia o ausencia de señal
de DAB. El portaobjetos con tinción de NRC compatible sirve para
evaluar la tinción de fondo no específica y el grado de tinción de
fondo que se sabe que se produce debido a elementos tisulares
específicos (consulte las imágenes de casos competentes y
deficientes).
Si la evaluación con H y E indica que la muestra del paciente no
es adecuada (si se presentan, por ejemplo, menos de 50 células
tumorales viables), es necesario obtener una nueva muestra.
La repetición de la tinción con una muestra de un ensayo MMR
RxDx concreto del panel (por ejemplo, VENTANA anti-MLH1 (M1)
Mouse Monoclonal Primary Antibody) se debe llevar a cabo en
portaobjetos sin teñir si (1) el portaobjetos del caso teñido con
el NRC que corresponde a ese ensayo no presenta una tinción
aceptable o (2) si el portaobjetos del caso teñido con ese ensayo
concreto MMR RxDx (por ejemplo, VENTANA anti-MLH1 (M1)
Mouse Monoclonal Primary Antibody) no se puede evaluar. Si
no es posible interpretar cualquiera de los portaobjetos por la
falta de tinción en las células de control positivo interno, por la
presencia de artefactos, por efectos en el borde, necrosis, por falta
de tejido o por cualquier otro motivo, el portaobjetos no se podrá
evaluar. Si la tinción de control es aceptable y los portaobjetos con
tinción del VENTANA MMR RxDx Panel se pueden evaluar, esta
evaluación debe llevarla a cabo un anatomopatólogo cualificado
tal y como se describe en el Algoritmo de puntuación.
NOTA: OptiView DAB IHC Detection Kit y OptiView Amplification
Kit son los únicos reactivos de detección que se recomiendan
para el uso con el VENTANA MMR RxDx Panel.
Las interpretaciones de la expresión de la proteína y del estado
de MMR con el VENTANA MMR RxDx Panel se recogen en
las Tablas3 y 4 que aparecen a continuación. En la sección
Imágenes de referencia se comentan casos representativos.
Evaluación con el VENTANA MMR RxDx Panel:
Algoritmo de puntuación
Tabla4: Interpretación del estado MMR con el VENTANA MMR RxDx Panel
Competente Deficiente
Todas las proteínas del panel (MLH1, PMS2, MSH2 y
MSH6) presentan la expresión intacta
Al menos una de las proteínas del panel (MLH1, PMS2, MSH2 o
MSH6) presentan pérdida de expresión
Tabla3: Interpretación de la expresión de la proteína con el VENTANA MMR RxDx Panel
Expresión de la proteína Intacta Expresión de la proteína Perdida
Tinción nuclear inequívoca en las células tumorales
viables en presencia de controles positivos internos
aceptables (como la tinción nuclear en linfocitos,
fibroblastos y epitelio normal en las zonas cercanas al
tumor)
Pérdida de tinción nuclear inequívoca o tinción nuclear débil
focal equívoca en las células tumorales viables en presencia
de controles positivos internos aceptables. La tinción nuclear
puntuada se considera negativa
6 VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial
Carcinoma endometrial: diagnóstico clínico competente
Estado Intacto de MSH2: tinción
nuclear fuerte en presencia de controles
positivos internos aceptables
Estado Intacto de PMS2: tinción nuclear
fuerte en presencia de controles positivos
internos aceptables
Estado Intacto de MLH1: tinción nuclear
fuerte en presencia de controles positivos
internos aceptables
Carcinoma endometrial: diagnóstico clínico deficiente
Estado de Pérdida de MLH1: ausencia
de tinción nuclear en presencia de
controles positivos internos aceptables
Estado de Pérdida de MSH6: ausencia
de tinción nuclear en presencia de
controles positivos internos aceptables
Estado de Pérdida de MSH2: ausencia
de tinción nuclear en presencia de
controles positivos internos aceptables
MLH1 20x MSH6 20x MSH2 20x
MSH2 20x
PMS2 20x
MLH1 20x
Núcleos
positivos
en MSH2
Núcleos
positivos
en PMS2
Núcleos
positivos
en MLH1
VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial 7
Controles
Al teñir los elementos normales del tejido, como los linfocitos,
los fibroblastos o el epitelio normal, con el VENTANA MMR RxDx
Panel, se observa una tinción nuclear de proteínas MMR en las
zonas cercanas al tumor. Estos elementos del tejido sirven como
controles positivos internos y deben ser aceptables para evaluar
el portaobjetos teñido con cada ensayo del panel. Los controles
internos se deben evaluar en cada ensayo y es necesario que
cumplan los criterios de tinción para la interpretación del estado
MMR del panel. Si hay ausencia de tinción nuclear inequívoca
en los linfocitos, los fibroblastos o el epitelio normal que se
encuentran cerca del tumor, el portaobjetos teñido con el ensayo
se deberá considerar «no evaluable».
En la Tabla5 se describen los criterios que debe cumplir la tinción
de control interna para ser aceptable.
Evaluable No evaluable
Presencia de tinción nuclear inequívoca en elementos
normales del tejido (como linfocitos, fibroblastos y epitelio
normal) en las zonas cercanas al tumor
Ausencia de tinción nuclear inequívoca en elementos normales
del tejido (como linfocitos, fibroblastos y epitelio normal) en las
zonas cercanas al tumor
Tabla5: criterios de la tinción de control interna
Caso 1 de control positivo interno: el carcinoma endometrial no presenta tinción de control interno en las zonas cercanas a las
células tumorales y, por tanto, el carcinoma no se puede evaluar. El Negative Reagent Control aceptable que se ilustra es NRC de ratón
(mNRC).
Controles positivos internos
A continuación se muestras las imágenes representativas del control interno del VENTANA MMR RxDx Panel.
8 VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial
H&E 40x mNRC 40x MLH1 40x
Caso 2 de control positivo interno: se observa tinción fuerte de la célula de control interno en las zonas cercanas al carcinoma
endometrial de un caso con estado de Pérdida de MLH1 y de un caso con estado Intacto de MSH2. El Negative Reagent Control
aceptable es NRC de ratón (mNRC).
MLH1 20x
Tinción de la célula de control interno Tinción de la célula de control interno
VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial 9
H&E 20x mNRC 20x
MSH2 20x
Flujo de trabajo de muestras
Para llevar a cabo las pruebas con el VENTANA MMR RxDx Panel
es necesario contar con secciones de tejido en serie de cada
muestra de la prueba. Una sección de cada se necesitará para la
tinción con cada uno de los cuatro ensayos: VENTANA anti-MLH1
(M1) Mouse Monoclonal Primary Antibody, VENTANA anti-
PMS2 (A16-4) Mouse Monoclonal Primary Antibody, VENTANA
anti-MSH2 (G219-1129) Mouse Monoclonal Primary Antibody,
y VENTANA anti-MSH6 (SP93) Rabbit Monoclonal Primary
Antibody. Además, se debe contar con secciones de cada muestra
de la prueba para la tinción con H y E y con el anticuerpo NRC
que corresponde a las especies del respectivo anticuerpo del
VENTANA MMR RxDx Panel (mNRC o rNRC).
Si la evaluación con H y E indica que la muestra del paciente no
es adecuada (si se presentan, por ejemplo, menos de 50 células
tumorales viables), es necesario obtener una nueva muestra.
La repetición de la tinción con una muestra de un ensayo MMR
RxDx concreto del panel (por ejemplo, VENTANA anti-MLH1 (M1)
Mouse Monoclonal Primary Antibody) se debe llevar a cabo en
portaobjetos sin teñir si (1) el portaobjetos del caso teñido con
el control de reactivo negativo correspondiente no presenta una
tinción aceptable o (2) si el portaobjetos del caso teñido con ese
ensayo concreto MMR RxDx (por ejemplo, VENTANA anti-MLH1
(M1) Mouse Monoclonal Primary Antibody) no se puede evaluar.
Si no es posible interpretar cualquiera de los portaobjetos por la
falta de tinción en las células de control positivo interno, por la
presencia de artefactos, por efectos en el borde, necrosis, falta
de tejido o por cualquier otro motivo, el portaobjetos no se podrá
evaluar. Si los controles son aceptables y los portaobjetos con
tinción del VENTANA MMR RxDx Panel se pueden evaluar, esta
evaluación debe llevarla a cabo un anatomopatólogo cualificado
tal y como se describe en el Algoritmo de puntuación.
NOTA: OptiView DAB IHC Detection Kit y OptiView Amplification
Kit son los únicos reactivos de detección que se recomiendan
para el uso con el VENTANA MMR RxDx Panel.
10 VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial
Flujo de muestra
VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial 11
Se colocan secciones de 4m
de grosor en portaobjetos con
carga positiva. (se requieren 6 o 7
secciones en serie)
Repita la tinción con una
nueva muestra del paciente*
No Sí
¿El portaobjetos
con H y E es
aceptable (≥50
células viables)?
Una sección se tiñe con cada ensayo del VENTANA MMR RxDx Panel. Además,
cada condición del ensayo se debe teñir con el control de reactivo negativo que
corresponda a la especie, el Negative Control (Monoclonal) (mNRC), o Rabbit
Monoclonal Negative Control Ig (rNRC), según corresponda, en la misma sesión
del instrumento.
El resultado de MMR (MLH1, PMS2, MSH2, MSH6) debe
establecerlo un anatomopatólogo cualificado en función del
algoritmo de puntuación del VENTANA MMR RxDx Panel.
No
No
No
Sí
Sí
Sí
¿Es aceptable el
portaobjetos de la
muestra teñida con
control de reactivo
negativo?
¿Cada uno de
los portaobjetos
de la muestra con
tinción presenta
controles internos
aceptables?
¿Los portaobjetos de
muestra con tinción
del VENTANA MMR
RxDx Panel son
aceptables?
Tumor con H y E
Tumor con NRC
* La repetición se puede llevar a cabo con el mismo bloque
del paciente o con otro bloque de tejido del mismo paciente,
según corresponda.
(Todas las imágenes de tumores tienen una aumento de 20x)
Control interno
Tumor con IHC
La muestra de tejido tumoral se
fija en formol tamponado neutro
al 10% durante un periodo de
entre 6 y 72horas.
Una sección se tiñe con H y E.
Repetir la sesión de tinción
Repetir la tinción del caso*
Repetir la tinción del caso*
12 VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial
Imágenes de referencia
Caso competente 1: estado Intacto de MLH1, PMS2, MSH2 y MSH6 en carcinoma endometrial que presenta tinción nuclear
fuerte en células tumorales en presencia de los controles internos con tinción adecuada. Los Negative Reagent Controls aceptables que
se ilustran son NRC de ratón (mNRC) y NRC de conejo (rNRC).
Casos competentes
mNRC 20x
rNRC 20x
MLH1 20x PMS2 20x
MSH2 20x MSH6 20x
H&E 20x
VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial 13
Caso competente 2: estado Intacto de MLH1, PMS2, MSH2 y MSH6 en carcinoma endometrial que presenta tinción nuclear
fuerte en células tumorales en presencia de los controles internos con tinción adecuada. Los Negative Reagent Controls aceptables son
NRC de ratón (mNRC) y NRC de conejo (rNRC).
H&E 20x
mNRC 20x rNRC 20x
MLH1 20x PMS2 20x
MSH2 20x MSH6 20x
14 VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial
Caso deficiente 1: estado de Pérdida de MLH1 y PMS2 en carcinoma endometrial que no presenta tinción nuclear en células tumorales
en presencia de los controles internos con tinción adecuada. MSH2 y MSH6 presentan estado Intacto. La tinción citoplasmática no debe
tenerse en cuenta en la interpretación del estado. Los Negative Reagent Controls aceptables son NRC de ratón (mNRC) y NRC de conejo
(rNRC).
Casos deficientes
H&E 20x
mNRC 20x rNRC 20x
MLH1 20x PMS2 20x
MSH2 20x MSH6 20x
VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial 15
Caso deficiente 2: estado de Pérdida de MLH1 y PMS2 en carcinoma endometrial que no presenta tinción nuclear en células tumorales
en presencia de los controles internos con tinción adecuada. MSH2 y MSH6 presentan estado Intacto. La tinción citoplasmática no debe
tenerse en cuenta en la interpretación del estado. Los Negative Reagent Controls aceptables son NRC de ratón (mNRC) y NRC de conejo
(rNRC).
H&E 20x
mNRC 20x rNRC 20x
MLH1 20x PMS2 20x
MSH2 20x MSH6 20x
16 VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial
Caso deficiente 3: estado de Pérdida de MSH2 y MSH6 en carcinoma endometrial que no presenta tinción nuclear en células tumorales
en presencia de los controles internos con tinción adecuada. MLH1 y PMS2 presentan estado Intacto. La tinción citoplasmática no debe
tenerse en cuenta en la interpretación del estado. Los Negative Reagent Controls aceptables son NRC de ratón (mNRC) y NRC de conejo
(rNRC).
H&E 20x
mNRC 20x rNRC 20x
MLH1 20x PMS2 20x
MSH2 20x MSH6 20x
VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial 17
Caso deficiente 4: estado de Pérdida de MSH6 en carcinoma endometrial que no presenta tinción nuclear en células tumorales
en presencia de los controles internos con tinción adecuada. MLH1, PMS2 y MSH2 presentan estado Intacto. PMS2 presenta una
tinción heterogénea. La tinción citoplasmática no debe tenerse en cuenta en la interpretación del estado. Los Negative Reagent Controls
aceptables son NRC de ratón (mNRC) y NRC de conejo (rNRC).
H&E 20x
mNRC 20x rNRC 20x
MLH1 20x PMS2 20x
MSH2 20x MSH6 20x
18 VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial
Casos difíciles
Aunque la amplia mayoría de casos teñidos con el VENTANA
MMR RxDx Panel son claramente competente o deficiente en
sus resultados de tinción, se ha observado que unos pocos casos
representan mayor complicación para su interpretación.
Índice de casos difíciles:
• Caso difícil 1: tinción de fondo no específica por
enmascaramiento de DAB
• Casos difíciles 2: tinción de fondo no específica por tinción
citoplasmática
• Caso difícil 3: tinción focal
• Caso difícil 4: tinción puntuada
• Caso difícil 5: moteado
• Caso difícil 6: artefacto con gradiente de fijación
• Caso difícil 7: tinción heterogénea
• Caso difícil 8: sedimentación de pigmento
• Caso difícil 9: tinción membranosa
Algunos casos pueden resultar especialmente complejos debido a
los siguientes problemas:
• Tinción de fondo no específica: algunas muestras pueden
presentar una tinción de fondo no específica por motivos que
todavía no se conocen en profundidad. Por esta razón, en la
evaluación del portaobjetos con MMR RxDx debe incluirse
una comparación del portaobjetos con el portaobjetos con
control de reactivo negativo a fin de determinar el nivel de
tinción de fondo no específica. La tinción citoplasmática, de
presentarse, no debe tenerse en cuenta en la interpretación
con MMR RxDx.
• Tinción focal: algunas muestras pueden presentar tinción
focal en las células tumorales y la intensidad de la tinción
puede variar entre débil y fuerte. En función del algoritmo de
puntuación MMR RxDx, se debe asignar un estado clínico
de Pérdida a la tinción nuclear focal, débil y equívoca en
las células tumorales viables en presencia de los controles
positivos internos. Por otro lado, se debe asignar un estado
clínico Intacto a la tinción nuclear focal, fuerte e inequívoca
en las células tumorales viables en presencia de los controles
positivos internos.
• Tinción puntuada: algunas muestras pueden presentar una
discreta tinción puntuada en algunos núcleos del tumor; la
intensidad de la tinción puede variar entre débil y fuerte. Este
patrón de tinción no debe tenerse en cuenta y, en caso de que
este sea el único tipo de patrón de tinción presente en el caso,
se debería asignar un estado clínico de Pérdida.
• Moteado: a diferencia de la tinción puntuada, el moteado tiene
un aspecto más fino y granular y puede ser focal o presentarse
en varias células tumorales. Este patrón de tinción, si se
observa en los núcleos de las células tumorales, no debe
tenerse en cuenta y el portaobjetos se debería asignar un
estado clínico de Pérdida.
• Artefacto de tejido o de tinción: los artefactos histológicos
que tiene su origen en el procesamiento de las muestras y
en los procedimientos de microtomía pueden dificultar la
determinación del Estado clínico con MMR RxDx. Entre estos
artefactos figuran los artefactos de cauterización de tejido,
gradientes de fijación y efectos del borde, enmascaramiento
de DAB, sedimentación de pigmento hemosiderina, burbujeo
en el núcleo, ausencia de tinción en algunas regiones del tejido
(tinción heterogénea), tinción membranosa y/o citoplasmática,
rotura o plegado del tejido y pérdida de la sección de tejido. En
algunos casos, es posible que sea necesario repetir la tinción
de nuevas secciones o adquirir otra muestra.
En las siguientes páginas se muestran algunos ejemplos de casos
difíciles.
VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial 19
Caso difícil 1: estado de Pérdida de MLH1 y PMS2 de carcinoma endometrial que no presenta tinción nuclear en presencia de los controles
internos con tinción adecuada y con tinción de fondo no específica coherente con un enmascaramiento focal de DAB en el estroma (flechas azules).
El estado Intacto de MSH2 y MSH6 presenta una tinción nuclear fuerte y tinción de fondo no específica en la presencia de los controles internos
con tinción adecuada. La tinción citoplasmática de fondo se puede observar en las células tumorales y es necesario no tenerla en cuenta durante
la interpretación del estado. El enmascaramiento focal de DAB también se observa en el portaobjetos MSH2 (flecha azul). Los Negative Reagent
Controls aceptables son NRC de ratón (mNRC) y NRC de conejo (rNRC).
H&E 4x
mNRC 4x rNRC 4x
MLH1 4x PMS2 4x
MSH2 4x MSH6 4x
Tinción de fondo no específica por enmascaramiento de DAB
20 VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial
Caso difícil 2: estado Intacto de MSH2 y MSH6 en carcinoma endometrial que presenta tinción nuclear fuerte en células tumorales en
presencia de los controles internos con tinción adecuada. MSH2 presenta tinción citoplasmática y moteado focal citoplasmático en las
células tumorales (flechas azules), que no se tiene en cuenta en la interpretación del estado. Estado de Pérdida de MLH1 y PMS2 sin
tinción nuclear en presencia de los controles internos con tinción adecuada. PMS2 presenta tinción débil y focal del control interno pero
que se puede interpretar. Los Negative Reagent Controls aceptables son NRC de ratón (mNRC) y NRC de conejo (rNRC).
H&E 40x
mNRC 40x rNRC 40x
MLH1 40x PMS2 40x
MSH2 40x MSH6 40x
Tinción de fondo no específica por tinción citoplasmática
VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial 21
Caso difícil 3: estado Intacto de MLH1, PMS2, MSH2 y MSH6 en carcinoma endometrial. MSH6 presenta una tinción nuclear
focal inequívoca en las células tumorales en presencia de células de control positivo interno aceptables y, por tanto, se interpreta su
estado como Intacto. PMS2 presenta una intensidad de tinción nuclear heterogénea en presencia de las células de control positivo
interno con tinción adecuada. Los Negative Reagent Controls aceptables son NRC de ratón (mNRC) y NRC de conejo (rNRC).
H&E 20x
mNRC 20x rNRC 20x
MLH1 20x
PMS2 20x
MSH2 20x MSH6 20x
Tinción focal
Ausencia
de tinción
de células
tumorales
Tinción focal
de células
tumorales
22 VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial
Tinción puntuada
Caso difícil 4: estado de Pérdida de MLH1 en carcinoma endometrial que presenta tinción puntuada fuerte en los núcleos de varias
células tumorales. No obstante, no existen células en el tumor que presenten tinción nuclear inequívoca en presencia de los controles
positivos internos con tinción adecuada. El Negative Reagent Control aceptable es NRC de ratón (mNRC).
H&E 20x mNRC 20x
MLH1 20x MLH1 40x
Tinción puntuada
VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial 23
Caso difícil 5: estado de Pérdida de MLH1 y PMS2 en carcinoma endometrial que no presenta tinción nuclear en células tumorales
en presencia de los controles internos con tinción adecuada. PMS2 presenta moteado citoplasmático. PMS2 y MSH2 presentan
tinción citoplasmática débil. La tinción citoplasmática y el moteado citoplasmático no deben tenerse en cuenta en la interpretación del
estado. Estado Intacto de MSH2 y MSH6 que presentan tinción nuclear inequívoca en presencia de los controles internos con tinción
adecuada. Los Negative Reagent Controls aceptables son NRC de ratón (mNRC) y NRC de conejo (rNRC).
H&E 40x
mNRC 40x rNRC 40x
MLH1 40x
PMS2 40x
MSH2 40x MSH6 40x
Moteado
Moteado
citoplasmático
24 VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial
Caso difícil 6: se puede observar este artefacto con gradiente de fijación en células tumorales y células de control positivo interno
en este carcinoma endometrial con estado Intacto de MLH1, PMS2 y estado de Pérdida de MSH2, MSH6. La interpretación de
estos marcadores únicamente debe llevarse a cabo en presencia de los controles positivos internos aceptables. Los Negative Reagent
Controls aceptables son NRC de ratón (mNRC) y NRC de conejo (rNRC).
H&E 4x
mNRC 4x rNRC 4x
MLH1 4x PMS2 4x
MSH2 4x MSH6 4x
Artefacto con gradiente de fijación
VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial 25
Caso difícil 7: estado Intacto de MLH1, PMS2, MSH2 en carcinoma endometrial que presenta una intensidad heterogénea de
tinción nuclear en células tumorales en presencia de los controles internos con tinción adecuada. El estado de Pérdida de MSH6
no revela tinción nuclear cerca de los controles internos con tinción adecuada. Los Negative Reagent Controls aceptables son NRC de
ratón (mNRC) y NRC de conejo (rNRC).
H&E 10x
mNRC 10x rNRC 10x
MLH1 10x PMS2 10x
MSH2 10x MSH6 10x
Tinción heterogénea
26 VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial
Sedimentación de pigmento
Caso difícil 8: estado Intacto de MSH6 en carcinoma endometrial que presenta tinción nuclear fuerte en el tumor en presencia de
los controles positivos internos con tinción débil pero adecuada. La sedimentación de pigmento hemosiderina puede observarse junto a
las células tumorales y los controles internos y no se debe tener en cuenta a la hora de interpretar el estado (flechas azules). El Negative
Reagent Control aceptable es NRC de conejo (rNRC).
H&E 20x rNRC 20x
MSH6 20x MSH6 40x
VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial 27
Tinción membranosa
Caso difícil 9: MSH2 no evaluable en carcinoma endometrial que presenta únicamente tinción membranosa (flechas azules) sin
tinción adecuada de los controles internos. El Negative Reagent Control aceptable es NRC de ratón (mNRC).
H&E 20x mNRC 20x
MSH2 20x MSH2 40x
Tiempo
Fijador
(Horas)
NBF al 10% Formol-zinc** Z-5** PREFER** AFA** Alcohol al 95%**
1*
6
12
24
72
Impacto de las condiciones previas al análisis en el VENTANA MMR RxDx Panel
Tabla5: Tinción de tejido de amígdala benigno humano con VENTANA anti-MLH1(M1) Mouse Monoclonal Primary
Antibody con diferentes fijadores y tiempos de fijación
NOTAS
Los siguientes fijadores y tiempos de fijación no se recomiendan:
* No se recomienda una fijación inferior a 6horas.
** Las muestras fijadas con fijadores como el formol-zinc, Z-5 (Anatech Ltd), PREFER, AFA y alcohol al 95% presentan tinción débil o
variable; no se recomienda la fijación con formol-zinc, Z-5, PREFER, AFA ni alcohol al 95%.
(todas las imágenes tienen un aumento de 20x)
Condiciones de fijación aceptables para lograr resultados óptimos de tinción
Ventana recomienda:
• un procesamiento del tejido inmediatamente tras la escisión (tiempo de isquemia ≤6horas)
• una fijación en NBF al 10% durante un periodo de entre 6 y 72horas. Consulte los fijadores y los tiempos de fijación aceptables en los recuadros
azules (Tablas5 a 8).
28 VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial
Tiempo
Fijador
(Horas)
NBF al 10% Formol-zinc** Z-5** PREFER** AFA** Alcohol al 95%**
1*
6
12
24
72
Tabla6: Tinción de tejido de amígdala benigno humano con VENTANA anti-PMS2(A16-4) Mouse Monoclonal Primary
Antibody con diferentes fijadores y tiempos de fijación
(todas las imágenes tienen un aumento de 20x)
NOTAS
Los siguientes fijadores y tiempos de fijación no se recomiendan:
* No se recomienda una fijación inferior a 6horas.
** Las muestras fijadas con fijadores como el formol-zinc, Z-5 (Anatech Ltd), PREFER, AFA y alcohol al 95% presentan tinción débil o
variable; no se recomienda la fijación con formol-zinc, Z-5, PREFER, AFA ni alcohol al 95%.
VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial 29
Tiempo
Fijador
(Horas)
NBF al 10% Formol-zinc** Z-5** PREFER** AFA** Alcohol al 95%**
1*
6
12
24
72
Tabla7: Tinción de tejido de amígdala benigno humano con VENTANA anti-MSH2(G219-1129) Mouse Monoclonal Primary
Antibody con diferentes fijadores y tiempos de fijación
(todas las imágenes tienen un aumento de 20x)
NOTAS
Los siguientes fijadores y tiempos de fijación no se recomiendan:
* No se recomienda una fijación inferior a 6horas.
** Las muestras fijadas con fijadores como el formol-zinc, Z-5 (Anatech Ltd), PREFER, AFA y alcohol al 95% presentan tinción débil o
variable; no se recomienda la fijación con formol-zinc, Z-5, PREFER, AFA ni alcohol al 95%.
30 VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial
Tiempo
Fijador
(Horas)
NBF al 10% Formol-zinc** Z-5** PREFER** AFA** Alcohol al 95%**
1*
6
12
24
72
Tabla8: Tinción de tejido de amígdala benigno humano con VENTANA anti-MSH6(SP93) Rabbit Monoclonal Primary
Antibody con diferentes fijadores y tiempos de fijación
(todas las imágenes tienen un aumento de 20x)
NOTAS
Los siguientes fijadores y tiempos de fijación no se recomiendan:
* No se recomienda una fijación inferior a 6horas.
** Las muestras fijadas con fijadores como el formol-zinc, Z-5 (Anatech Ltd), PREFER, AFA y alcohol al 95% presentan tinción débil o
variable; no se recomienda la fijación con formol-zinc, Z-5, PREFER, AFA ni alcohol al 95%.
VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial 31
32 VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial
Estabilidad de los portaobjetos con cortes
Ventana ha determinado que el VENTANA MMR RxDx Panel no
debe llevarse a cabo en portaobjetos con cortes que se hayan
almacenado durante más de 45días. Los portaobjetos deberían
teñirse inmediatamente, dado que la antigenicidad de las
secciones de los cortes de tejido puede disminuir con el tiempo
y es posible que se dañen una vez transcurridos 45días desde el
corte del bloque de tejidos FFPE.
Grosor del tejido
Se deben realizar cortes de 4m de grosor y colocarse en
portaobjetos de vidrio cargados positivamente. No se ha validado
ningún otro grosor.
VENTANA MMR RxDx Panel para el carcinoma endometrial 33
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Bibliografía
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