Thermo Fisher Scientific VetMAX PRRSV EU & NA 3.0 Kit Instrucciones de operación
- Tipo
- Instrucciones de operación
Solo para uso veterinario. Solo para uso in vitro.
INSTRUCCIONES DE USO
VetMAX™ PRRSV EU & NA 3.0 Kit
Detección de RT-PCR en tiempo real del virus responsable del síndrome reproductivo y respiratorio porcino
Número de catálogo A57016
N.º de ref. del doc. 100119741 Publicación n.º MAN0028686 Rev. A.0
Tecnología Especie Matrices de
muestras
Tipo de
prueba
RT-PCR en tiempo
real (ARN)
•
Ensayo triple
•
IPC exógeno
Porcina
•
Suero
•
Sangre total
•
Semen
•
Tejido
•
Fluido oral
•
Fluido de
procesamiento
Individual o
mezclado[1]
[1] Mezcle hasta cinco muestras para matrices de muestras de suero, sangre total
o semen.
¡ADVERTENCIA! Lea las hojas de datos de seguridad (HDS)
y siga las instrucciones de manipulación. Lleve el equipo de
protección individual (EPI) adecuado (gafas, ropa y
guantes). Las hojas de datos de seguridad (HDS) se
encuentran disponibles en thermofisher.com/support.
Descripción del producto
El Applied Biosystems™ VetMAX™ PRRSV EU & NA 3.0 Kit (N.º de
Cat. A57016) permite la detección de RT-PCR en tiempo real del
virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV). El kit
tiene un diseño actualizado con la capacidad de detectar cepas del
virus PRRS en circulación. El kit proporciona los ensayos y reactivos
para la detección de RT-PCR en tiempo real monopocillo de dianas
de PRRSV EU, PRRSV NA y control positivo interno (IPC) mediante
química de la sonda de hidrólisis fluorescente.
El kit se ha validado para usarse en ARN extraído de suero,
sangre total, semen, tejido, fluido oral y fluido de procesamiento.
El informe de validación está disponible previa solicitud a
nuestro representante de ventas o especialista técnico.
El PRRSV causa pérdidas significativas en la industria porcina
debido a trastornos reproductivos, enfermedades respiratorias y
retrasos del crecimiento. El ARN del PRRSV se puede detectar
en la sangre y en el semen 24-48 horas después de la infección.
La RT-PCR en tiempo real es el método más sensible para la
detección del PRRSV y es una potente herramienta para la
gestión sanitaria de las piaras.
El kit contiene los siguientes ensayos y reactivos.
• 1 – Secuencias PRRSV 3.0: Contiene primers y sondas que
están optimizadas para la detección triple por RT-PCR en
tiempo real de dianas de PRRSV EU, PRRSV NA e IPC.
• 2 – Master Mix PRRSV 3.0: Contiene enzimas y tampones
que son necesarios para la reacción triple de RT-PCR en
tiempo real.
• 4a – EPC PRRSV EU/NA 3.0: Plantilla de ARN con secuencias
de diana de PRRSV EU, PRRSV NA, y Xeno™ (IPC). Sirve como
control positivo externo de los componentes de la RT‑PCR en
tiempo real y se utiliza para definir los criterios de validación
para los resultados de la prueba.
• 5 – IPC PRRSV 3.0: Se añade a cada muestra y a las
muestras de control de extracción durante la extracción del
ARN. Sirve como control de extracción para el
procedimiento de extracción del ARN y se utiliza para vigilar
la presencia de inhibidores de la PCR.
Componentes y conservación
Componente
Cantidad
[1]
Conservación
1 – Secuencias PRRSV 3.0
220 µl
– 30 °C a – 10 °C
2 – Master Mix PRRSV 3.0
1100 µl
4a – EPC PRRSV EU/NA 3.0
2 × 80 µl
5 – IPC PRRSV 3.0
215 µl
[1] Los volúmenes son suficientes para 100 reacciones de RT-PCR en
tiempo real (12 µl).
Materiales necesarios no suministrados
A menos que se indique lo contrario, todos los materiales están
disponibles en thermofisher.com. “MLS” indica que el material
está disponible en fisherscientific.com u otro proveedor general
de productos de laboratorio.
Artículo
Fuente
Instrumento
de PCR en tiempo real, uno de los siguientes:
Applied Biosystems™ 7500 Real-Time PCR System
• Precision Plate Holder para placas (A24820)
• Precision Plate Holder para tubos y tiras de
0,2
ml (4367033)
Póngase en
contacto con su
oficina de ventas
local.
Applied Biosystems
™
7500 Fast Real-Time PCR
System
• Precision Plate Holder para placas (4359652)
• 7500 Fast Precision Plate Holder
para tiras de
tubos de 0,1 ml (A29252)
Applied Biosystems™ QuantStudio™ 5 Real-Time
PCR System
Equipo
Pipetas ajustables
MLS
Microcentrífuga
MLS
Centrífuga con adaptador de placas
MLS
Mezclador de laboratorio (mezclador vórtex o equivalente)
MLS
2
Instrucciones de uso de VetMAX™ PRRSV EU & NA 3.0 Kit
Artículo
Fuente
Equipo
Dos cubiteras o racks refrigerados:
• Uno para la zona de preparación de la PCR en la que
se prepara la master mix para la PCR
• Uno para la zona donde se preparan las muestras
de ARN y los controles
MLS
Tubos, placas y otros consumibles
Placas de reacción óptica y tapas adhesivas
thermofisher.com/pl
astics
Puntas de pipeta
thermofisher.com/pi
pettetips
Guantes desechables
MLS
Reactivos
Agua sin nucleasas (no tratada con DEPC)
AM9939
Tampón TE 1X
MLS
Directrices de procedimiento
• Incluya las siguientes reacciones de control para cada
carrera de RT-PCR en tiempo real.
–
Control positivo: utilice 4a – EPC PRRSV EU/NA 3.0.
–
Control de extracción: utilice muestras de control que se
hayan preparado en el mismo procedimiento de
extracción de ARN que las muestras de la prueba.
–
Control sin plantilla (NTC): utilice agua sin nucleasas.
• Siga las buenas prácticas de laboratorio para evitar falsos
positivos y la contaminación de muestras de la prueba con
productos de PCR (consulte “Buenas prácticas de
laboratorio para PCR y RT-PCR” en la página 4).
Directrices para el ARN de partida
Paso, proceso o parámetro
Recomendación
Método de extracción de ARN
Applied Biosystems™ MagMAX™ CORE
Nucleic Acid Purification Kit (N.º de Cat.
A32700)
Cambio del método de extracción
de ARN para muestras de la
prueba y muestras de control
Añada 2 µl de 5 – IPC PRRSV 3.0 a cada
muestra y a las muestras de control de
extracción durante la extracción del ARN.
Preparación de muestras de
control para su uso en las PCR de
control de extracción
Prepare, como mínimo, una muestra de
control por duplicado, usando agua sin
nucleasas (no tratada con DEPC) como
material de partida.
Procese la muestra de control al mismo
tiempo en el mismo procedimiento de
extracción de ARN que se utiliza para las
muestras de la prueba.
Antes de empezar
1. Descongele los reactivos y las muestras.
a. Descongele 1 – Secuencias PRRSV 3.0 y 2 – Master Mix
PRRSV 3.0 en una cubitera o rack refrigerado.
b. Descongele 4a – EPC PRRSV EU/NA 3.0, 5 IPC y las
muestras de ARN en una cubitera o rack refrigerado
aparte.
2. Agite cada tubo en un vórtex para mezclarlo por completo y,
a continuación, centrifugue brevemente para recoger los
contenidos.
Conserve los reactivos y muestras congeladas a 2-8 °C hasta
su uso.
Prepare la mezcla de reacción de la RT‑PCR
en tiempo real
1. Prepare la mezcla de reacción de la RT‑PCR en una cubitera
o un rack refrigerado siguiendo la siguiente tabla.
Componente
Volumen por reacción[1]
Para 1
muestra
Para N
muestras
1 – Secuencias PRRSV 3.0
2 µl
N × 2 µl
2 – Master Mix PRRSV 3.0
10 µl
N × 10 µl
Mezcla de reacción de
RT‑PCR total 12 µl N × 12 µl
[1] Prepare suficiente volumen para permitir una reacción adicional con
respecto al número total de reacciones que se llevarán a cabo durante el
análisis (muestras y controles). No mezcle nunca componentes de lotes
de kits diferentes (vea el certificado de análisis).
2. Agite en un vórtex para mezclar la mezcla de reacción de
RT‑PCR por completo y, a continuación, centrifugue
brevemente para recoger los contenidos.
¡IMPORTANTE! La mezcla de reacción de RT‑PCR debe
estar mezclada por completo.
Preparación de las reacciones de la RT‑PCR
1. Dispense 12 µl de la mezcla de reacción de RT‑PCR en el
número necesario de pocillos o tubos.
2. Añada el componente indicado a cada tipo de reacción.
Tipo de reacción Componente
Volumen
por
reacción
Muestra a analizar
ARN de la muestra
8,0 µl
Control positivo
4a – EPC PRRSV EU/NA 3.0
8,0 µl
Control de
extracción Muestra de control 8,0 µl
Control sin plantilla
(NTC) Agua libre de nucleasas 8,0 µl
3. Selle cada placa o tubo, mezcle y, a continuación,
centrifugue brevemente para recoger los contenidos.
Preparar e iniciar el instrumento de PCR en
tiempo real
1. Siguiendo las instrucciones del fabricante, configure el
proceso de RT-PCR en tiempo real utilizando los siguientes
parámetros.
• Volumen de reacción: 20 µl
• Referencia pasiva: Colorante ROX™
(incluido en 2 – Master Mix PRRSV 3.0)
Nota: El colorante ROX™ debe seleccionarse en el
instrumento si puede detectarlo. Pueden usarse
instrumentos de PCR en tiempo real que no detecten el
colorante ROX™ sin que esto afecte a la lectura.
Instrucciones de uso de VetMAX™ PRRSV EU & NA 3.0 Kit
3
• Programa del instrumento de PCR en tiempo real:
–
Modo estándar (7500 Real-Time PCR System,
QuantStudio™ 5 Real-Time PCR System)
Etapa
Repeticiones
Temperatura
Tiempo
1
1
50 °C
5 minutos
2
1
95 °C
10 minutos
3 40
95 °C
15 segundos
60 °C
1 minuto
–
Modo rápido (7500 Fast Real-Time PCR System,
QuantStudio™ 5 Real-Time PCR System)
Etapa
Repeticiones
Temperatura
Tiempo
1
1
50 °C
5 minutos
2
1
95 °C
10 minutos
3 40
95 °C
3 segundos
60 °C
30 segundos
2. Seleccione o cree detectores de colorante y, a continuación,
asígnelos a cada pocillo o tubo.
Diana Reportero Quencher
PRRSV EU Colorante VIC™
Quencher no
fluorescente (NFQ)
PRRSV NA Colorante FAM™
IPC[1] Colorante Cy5™
[1] IPC: 5 – IPC PRRSV 3.0.
3. Ejecute el programa del instrumento de PCR adecuado,
recopilando datos de amplificación en tiempo real durante la
incubación a 60 °C.
Directrices para el análisis de datos
• Siga la guía de usuario del instrumento para analizar los datos brutos.
• Defina los umbrales para cada diana por separado.
• Consulte el certificado de análisis para conocer el lote de fabricación del kit para validar el proceso e interpretar los resultados.
Criterios de validación de la prueba
Consulte los valores CtQC en el certificado de análisis para conocer el lote de fabricación del kit. La validación de la prueba está sujeta a
los siguientes criterios:
Tipo de reacción Diana PRRSV EU
(Colorante VIC™)
Diana PRRSV NA
(Colorante FAM™)
Diana del IPC
(Colorante Cy5™) Interpretación
Amplificación: control
positivo
C
t
= C
tQC
EU de
4a – EPC PRRSV EU/NA 3.0
± 3 Ct
[1]
C
t
= C
tQC
NA de
4a – EPC PRRSV EU/NA 3.0
± 3 Ct
[1]
Ct < 40[2] La PCR se valida.
Control de extracción Ct > 40 Ct > 40 Ct = CtQC 5 – IPC PRRSV 3.0
± 3 Ct
[3]
Se valida la extracción del ARN.
Control sin plantilla Ct > 40 Ct > 40 Ct > 40 Se validan los reactivos de la
PCR.
[1] Consulte la tabla de EPC en el certificado de análisis.
[2] Se espera una señal positiva. El valor Ct de IPC del EPC no se usa para la interpretación de resultados de la muestra.
[3] Consulte la tabla de IPC en el certificado de análisis.
Interpretación de los resultados
Diana PRRSV EU
(Colorante VIC
™
)
Diana PRRSV NA
(Colorante FAM
™
)
Diana del IPC
(Colorante Cy5
™
)
Interpretación
Ct < 40
Ct > 40
Cualquier valor
Se ha detectado PRRSV EU.
C
t
> 40
C
t
< 40
Cualquier valor
Se ha detectado PRRSV NA.
C
t
< 40
C
t
< 40
Cualquier valor
Se han detectado PRRSV EU y NA.
C
t
> 40
C
t
> 40
C
t
≤ C
t
de control de extracción + 3 C
t
[1]
No se han detectado PRRSV EU ni NA.
C
t
> 40
C
t
> 40
C
t
> C
t
de control de extracción + 3 C
t [1]
Resultado no válido.
[1] El Ct del control de extracción debe validarse tal y como se describe en el apartado “Criterios de validación de la prueba” de la página 3.
Repetir el análisis de muestras con resultados no válidos
1. Diluya las muestras de ARN al 1:10 en tampón TE 1X.
2. Repita el procedimiento de RT-PCR en tiempo real con 8 µl de ARN diluido e interprete los resultados como se indica a
continuación.
Resultado
Interpretación
El ARN diluido es positivo para al menos una de las dianas de PRRSV (NA o EU).
El resultado se valida.
El ARN diluido da negativo para las dos dianas de PRRSV (NA y EU) y el resultado del IPC es conforme.
El ARN diluido da negativo para las dos dianas de PRRSV (NA y EU) y el resultado del IPC no es conforme.
El resultado no es válido.
3. Para las muestras diluidas con resultados no válidos, repita el procedimiento de extracción de ARN con una nueva alícuota del lisado
original de la muestra.
thermofisher.com/support | thermofisher.com/askaquestion
thermofisher.com
12 de junio de 2023
Buenas prácticas de laboratorio para
PCR y RT-PCR
• Póngase guantes limpios y una bata de laboratorio limpia.
–
No se ponga los mismos guantes ni la misma bata de
laboratorio que haya utilizado al manipular productos
amplificados o preparar muestras.
• Cámbiese de guantes si sospecha que están contaminados.
• Utilice zonas separadas y equipo y suministros exclusivos para:
–
La preparación de la muestra y la preparación de la reacción.
–
La amplificación y el análisis de los productos.
• No lleve los productos amplificados a la zona de preparación de
la reacción.
• Abra y cierre todos los tubos de muestras con cuidado. Evite
salpicar o rociar las muestras.
• Mantenga las reacciones y los componentes tapados tanto
tiempo como sea posible.
• Utilice una pipeta de desplazamiento de aire positivo o puntas
de pipeta con filtro resistentes a los aerosoles.
• Limpie los bancos del laboratorio y el equipo periódicamente
con una solución de lejía al 10 % o con solución de
descontaminación de ADN.
Asistencia al cliente y soporte técnico
Visite thermofisher.com/support para conocer lo último en
servicio y asistencia.
• Números de teléfono de contacto de todo el mundo
• Información de asistencia del producto
–
Preguntas más frecuentes (FAQ) sobre productos
–
Software, parches y actualizaciones
–
Formación para muchas aplicaciones e
instrumentos
• Pedidos y soporte web
• Documentación del producto
–
Guías de usuario, manuales y protocolos
–
Certificados de análisis
–
Hojas de datos de seguridad (Safety Data Sheets,
SDS; también conocidas como MSDS)
Nota: Para conocer las HDS de los reactivos y
productos químicos de otros fabricantes, póngase
en contacto con el fabricante.
Garantía limitada del producto
Life Technologies Corporation y/o su(s) filial(es) garantizan sus productos tal y como se establece en los términos y condiciones
generales de venta de Life Technologies, que se pueden encontrar en el sitio web www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms-
and-conditions.html. Si tiene alguna duda, póngase en contacto con Life Technologies en www.thermofisher.com/support.
Laboratoire Service International (LSI) | 6 Allée des Ecureuils
– Parc Tertiaire du Bois-Dieu | 69380 Lissieu – Francia
Para ver las descripciones de los símbolos en las etiquetas o la documentación de los productos, diríjase a thermofisher.com/symbols-definition.
Traducido del inglés, del publicación N.º MAN0028563 B.0.
Historial de revisiones: N.º de pub. MAN0028563
Revisión
Fecha
Descripción
B.0 7 de junio de 2023
• Se corrigió el volumen recomendado de 5 – IPC PRRSV 3.0 de 4 µl a 2 µl (ver Directrices para el ARN de partida).
• Se reemplazaron todas las instancias de aislamiento por extracción en el documento.
A.0 16 de enero de 2023 Nuevo documento para VetMAX™ PRRSV EU & NA 3.0 Kit.
La información incluida en esta guía está sujeta a cambios sin previo aviso.
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DOCUMENTO, INCLUYENDO EL USO DEL MISMO.
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los términos y condiciones de todas las licencias de etiquetado de uso limitado aplicables.
©2023 Thermo Fisher Scientific Inc. Todos los derechos reservados. Todas las marcas comerciales son propiedad de Thermo Fisher Scientific y sus subsidiarias salvo que se
especifique lo contrario.
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